分析易患狼疮的MRL/lpr小鼠的蛋白尿、白细胞肾浸润和蛋白质的肾脏沉积

摘要

本方案描述了一种跟踪小鼠狼疮进展的方法。提出了另外两种程序来表征基于细胞浸润和肾脏中蛋白质沉积的狼疮性肾炎。

摘要

系统性红斑狼疮（SLE）是一种自身免疫性疾病，没有已知的治愈方法，其特征是许多器官（包括肾脏）的持续炎症。在这种情况下，肾脏失去了清除血液中的废物并调节盐和液体浓度的能力，最终导致肾功能衰竭。女性，特别是育龄妇女，被诊断出的频率是男性的九倍。肾脏疾病是系统性红斑狼疮患者死亡的主要原因。本方案描述了一种快速简单的方法来测量收集的尿液中排泄的蛋白质水平，跟踪狼疮随时间的进展。此外，根据大小和密度选择，提供了一种分离肾脏单核细胞的方法，以研究白细胞的肾脏浸润。此外，已经开发了一种免疫组织化学方法来表征肾小球中的蛋白质沉积和肾小管间质空间中的白细胞浸润。总之，这些方法可以帮助研究与易患狼疮的MRL / lpr小鼠的肾脏相关的慢性炎症的进展。

引言

肾脏的主要功能是通过尿液消除有毒物质，同时保持水和盐的稳态¹。该功能在系统性红斑狼疮（SLE）患者中受到威胁，导致所谓的狼疮性肾炎（LN）。LN是免疫系统攻击肾脏的结果，导致持续的肾脏炎症，因此失去了清除血液中废物和调节盐和液体浓度的能力。这最终将导致肾功能衰竭，这可能是致命的。在肾炎过程中，循环的B细胞，T细胞和单核细胞被招募到肾脏，分泌趋化因子，细胞因子和免疫复合物形成自身抗体。这最终导致内皮细胞损伤，膜损伤，肾小管萎缩和纤维化²。

容易出现狼疮的小鼠是一种经典的小鼠模型，表现出类似于人类SLE³的狼疮样临床体征。该模型有助于了解SLE患者死亡的主要原因之一，狼疮性肾炎（LN）⁴。在人和小鼠SLE中，LN的特征在于由肾沉积的免疫复合物引发的逐渐炎症，随后是补体激活，炎症细胞募集和肾功能丧失⁵。免疫复合物沉积是内在肾细胞诱导趋化因子和细胞因子产生的第一步，其通过招募免疫细胞⁶来扩展炎症反应。目前的方案提出了几种跟踪肾脏疾病进展的技术，分析细胞浸润和免疫复合物沉积。

每周收集的尿液可以检测和可视化狼疮发作之前、期间和之后的蛋白尿病程。蛋白尿作为生物标志物可以决定LN的生物学进展。该技术的其他优点是它是非侵入性的，具有成本效益的，并且易于实施⁷。当肾脏完美工作时，蛋白尿水平始终很低;然而，在MRL / lpr小鼠中，在8-9周龄后，观察到蛋白尿水平的逐渐增加，最终高到足以引起肾功能衰竭⁸。市面上有多种试剂条和比色试剂来监测问题。然而，Bradford测定在确定蛋白尿的发作和狼疮性肾炎的病程方面是廉价且非常准确的。该测定速度快，试剂不受样品中可能存在的溶剂、缓冲液、还原剂和金属螯合剂的影响^9，10，11。

要考虑的一个重要方面是肾脏中的细胞浸润。这些浸润通过触发可溶性因子（如细胞因子）的分泌来促进发病机制，从而加重炎症¹²。为了更好地了解浸润中存在哪些细胞群，一种有用的方法是分离白细胞¹³。这里，以检测B细胞肾浸润为例。该过程从脱氧核糖核酸酶（DNase）和胶原酶的消化过程开始，然后是密度梯度分离，以去除碎片，红细胞和致密的粒细胞。分离B细胞（CD19 ⁺）和浆细胞（CD138 ⁺）的原因是狼疮肾可以浓缩这些细胞¹⁴。有人认为，肾脏中小聚集体中存在B细胞可以表明克隆性扩增，从而产生免疫球蛋白（Ig）。众所周知，浆细胞也存在于这些聚集体中¹⁵。一旦分离出白细胞，荧光活化细胞分选（FACS）可用于在用不同的荧光偶联抗体染色时分析感兴趣的细胞。

