JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Микротрубочки, которые являются полимерами тубулина, играют решающую роль в качестве компонента цитоскелета в эукариотических клетках и известны своей динамической нестабильностью. В этом исследовании был разработан метод фракционирования микротрубочек для разделения их на стабильные микротрубочки, лабильные микротрубочки и свободный тубулин для оценки стабильности микротрубочек в различных тканях мышей.

Аннотация

Микротрубочки, состоящие из димеров α/β-тубулина, являются важнейшим компонентом цитоскелета в эукариотических клетках. Эти трубчатые полимеры демонстрируют динамическую нестабильность, поскольку субъединицы гетеродимера тубулина подвергаются повторяющейся полимеризации и деполимеризации. Точный контроль стабильности и динамики микротрубочек, достигаемый с помощью посттрансляционных модификаций тубулина и белков, ассоциированных с микротрубочками, имеет важное значение для различных клеточных функций. Дисфункции микротрубочек тесно связаны с патогенезом, в том числе с нейродегенеративными расстройствами. Текущие исследования сосредоточены на терапевтических агентах, нацеленных на микротрубочки, которые модулируют стабильность, предлагая потенциальные варианты лечения этих заболеваний и рака. Следовательно, понимание динамического состояния микротрубочек имеет решающее значение для оценки прогрессирования заболевания и терапевтических эффектов.

Традиционно динамику микротрубочек оценивали in vitro или в культивируемых клетках с помощью грубого фракционирования или иммуноанализа с использованием антител, нацеленных на посттрансляционные модификации тубулина. Однако точный анализ статуса тубулина в тканях с помощью таких процедур представляет собой проблему. В этом исследовании мы разработали простой и инновационный метод фракционирования микротрубочек для разделения стабильных микротрубочек, лабильных микротрубочек и свободного тубулина в тканях мышей.

Процедура включала гомогенизацию рассеченных тканей мышей в буфере, стабилизирующем микротрубочки, в объемном соотношении 19:1. Затем гомогенаты были фракционированы с помощью двухступенчатого процесса ультрацентрифугирования после первоначального медленного центрифугирования (2400 × г) для удаления мусора. Первая стадия ультрацентрифугирования (100 000 × г) осаждала стабильные микротрубочки, в то время как полученная надосадочная жидкость подвергалась второй стадии ультрацентрифугирования (500 000 × г) для фракционирования лабильных микротрубочек и растворимых димеров тубулина. Этот метод определял пропорции тубулина, составляющего стабильные или лабильные микротрубочки в мозге мыши. Кроме того, наблюдались различные тканевые вариации стабильности микротрубочек, которые коррелировали с пролиферативной способностью составляющих клеток. Эти результаты подчеркивают значительный потенциал этого нового метода для анализа стабильности микротрубочек при физиологических и патологических состояниях.

Введение

Микротрубочки (МТ) представляют собой удлиненные трубчатые структуры, состоящие из протофиламентов, состоящих из α/β-тубулиновых гетеродимерных субъединиц. Они играют важную роль в различных клеточных процессах, таких как деление клеток, подвижность, поддержание формы и внутриклеточный транспорт, что делает их неотъемлемыми компонентами эукариотического цитоскелета. Минус-конец МТ, где экспонируется субъединица α-тубулина, относительно стабилен, тогда как плюс-конец, где экспонируется субъединица β-тубулина, подвергается динамической деполимеризации и полимеризации2. Этот непрерывный цикл присоединения и диссоциации димера тубулина на плюс-конце, называемый динамической нестабильностью, приводит к повторяющемуся процессу спасения икатастрофы. МТ демонстрируют фокальные домены с локализованными вариациями динамической неустойчивости, включая стабильные и лабильные домены4.

Точный контроль динамической нестабильности МТ имеет решающее значение для многих клеточных функций, особенно в нейронах, характеризующихся сложной морфологией. Адаптивность и долговечность МТ играют жизненно важную роль в развитии и правильном функционировании нервных клеток 5,6,7. Было обнаружено, что динамическая нестабильность МТ связана с различными посттрансляционными модификациями (ПТМ) тубулина, такими как ацетилирование, фосфорилирование, пальмитоилирование, детирозинирование, дельта2, окисление полиглутамина и полиглицилирование. Кроме того, связывание белков, ассоциированных с микротрубочками (MAP), служит регуляторным механизмом8. ПТМ, исключая ацетилирование, преимущественно встречаются в карбоксиконцевой области тубулина, расположенной на наружной поверхности МТ. Эти модификации создают разнообразные поверхностные условия на МТ, влияя на их взаимодействие с MAP и, в конечном счете, определяя устойчивость МТ9. Наличие карбокси-концевого остатка тирозина в α-тубулине свидетельствует о динамических МТ, которые быстро замещаются пулом свободного тубулина. И наоборот, детирозинация карбокси-конца и ацетилирование Lys40 означают стабильные МТ с пониженной динамической нестабильностью 9,10.

ПТМ тубулина широко использовались в экспериментах по оценке динамики и стабильности МТ 5,7,11,12,13,14,15. Например, в исследованиях клеточных культур тубулины могут быть разделены на два пула: пул свободного тубулина и пул МТ. Это достигается высвобождением свободного тубулина через пермеабилизацию клеток перед фиксацией оставшихся МТ 15,16,17,18,19. Биохимические методы включают использование химических стабилизаторов МТ, которые защищают МТ от катастрофы, позволяя отделять МТ и свободный тубулин путем центрифугирования20,21,22. Тем не менее, эти процедуры не различают стабильные и менее стабильные (лабильные) МТ, что делает невозможным количественное определение МТ или растворимого тубулина в тканях, таких как головной мозг. Следовательно, оценка стабильности МТ у организмов в физиологических и патологических условиях оказалась сложной задачей. Чтобы устранить это экспериментальное ограничение, мы разработали новый метод точного разделения МТ и свободного тубулина в тканях мыши23.

Этот уникальный метод фракционирования МТ включает в себя гомогенизацию тканей в условиях, поддерживающих статус тубулина в тканях, и двухступенчатое центрифугирование для разделения стабильных МТ, лабильных МТ и свободного тубулина. Эта простая процедура может быть применена к широким исследованиям, включая фундаментальные исследования МТ и МАП у живых организмов, физиологический и патологический анализ здоровья и заболеваний, связанных со стабильностью МТ, а также разработку лекарств и других терапевтических средств, нацеленных на МТ.

протокол

1. Метод фракционирования МТ

ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты, проведенные в этом исследовании, были одобрены Комитетом по этике животных Университета Досися. Здесь использовали мышей C57BL/6J обоего пола в возрасте 3-4 месяцев. В этом протоколе препарированные ткани, например, мозг, печень или тимус, были немедленно гомогенизированы в ледяном буфере для стабилизации микротрубочек (MSB), который содержал таксол (стабилизатор MT) в концентрации, предотвращающей не только деполимеризацию, но и реполимеризацию MT. Гомогенат разделяли на три фракции с помощью двухступенчатого процесса ультрацентрифугирования (рис. 1). Все этапы этого протокола были выполнены без перерыва в среде с низкой температурой, а ткани и фракции не замораживались до тех пор, пока они не были растворены в буфере образца додецилсульфата натрия (SDS).