免疫荧光是免疫组化（IHC）检测方法之一，允许在4μm厚的肾脏组织样品中对蛋白质进行荧光可视化。其他IHC检测方法取决于分析物的性质、结合化学和其他因素¹⁶。免疫荧光是一种快速鉴定方法，可将抗原暴露于用特定荧光染料（或荧光染料）标记的对应抗体中。当激发时，它产生荧光显微镜可以检测到的光。该技术可用于观察补体C3和IgG2a¹⁷的沉积。过量的补体级联激活可能与不受控制的免疫反应和功能丧失有关¹⁸.肾脏中抗双链DNA（抗dsDNA）自身抗体的免疫沉积是一个主要问题¹⁹，其中具有IgG2a同种型的抗体与LN²⁰相关。具体而言，抗dsDNA抗体对核材料表现出更多的致病性和亲和力，形成免疫复合物²¹。当存在IgG2a时，包括C3在内的补体级联反应被激活以清除免疫复合物²²。C3和IgG2a标记可以单独量化或叠加以建立其相关性。

值得注意的是，血清肌酐测量是另一种可靠的技术，可以与显微镜下血尿和肾活检一起使用来诊断LN²³。然而，蛋白尿的存在是肾小球损伤的强烈指标。从这个意义上说，监测狼疮期间的蛋白尿水平可以检测疾病发作并补充其他诊断狼疮的方法。此外，沉积在肾小球中的免疫复合物可以诱导炎症反应，激活补体系统，并招募更多的炎症细胞。该协议的另一个值得注意的点是B细胞浸润在肾脏中。这与浸润的T细胞一起放大了引发器官损伤的局部免疫反应。重要的是，LN的分类不仅基于显微镜下可见的肾小球形态变化，还基于免疫荧光观察到的免疫沉积物。因此，在该协议中，在实验室环境中提供了用于分析肾功能的准确性和成本效益的方法。

研究方案

本议定书由弗吉尼亚理工大学的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。由于狼疮病在女性中的发病率较高，因此仅使用雌性MRL / lpr小鼠。样本采集从4周龄开始，15周结束。小鼠是从商业来源获得的（参见 材料表），并按照机构指南在特定的无病原体环境中繁殖和维护。

1. 蛋白尿试验

1. 按照以下步骤收集尿液。
   1. 通过喷洒70%乙醇对罩进行灭菌。在表面上放置无菌塑料片。准备吸头，1.5 mL管和移液器以收集约20μL液体。
      注意:吸头和试管必须是无菌的，没有任何预处理。
   2. 取笼子并喷洒70%乙醇，然后将其放入罩内。
   3. 用一只手握住鼠标，用另一只手从上到下轻轻按摩腹侧区域。
   4. 使用1.5 mL管或移液管直接收集尿液，或者如果样品滴落，则从塑料片中收集尿液。对每个样品使用干净的手套、床单和吸头。
      注意:如果这不起作用，请使用无菌烧杯隔离小鼠，然后在小鼠小便后从烧杯中收集尿液。
   5. 将鼠标放回笼子里。取出另一个鼠标并重复步骤 1.1.3-1.1.4。
      注意:收集每只小鼠的样品后，始终用70%乙醇清洁塑料片和烧杯。每组至少需要五只小鼠才能具有统计学意义。尿液样品可以在-80°C下储存，直到使用长达12个月。
2. 通过布拉德福德方法量化蛋白质²⁴。
   1. 通过将尿液样品，白蛋白标准品和布拉德福德试剂保持在冰箱外10-20分钟，使它们达到室温（RT）。
      注意:布拉德福德试剂和白蛋白标准品包含在市售试剂盒中（参见 材料表）。白蛋白标准的起始浓度为2毫克/毫升。连续稀释（1:2六次）必须用水完成。
   2. 将布拉德福德试剂加入96孔板（200μL /孔），未稀释。
   3. 每孔移取5μL未稀释的尿样，并使用吸头上下移液几次以正确混合。
   4. 添加标准品（400、200、100、50、25、12.5 mg/dL）一式两份。留下几口井作为空白。
      注意:样品和标准品的添加需要快速完成。
   5. 让它在室温下静置5-10分钟。
   6. 根据制造商的协议，在读板器中读取595 nm处的板（参见 材料表）。