  1. Подготовка МСБ и микропробирок
    1. Для приготовления МСБ смешивают следующие реагенты: 0,1 М 2-(N-морфолино)этансульфоновая кислота (МЭС), рН 6,8 (нейтрализованный КОН), 10% глицерин, 0,1 мМ ДТТ, 1 мМMgSO4, 1 мМ EGTA, 0,5% Тритон Х-100, ингибиторы фосфатазы (1 мМ NaF, 1 мМ β-глицерофосфат, 1 мМ Na3VO4, 0,5 мкМ окадаиновой кислоты), 1x коктейль ингибиторов протеазы, и ингибиторы протеазы (0,1 мМ PMSF, 0,1 мМ DIFP, 1 мкг/мл пепстатина, 1 мкг/мл антиболи, 10 мкг/мл апротинина, 10 мкг/мл лейпептина, 50 мкг/мл TLCK) (см. таблицу материалов) и обозначают как MSB(-).
    2. Непосредственно перед вскрытием тканей добавьте 10 мкМ таксола и 2 мМ ГТФ (см. таблицу материалов) в MSB(-). Этот буфер обозначается как MSB(+). Приготовьте буфер в день использования и держите его на льду.
    3. Подготовьте микропробирки для отбора проб. Пустая микропробирка объемом 2,0 мл для хранения гомогената; пустая микропробирка объемом 1,5 мл для хранения лизата надосадочной жидкости 1 (S1), образца преципитата2 (P2) и образца преципитата3 (P3); микропробирка объемом 1,5 мл с 1 мл ледяного фосфатно-солевого буфера (PBS) для хранения рассеченных тканей; Микропробирка объемом 1,5 мл с 200 мкл 2x буфера для образцов SDS (0,16 M Tris pH 6,8; 20% глицерина; 2% 2-меркаптоэтанола; 4% SDS) для хранения образца S1 и надосадочной жидкости3 (S3); и центрифугирующие микропробирки для роторов центрифуг TLA55 и TLA120.2 (см. таблицу материалов). Промаркируйте все трубочки и положите их на лед.
  2. Гомогенизация тканей мыши
    1. Подготовьте охлажденный стол для вскрытия тканей. Сначала наполните коробку колотым льдом и поместите на лед две чашки Петри, одну внутренней стороной вверх, а другую внешней. Залейте ледяной ПБС в одну посуду для временного мытья и хранения рассеченных тканей. Разложите фильтровальную бумагу, смоченную ПБС, на другую перевернутую посуду.
    2. Чтобы принести в жертву мышь, выполните вывих шейки матки под глубоким наркозом со смешанным анестетиком из буторфанола, мидазолама и медетомидина. Затем немедленно препарируйте ткани, например, мозг, печень или тимус, и промойте их ледяным PBS в чашке Петри.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этим методом можно анализировать любой тип мягких тканей. Однако размер ткани ограничен рекомендуемым диапазоном объема используемого гомогенизатора. Например, если используется гомогенизатор объемом 2 мл, рекомендуется 50-100 мг ткани.
    3. После взвешивания микропробирок объемом 1,5 мл, заполненных PBS для хранения препарированных тканей, вырежьте и храните ткани внутри микропробирок и повторно взвесьте каждую микропробирку. Влажный вес каждой ткани можно рассчитать, вычитая вес пробирки до и после добавления ткани.
    4. Немедленно гомогенизируйте ткань в ледяном MSB(+) с охлажденным гомогенизатором (см. Таблицу материалов). Объем MSB(+) в 19 раз (мкл) превышал влажную массу ткани (мг). Выполняйте гомогенизацию 20 движениями до тех пор, пока кусочки ткани не исчезнут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Например, 1 900 мкл MSB(+) используется для 100 мг ткани. Поскольку объем добавляемого MSB(+) должен быть скорректирован для каждого влажного веса анализируемых кусочков ткани, необходимо точно взвесить каждый кусочек ткани.
  3. Центрифугирование гомогенатов тканей мыши
    1. Переместите весь гомогенат в микропробирку объемом 2 мл с помощью пипетки Пастера и центрифуги при 2 400 × г в течение 3 мин при 2 °C, чтобы удалить мусор путем осаждения.
    2. Переложите всю надосадочную жидкость (фракцию S1) в новую микропробирку объемом 1,5 мл и вбейте в нее. Затем ферментируют 200 мкл фракции S1 в центрифугируемую микропробирку и центрифугируют при 100 000 × г с помощью ротора TLA-55 в течение 20 мин при 2 °C для получения относительно крупных молекулярных белков в виде осадка (фракция Р2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем образца, подвергнутого стадиям ультрацентрифугирования, влияет на радиус центрифугирования и эффективность осаждения молекул. После этого этапа объем образца должен быть не более 200 мкл, чтобы предотвратить неточное фракционирование.