2. 肾细胞的分离

1. 在腔室中用CO₂ （流速:30%-70%体积/分钟，以实现无意识或死亡）对小鼠实施安乐死，然后进行宫颈脱位。继续进行解剖以收集两个肾脏。将一个半肾脏放入冰冷的C10培养基中。将另一半肾脏放入OCT（步骤3.1.1）。
   注意:C10由RPMI 1640制成，并辅以10%胎牛血清，1 mM丙酮酸钠，1%100x MEM非必需氨基酸，10 mMHEPES，55μM 2-巯基乙醇和100 U / mL青霉素 - 链霉素（见 材料表）。
2. 将肾脏切成粒度（1-2mm³ 块），并在含有1mg / mL胶原酶和0.2mg / mL DNase I（见 材料表）的5mL消化缓冲液中在RPMI 1640培养基中消化10 mmol / L HEPES，在37°C下连续温和摇动。
   注意:在无菌的2 mL管中加入1 mL消化缓冲液，并使用无菌剪刀切碎肾脏。
3. 加入10 mL含有10mM乙二胺四乙酸（EDTA）的1x冰冷PBS，并在冰上孵育10分钟。然后将悬浮液涡旋两次。
4. 通过100μM过滤器过滤细胞悬浮液，并用10mLHBS满溶液洗涤。
   注意:HBSS-full含有5百万的EDTA，0.1%的BSA和10百万的HEPES。
5. 在室温下以350× g 离心10分钟。
6. 准备 30%、37% 和 70% 的等渗珍珠 （SIP） 溶液。
   注:将 1 份体积为 10 倍 PBS 的容量和 9 份体积的珍珠岩混合在一起，以制备 SIP（参见 材料表）;使用全口径将 SIP 稀释至 30%、37% 和 70%SIP。
7. 将细胞重悬于 5 mL 30% SIP 中，并装载 37% 的 5 mL（顶部）和 70% 的 5 mL（底部），用糊状移液管缓慢地进行 SIP 梯度。
8. 用Up9 down0（或制动0）在室温下以1000× g 离心30分钟。
9. 从37%-70%界面收集白细胞，并将其重悬于5 mL C10中。
10. 在4°C下以350× g 离心10分钟。
11. 将细胞沉淀重悬于3mL FACS缓冲液中。细胞已准备好进行流式细胞胞浆细胞系统染色。
    注意:FACS缓冲液含有1x PBS和0.1%牛血清白蛋白（BSA）。
12. 在4°C下以350× g 离心5分钟，弃去上清液（SN），留下约50μL。
    注意:要除去上清液，请小心地将溶液倒入或移液远离固体，或使用半自动真空吸出上清液。
13. 每管加入50μLFcR块（见 材料表）（在1x PBS中预稀释1/50）;混合并在黑暗中的冰上孵育10分钟。
14. 加入2毫升FACS缓冲液进行洗涤。
15. 在4°C下以350× g 离心5分钟，弃去SN，留下约50μL。
16. 加入20μL适当的荧光染料（用1x PBS稀释1/100，参见 材料表），并在冰上静置15-30分钟。
17. 每管加入50μL抗体¹⁵ 混合物:CD138-BV711（1x PBS中的1/200）和CD45-AF700（1x PBS中的1/200）（参见 材料表）。
18. 在黑暗中在冰上孵育15-30分钟，并加入3mL FACS缓冲液。
19. 在4°C下以350× g 离心5分钟，留下约50μL。现在可以通过流式细胞术进行分析。

3. 免疫荧光染色

1. 执行示例收集。
   1. 将半肾嵌入具有最佳切割温度（OCT）化合物的小塑料冷冻模具中（参见 材料表）。
   2. 将干冰加入聚苯乙烯泡沫盒中（见 材料表），然后小心地将冷冻冻膜放在干冰上。确保冷冻模具平放。
      注意:OCT化合物需要3-4分钟才能固化并变白。
   3. 取出冷冻模具，用铝箔包裹。将其储存在-80°C直至进一步使用。
      注意:这可以在-80°C下储存至少1年。
2. 对样品进行切片和固定。
   1. 将样品切成4μm切片，等待至少2-3小时干燥，然后用冷丙酮（在4°C）固定10分钟。
      注意:使用丙酮时要小心，这需要专门的化学罩。
   2. 固定载玻片后，风干0.5-1小时，并在-20°C下短时间储存，或在-80°C下长时间储存。
3. 对样品进行染色。
   1. 将载玻片重新放入冷丙酮中5-10分钟。
   2. 让切片升温至室温，在切片周围使用 PAP 笔（参见 材料表）并使其干燥。
      注意:也可以使用指甲珐琅。此步骤可防止抗体稀释液漂浮在载玻片上。
   3. 将载玻片放入Coplin罐中的1x Tris缓冲盐水（TBS）中（参见 材料表）20分钟，将罐子放在摇摇杯上，轻轻摇动。
   4. 倒出1x汤匙，在罐子里装满1x汤匙，5%BSA和0.1%吐温20。在摇摇杯上孵育20分钟，轻轻摇匀。
   5. 取出载玻片，擦干载玻片底部。如有必要，摇干载玻片。向该部分加入100μL偶联抗体²⁵ C3-FITC（1/100）和IgG2a-PE（1/100）（见 材料表）。在室温下在加湿室中孵育1小时。
   6. 在摇摇床上以1x TBS，5%BSA和0.1%吐温20洗涤切片3次，持续10分钟。
   7. 摇干载玻片，然后用抗淬灭试剂（参见 材料表）安装切片，然后用盖玻片安装切片。
   8. 将载玻片储存在4°C直至在显微镜下观察（例如，共聚焦显微镜或成像系统显微镜）。使用软件量化图像，并在比较区域之间的荧光强度时减去背景信号。
   9. 对于使用ImageJ软件进行图像分析（参见 材料表），请勾勒出所需区域。
   10. 通过单击" 分析"来设置标准参数，然后单击 "设置测量 值"和 "测量面积" 以获取结果。
   11. 将从测量窗口获得的数据传输到电子表格。
       注意:可以从图像中选择一个小区域作为背景;它不应该有任何荧光。
   12. 完成后，单击" 分析 "以测量区域，然后再次将数据传输到上一个电子表格。
   13. 对多个区域重复步骤 3.3.11-3.3.12。
   14. 将平均荧光计算为校正细胞荧光（CCF）=积分密度-（所选细胞区域x平均背景荧光）。
   15. 使用绘图和统计软件计算每个区域并分析数据（参见 材料表）。