    3. Далее центрифугируют всю результирующую надосадочную жидкость (фракция S2) при 500 000 × г с помощью ротора TLA-120.2 в течение 60 мин при 2 °C, чтобы отделить нерастворимые белковые комплексы в осадке (фракция P3) от растворимых белков в надосадочной жидкости (фракция S3).
    4. Добавьте 400 мкл 1x буфера для образцов SDS (0,08 M Tris pH 6,8; 10% глицерина; 1% 2-меркаптоэтанола; 2% SDS) в пробирки с фракциями P2 и P3 и кратковременно обработайте ультразвуком для растворения осадка. Переложите эти образцы фракций в пустую микропробирку объемом 1,5 мл.
    5. Растворите общую фракцию S3 в 200 мкл 2x буфера для образцов SDS.
    6. Смешайте оставшиеся фракции S1 с равным объемом 2-кратного буфера для образцов SDS для использования в качестве стандартной кривой для вестерн-блоттинга.
    7. Все эти образцы кипятят при 100 °C в течение 3 мин. После охлаждения образцов до комнатной температуры хранят при температуре -20 °C.
  4. Количественное определение белков в каждой фракции
    1. Количественное определение белков во фракциях P2, P3 и S3 методом вестерн-блоттинга. Во-первых, используйте 10%-ный электрофорез с полиакриламидным гелем (SDS-PAGE) для отделения белков от правильно разбавленных фракций P2, P3 и S3, а также последовательно разбавленного образца S1 от любого индивидуума в виде стандартной кривой. Затем электроблот образцов наносят на мембраны из поливинилиденфторида (см. таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициент разведения каждой фракции зависит от концентрации объективного белка и реакционной способности антитела. (например, α-тубулин, TUBB3, β-тубулин и тирозинированный тубулин в ткани мозга: S3 = 1/400, P3 = 1/2000, P2 = 1/2000, S1 = 1/50,000, 1/20 000, 1/10 000, 1/5 000, 1/2 000; ацетилированный тубулин в мозговой ткани: S3 = 1/200, P3 = 1/400, P2 = 1/8 000, S1 = 1/100 000, 1/40 000, 1/20 000, 1/10 000, 1/4 000; α-тубулин в печени: S3 = 1/20, P3 = 1/100, P2 = 1/20, S1 = 1/50 000, 1/20 000, 1/10 000, 1/5 000, 1/2 000; α-тубулин в тимусе: S3 = 1/100, P3 = 1/400, P2 = 1/20, S1 = 1/50 000, 1/20 000, 1/10 000, 1/5 000, 1/2 000 разбавление тканевой концентрации).
    2. Заблокируйте мембрану 5%-ным обезжиренным молоком в Tris-буферном физиологическом растворе (50 мМ Tris-HCl pH 7,6; 152 мМ NaCl) с 0,1% Tween 20 (TBS-T) в течение более 30 минут.
    3. Погрузите мембрану в TBS-T, содержащее первичные антитела (см. таблицу материалов), более чем на 2 ч. После этого промыть мембрану TBS-T в течение 3 мин (3 раза).
    4. Мечите первичные антитела с помощью HRP-конъюгированных вторичных антител (см. таблицу материалов) в TBS-T в течение более 1 ч. После этого промыть мембрану TBS-T в течение 3 мин (3 раза).
    5. Разработайте мембраны с помощью реагента Enhanced Chemiluminescence. Затем проанализируйте интересующие полосы с помощью люминесцентного анализатора изображений (см. таблицу материалов).
    6. Количественно оцените интенсивность белковых зон с помощью программного обеспечения для анализа изображений (см. Таблицу материалов) и создайте стандартную кривую, построив графики единиц разбавления разбавленных образцов S1, используемых для стандартной кривой вдоль оси X, и интенсивностей полос вдоль оси Y.
    7. Считывают концентрацию белка (единицу измерения), соответствующую разбавленной фракции образцов. Умножьте считанную концентрацию на коэффициент разбавления образца, чтобы получить единицу белка в каждой фракции. Разделите измеренную единицу каждой фракции на общую единицу белка (P2 + P3 + S3), чтобы получить процентное соотношение.