结果

该方案使用多种方法来评估狼疮性肾炎的MRL / lpr小鼠。首先，描述了一种程序来研究由于肾功能障碍而引起的蛋白尿水平随时间增加。如图 1所示，雌性小鼠以口服强饲法200μL磷酸盐缓冲盐水（1x PBS）作为对照组，益生菌 罗伊氏乳杆菌 作为治疗组，浓度为10⁹ cfu / mL，每周两次。治疗从3周龄开始，到15周龄结束。用 罗伊氏乳杆菌 治疗的小鼠组比对照组?...

讨论

LN是SLE患者死亡的主要原因，加重该病的因素尚不清楚。该方案的应用是使用多种方法表征肾功能，包括蛋白尿的测量，分离的肾白细胞的FACS分析以及冷冻肾切片的免疫荧光染色。

收集尿液时要考虑的一个要点是，必须与一天中的时间和尿液收集的位置一致。小鼠是夜间活动的动物，因此在小鼠开始活跃之前的下午晚些时候收集最准确的样本。选择这个时间的另一个原因是MR...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Tris-Buffered Saline (TBS)	Thermo Fisher Scientific	J60764.K2
2-mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	21985-023
Anti-Human/Mouse C3	Cedarlane	CL7632F
Anti-Mouse CD138 BV711	Biolegend	142519
Anti-Mouse CD45 AF700	Biolegend	103127
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9418-100G
Collagenase D	Sigma-Aldrich	11088882001
Confocal Microscope LSM 880	Zeiss	LSM 880
Coplin jar	Fisher Scientific	50-212-281
Cryomold	Fisher Scientific	NC9511236
Density gradient medium	GE Healthcare	17-1440-02	Percoll
DEPC-Treated water	Thermo Fisher Scientific	AM9906
DNase I	Sigma-Aldrich	D4527
dsDNA-EC	InvivoGen	tlrl-ecdna
Ethylenediaminetetraacetic Acid	Fisher Scientific	S311-500	EDTA
EVOS M5000 Microscope imaging system	Thermo Fisher Scientific	AMF5000
FACS Fusion Cell sorter	BD Biosciences	FACS Fusion
Fetal Bovine Serum - Premium, Heat Inactivated	R&D systems	S11150H
Fisherbrand 96-Well Polystyrene Plates	Fisher Scientific	12-565-501
Graphpad prism	GraphPad	N/A
Hank’s Balanced Salt Solution	Thermo Fisher Scientific	14175-079
HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630-080
ImageJ software	National Institutes of Health	N/A
Lactobacillus reuteri Kandler et al.	ATCC	23272
MEM non-essential amino acids	Thermo Fisher Scientific	11140-050
MRL/MpJ-Fas lpr /J Mice (MRL/lpr)	Jackson Lab	485
Nail enamel	N/A	N/A	Any conventional store
O.C.T compound	Tisse-Tek	4583
PAP pen	Sigma-Aldrich	Z377821
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds	Polysciences	R-30
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-122
Phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	70011069
Pierce 20x TBS Buffer	Thermo Fisher Scientific	28358
Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay kit	Thermo Fisher Scientific	23236	Albumin standard included
ProLon Gold Antifade Mountant	ThermoFisher	P36934
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32	BD Biosciences	553141	FcR block
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	11875-093
Sodium pyruvate	Thermo Fisher Scientific	11360-070
SpectraMax M5	Molecular Devices	N/A	SoftMax Pro 6.1 software
Sterile cell Strainers 100 µM	Fisher Scientific	22363549
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-500
Vancomycin Hydrochloride	Goldbio	V-200-1
Zombie Aqua	Biolegend	423102	fluorescent dye for flow cytometry analysis