2. Оценка свойств тубулина в каждой фракции

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот биохимический метод позволяет выделить три группы тубулиновых комплексов, определяемых седиментационными свойствами. При этом определялся статус тубулиновых комплексов, полученных в этих фракциях, исходя из размеров комплекса и тубулин-ПТМ. Выполняйте все шаги этого протокола без перерыва в среде с низкой температурой, но не замораживайте образцы фракций до тех пор, пока они не растворятся в буфере образцов SDS.

  1. Анализ фильтрующих ловушек
    1. Отфильтруйте фракции S2 и S3 (по 500 мкл каждая) с помощью ультрафильтрационной спиновой колонки с давлением 300 кДа (см. таблицу материалов). Проводят центрифугирование 14 000 × г при 2 °C до тех пор, пока весь надосадочный раствор не будет отфильтрован, элюированные белки не будут собраны в приемные трубки, а захваченные белки останутся на фильтре резервуарных пробирок.
    2. Переведите целые фильтраты (примерно 500 мкл) в пробирках-приемниках в новые микропробирки объемом 1,5 мл и растворите их в 500 мкл 2-кратного буфера для образцов SDS.
    3. Солюбилизируйте остатки на фильтре резервуарных пробирок в 1 000 мкл буфера для 1x SDS-образца путем пипетирования и переноса образцов в новую микропробирку объемом 1,5 мл.
    4. Прокипятите образцы при 100 °C в течение 3 мин. После охлаждения образцов до комнатной температуры хранят при температуре -20 °C.
    5. Анализируют количество тубулина методом вестерн-блоттинга с DM1A (антитела к α-тубулину, см. таблицу материалов).
  2. Размерно-исключающая хроматография
    1. Приготовьте буфер-носитель (0,1 М MES, pH 6,8; 10% глицерина; 1 мМMgSO4; 1 мМ EGTA; 0,1 мМ DTT) с добавлением 1/10 концентрации ингибиторов протеазы и фосфатазы, как описано на этапе 1.1.1. Затем отфильтруйте раствор и храните его в холодном помещении.
    2. Подготовьте колонку гель-фильтрационной хроматографии, оснащенную препаративной системой жидкостной хроматографии, в хроматографической камере (см. таблицу материалов) при температуре 4 °C.
    3. Перед впрыском образцов в колонку пролейте 180 мл буфера-носителя для промывки колонки. Расход составляет 1 мл/мин в течение 3 ч.
    4. В качестве контроля вводят коммерчески доступный очищенный свиной тубулин (см. таблицу материалов) или фракцию S3 из мозга мыши (по 500 мкл каждый) в колонку.
    5. Элюируют при скорости потока 1,0 мл/мин с буфером-носителем. Собирайте фракции по 1,5 мл в течение 120 минут. Контролируйте элюированные белки по абсорбции при длине волны 280 нм. Поддерживайте максимальное давление ниже 0,3 МПа.
    6. После вихревания собранных фракций смешайте 50 мкл из них с 50 мкл 2-кратного буфера для образцов SDS в микропробирке объемом 1,5 мл. Кипятят все образцы при 100 °C в течение 3 мин. После охлаждения образцов до комнатной температуры хранят при температуре -20 °C.
    7. Анализируют количество тубулина методом вестерн-блоттинга с DM1A, антителами к α-тубулину и KMX-1, антителами к β-тубулину (см. таблицу материалов).

Результаты

Количественное определение тубулина во фракциях P2, P3 и S3 из головного мозга мышей методом МТ-фракционирования
Тубулин в тканях мышей разделяли на фракции Р2, Р3 и S3 методом МТ-фракционирования и количественно определяли методом вестерн-блоттинга (рис. 1А). Осад?...

Обсуждение

Важнейшей задачей при исследовании состояния тубулина в тканях живых организмов является предотвращение случайной МТ-полимеризации или деполимеризации в процессе препарирования. На стабильность МТ в образцах влияют такие факторы, как концентрация таксола в MSB, доля тканевого количе?...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о котором они могли бы сообщить.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана JST, учреждением университетских стипендий для создания научно-технических инноваций (A.HT.; JPMJFS2145), JST SPRING (A.HT.; JPMJSP2129), Grant-in-Aid для стипендиатов JSPS (A.HT.; 23KJ2078), грант для научных исследований (B) JSPS KAKENHI (22H02946 для TM), грант для научных исследований в инновационных областях под названием «Старение белка мозга и контроль деменции» от MEXT (TM; 26117004) и исследовательская стипендия Уэхара от Мемориального фонда Уэхара (TM; 202020027). Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 ML TUBE CASE OF 500Beckman Coulter357448
1A2Sigma-AldrichT90281:5,000 dilution
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)Nacalai Tesque02442-44
300 kDa ultrafiltration spin columnAprosciencePT-1013
6-11B1Sigma-AldrichT74511:5,000 dilution
ÄKTAprime plusCytiva11001313
anti-mouse IgGJackson ImmunoResearch115-035-1461:5,000 dilution
antipainPeptide Institute Inc.4062
aprotininNacalai Tesque03346-84
Chemi-Lumi One LNacalai Tesque07880-54
Corning bottle-top vacuum filter systemCorning4307580.22µm 33.2cm² Nitrocellulose membrane
DIFPSigma-Aldrich55-91-4 
DIGITAL HOMOGENIZER HK-1AS ONE1-2050-11
DM1ASigma-AldrichT90261:5,000 dilution
DTTNacalai Tesque14128-46
EGTANacalai Tesque37346-05
FluoroTrans W 3.3 Meter RollPall CorporationBSP0161
glycerolNacalai Tesque17018-25
GTPNacalai Tesque17450-61
HIGH SPEED REFRIGERATIOED MICRO CENTRIFUGE KitmanTOMYKITMAN-24
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg columnCytiva28-9893-35
Image Gauge Software FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation
ImmunoStar LD FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation292-69903
KMX-1MilliporeMAB34081:5,000 dilution
LAS-4000 luminescent image analyzerFUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation
leupeptinPeptide Institute Inc.43449-62
MgSO4Nacalai Tesque21003-75
Na3VO4Nacalai Tesque32013-92
NaFNacalai Tesque31420-82
okadaic acidLC LaboratoriesO-2220 
OPTIMA MAX-XPBeckman Coulter393315
pepstatinNacalai Tesque26436-52
PMSFNacalai Tesque27327-81
Polycarbonate Centrifuge Tubes for TLA120.2Beckman Coulter343778
Protease inhibitor cocktail (cOmplete™, EDTA-free)Roche11873580001
Purified tubulin CytoskeletonT240
QSONICA Q55QSonicaQ55
TaxolLC LaboratoriesP-9600
TLA-120.2 rotorBeckman Coulter357656
TLA-55 rotorBeckman Coulter366725
TLCKNacalai Tesque34219-94
Triton X-100Nacalai Tesque12967-45
β-glycerophosphateSigma-AldrichG9422

Ссылки

  1. Janke, C., Magiera, M. M. The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).
  2. Conde, C., Caceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 319-332 (2009).
  3. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
  4. Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. Stability properties of neuronal microtubules. Cytoskeleton (Hoboken). 73 (9), 442-460 (2016).
  5. Challacombe, J. F., Snow, D. M., Letourneau, P. C. Dynamic microtubule ends are required for growth cone turning to avoid an inhibitory guidance cue. Journal of Neuroscience. 17 (9), 3085-3095 (1997).
  6. Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Building the neuronal microtubule cytoskeleton. Neuron. 87 (3), 492-506 (2015).
  7. Leo, L., et al. Vertebrate fidgetin restrains axonal growth by severing labile domains of microtubules. Cell Reports. 12 (11), 1723-1730 (2015).
  8. Janke, C. The tubulin code: molecular components, readout mechanisms, and functions. Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).
  9. Wloga, D., Joachimiak, E., Fabczak, H. Tubulin post-translational modifications and microtubule dynamics. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2207 (2017).
  10. Baas, P. W., Black, M. M. Individual microtubules in the axon consist of domains that differ in both composition and stability. Journal of Cell Biology. 111 (2), 495-509 (1990).
  11. Cartelli, D., et al. Microtubule alterations occur early in experimental parkinsonism and the microtubule stabilizer epothilone D is neuroprotective. Scientific Reports. 3, 1837 (2013).
  12. Zhang, B., et al. Microtubule-binding drugs offset tau sequestration by stabilizing microtubules and reversing fast axonal transport deficits in a tauopathy model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (1), 227-231 (2005).
  13. Zhang, F., et al. Post-translational modifications of alpha-tubulin in Alzheimer disease. Translational Neurodegeneration. 4, 9 (2015).
  14. Miyasaka, T., et al. Curcumin improves tau-induced neuronal dysfunction of nematodes. Neurobiology of Aging. 39, 69-81 (2016).
  15. Fujiwara, H., et al. Inhibition of microtubule assembly competent tubulin synthesis leads to accumulation of phosphorylated tau in neuronal cell bodies. Biochemical and Biophysical Research Communications. 521 (3), 779-785 (2020).
  16. Vielkind, U., Swierenga, S. H. A simple fixation procedure for immunofluorescent detection of different cytoskeletal components within the same cell. Histochemistry. 91 (1), 81-88 (1989).
  17. Kanai, Y., et al. Expression of multiple tau isoforms and microtubule bundle formation in fibroblasts transfected with a single tau cDNA. Journal of Cell Biology. 109 (3), 1173-1184 (1989).
  18. Brown, A., Li, Y., Slaughter, T., Black, M. M. Composite microtubules of the axon: quantitative analysis of tyrosinated and acetylated tubulin along individual axonal microtubules. Journal of Cell Science. 104 (2), 339-352 (1993).
  19. Black, M. M., Slaughter, T., Moshiach, S., Obrocka, M., Fischer, I. Tau is enriched on dynamic microtubules in the distal region of growing axons. Journal of Neuroscience. 16 (11), 3601-3619 (1996).
  20. Caron, J. M., Jones, A. L., Kirschner, M. W. Autoregulation of tubulin synthesis in hepatocytes and fibroblasts. Journal of Cell Biology. 101 (5), 1763-1772 (1985).
  21. Merrick, S. E., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. Selective destruction of stable microtubules and axons by inhibitors of protein serine/threonine phosphatases in cultured human neurons. Journal of Neuroscience. 17 (15), 5726-5737 (1997).
  22. Miyasaka, T., Sato, S., Tatebayashi, Y., Takashima, A. Microtubule destruction induces tau liberation and its subsequent phosphorylation. FEBS Letters. 584 (14), 3227-3232 (2010).
  23. Hagita, A., et al. Quantitative fractionation of tissue microtubules with distinct biochemical properties reflecting their stability and lability. Biochemical and Biophysical Research Communications. 560, 186-191 (2021).
  24. Montecinos-Franjola, F., Chaturvedi, S. K., Schuck, P., Sackett, D. L. All tubulins are not alike: Heterodimer dissociation differs among different biological sources. Journal of Biological Chemistry. 294 (26), 10315-10324 (2019).
  25. Vallee, R. B. A taxol-dependent procedure for the isolation of microtubules and microtubule-associated proteins (MAPs). Journal of Cell Biology. 92 (2), 435-442 (1982).
  26. Bartolo, M. E., Carter, J. V. Effect of microtubule stabilization on the freezing tolerance of mesophyll cells of spinach. Plant Physiology. 97 (1), 182-187 (1991).
  27. Strang, K. H., Golde, T. E., Giasson, B. I. MAPT mutations, tauopathy, and mechanisms of neurodegeneration. Laboratory Investigation. 99 (7), 912-928 (2019).
  28. Fourel, G., Boscheron, C. Tubulin mutations in neurodevelopmental disorders as a tool to decipher microtubule function. FEBS Letters. 594 (21), 3409-3438 (2020).
  29. Terry, R. D., Gonatas, N. K., Weiss, M. Ultrastructural studies in Alzheimer's presenile dementia. The American Journal of Pathology. 44 (2), 269-297 (1964).
  30. Yoshida, H., Ihara, Y. Tau in paired helical filaments is functionally distinct from fetal tau: assembly incompetence of paired helical filament-tau. Journal of Neurochemistry. 61 (3), 1183-1186 (1993).
  31. Cash, A. D., et al. Microtubule reduction in Alzheimer's disease and aging is independent of tau filament formation. The American Journal of Pathology. 162 (5), 1623-1627 (2003).
  32. Hempen, B., Brion, J. P. Reduction of acetylated alpha-tubulin immunoreactivity in neurofibrillary tangle-bearing neurons in Alzheimer's disease. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 55 (9), 964-972 (1996).
  33. Miyasaka, T., et al. Imbalanced expression of tau and tubulin induces neuronal dysfunction in C. elegans models of tauopathy. Frontiers in Neuroscience. 12, 415 (2018).
  34. Boiarska, Z., Passarella, D. Microtubule-targeting agents and neurodegeneration. Drug Discovery Today. 26 (2), 604-615 (2021).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE201

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены