단백뇨, 백혈구의 신장 침윤 및 루푸스가 발생하기 쉬운 MRL / lpr 마우스에서 단백질의 신장 침착 분석

요약

본 프로토콜은 마우스에서 루푸스 진행을 추적하는 방법을 기술한다. 세포 침윤과 신장에서의 단백질 침착을 기반으로 루푸스 신염을 특성화하기위한 두 가지 추가 절차가 제시됩니다.

초록

전신성 홍반성 루푸스 (SLE)는 알려진 치료법이없는 자가면역 질환이며 신장을 포함한 많은 장기에서 지속적인 염증을 특징으로합니다. 이러한 상황에서 신장은 혈액에서 노폐물을 청소하고 소금과 체액 농도를 조절하는 능력을 상실하여 결국 신부전으로 이어집니다. 여성, 특히 가임기 여성은 남성보다 아홉 배 더 자주 진단됩니다. 신장 질환은 SLE 환자에서 사망의 주요 원인입니다. 본 프로토콜은 수집된 소변에서 배설된 단백질 수준을 측정하여 시간에 따른 루푸스 진행을 추적하는 빠르고 간단한 방법을 기술합니다. 또한, 신장 단핵구를 분리하는 접근법은 백혈구의 신장 침윤을 조사하기 위해 크기 및 밀도 선택에 기초하여 제공된다. 또한, 사구체에서의 단백질 침착과 세뇨관 간질성 공간에서의 백혈구 침윤을 특성화하기 위해 면역조직화학 방법이 개발되었다. 함께, 이러한 방법은 루푸스가 발생하기 쉬운 MRL / lpr 마우스의 신장과 관련된 만성 염증의 진행을 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다.

서문

신장의 주요 기능은 물과 소금의 항상성을 유지하면서 소변을 통해 독성 물질을 제거하는 것입니다¹. 이 기능은 전신성 홍반성 루푸스 (SLE) 환자에서 위협받으며, 소위 루푸스 신염 (LN)으로 이어집니다. LN은 면역 체계가 신장을 공격하여 지속적인 신장 염증을 유발하므로 혈액에서 노폐물을 청소하고 소금과 체액 농도를 조절하는 능력을 상실합니다. 이것은 결국 치명적일 수있는 신부전으로 이어질 것입니다. 신장 과정 동안, 순환 B 세포, T 세포 및 단핵구가 신장에 모집되어 케모카인, 사이토카인 및 면역 복합체 형성 자가항체를 분비한다. 이것은 궁극적으로 내피 세포 손상, 막상 손상, 신장 세뇨관 위축 및 섬유증을 초래합니다².

MRL / Mp-Fas^{lpr (MRL} / lpr) 루푸스가 발생하기 쉬운 마우스는 인간 SLE³과 유사한 루푸스 유사 임상 징후를 나타내는 고전적인 마우스 모델입니다. 이 모델은 SLE 환자의 주요 사망 원인 중 하나 인 루푸스 신염 (LN)⁴을 이해하는 데 도움이되었습니다. 인간 및 마우스 SLE 둘 다에서, LN....

프로토콜

본 프로토콜은 Virginia Tech의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 루푸스 병은 암컷에서 더 높은 발병률을 보이기 때문에 암컷 MRL / lpr 마우스 만 사용되었습니다. 샘플 수집은 4 주령에서 시작하여 15 주에 완료되었습니다. 마우스를 상업적 공급원으로부터 수득하였고( 물질의 표 참조), 기관 지침에 따라 특정 병원체가 없는 환경에서 사육되고 유지되었다.

1. 단백뇨 검사

1. 아래 단계에 따라 소변을 수집하십시오.
   1. 70 % 에탄올을 분무하여 후드를 살균하십시오. 멸균 플라스틱 시트를 표면에 놓습니다. 팁, 1.5 mL 튜브, 및 피펫을 준비하여 약 20 μL의 액체를 수집한다.
      참고: 팁과 튜브는 멸균 상태여야 하며 사전 처리 없이 사용해야 합니다.
   2. 케이지를 가져 와서 후드 안에 넣기 전에 70 % 에탄올을 뿌리십시오.
   3. 한 손으로 마우스를 잡고 다른 손을 사용하여 복부 부위를 위에서 아래로 부드럽게 마사지하십시오.
   4. 1.5 mL 튜브 또는 피펫을 사용하여 소변을 직접 수집하거나 샘플이 떨어지면 플라스틱 시....

결과

이 프로토콜은 루푸스 신장염에 대한 MRL / lpr 마우스를 평가하기 위해 여러 가지 방법을 사용합니다. 첫째, 시간이 지남에 따라 신장 기능 장애로 인한 단백뇨 수치 증가를 연구하는 절차가 설명됩니다. 도 1에 나타난 바와 같이, 암컷 마우스는 대조군으로 200 μL의 인산완충식염수(1x PBS)를, 프로바이오틱 락토바실러스 루테리를 처리군으로 10⁹ cfu/mL의 농도로 1?.......

토론

LN은 SLE 환자에서 사망의 주요 원인이며, 질병을 악화시키는 요인은 불분명하다. 이 프로토콜의 적용은 단백뇨의 측정, 단리된 신장 백혈구의 FACS 분석, 냉동 신장 절편의 면역 형광 염색을 포함한 여러 방법을 사용하여 신장 기능을 특성화하는 것입니다.

소변을 수집하는 동안 고려해야 할 한 가지 중요한 점은 하루 중 시간 및 소변 수집 위치와 일치해야한다는 것입니다. 마?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Tris-Buffered Saline (TBS)	Thermo Fisher Scientific	J60764.K2
2-mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	21985-023
Anti-Human/Mouse C3	Cedarlane	CL7632F
Anti-Mouse CD138 BV711	Biolegend	142519
Anti-Mouse CD45 AF700	Biolegend	103127
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9418-100G
Collagenase D	Sigma-Aldrich	11088882001
Confocal Microscope LSM 880	Zeiss	LSM 880
Coplin jar	Fisher Scientific	50-212-281
Cryomold	Fisher Scientific	NC9511236
Density gradient medium	GE Healthcare	17-1440-02	Percoll
DEPC-Treated water	Thermo Fisher Scientific	AM9906
DNase I	Sigma-Aldrich	D4527
dsDNA-EC	InvivoGen	tlrl-ecdna
Ethylenediaminetetraacetic Acid	Fisher Scientific	S311-500	EDTA
EVOS M5000 Microscope imaging system	Thermo Fisher Scientific	AMF5000
FACS Fusion Cell sorter	BD Biosciences	FACS Fusion
Fetal Bovine Serum - Premium, Heat Inactivated	R&D systems	S11150H
Fisherbrand 96-Well Polystyrene Plates	Fisher Scientific	12-565-501
Graphpad prism	GraphPad	N/A
Hank’s Balanced Salt Solution	Thermo Fisher Scientific	14175-079
HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630-080
ImageJ software	National Institutes of Health	N/A
Lactobacillus reuteri Kandler et al.	ATCC	23272
MEM non-essential amino acids	Thermo Fisher Scientific	11140-050
MRL/MpJ-Fas lpr /J Mice (MRL/lpr)	Jackson Lab	485
Nail enamel	N/A	N/A	Any conventional store
O.C.T compound	Tisse-Tek	4583
PAP pen	Sigma-Aldrich	Z377821
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds	Polysciences	R-30
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-122
Phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	70011069
Pierce 20x TBS Buffer	Thermo Fisher Scientific	28358
Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay kit	Thermo Fisher Scientific	23236	Albumin standard included
ProLon Gold Antifade Mountant	ThermoFisher	P36934
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32	BD Biosciences	553141	FcR block
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	11875-093
Sodium pyruvate	Thermo Fisher Scientific	11360-070
SpectraMax M5	Molecular Devices	N/A	SoftMax Pro 6.1 software
Sterile cell Strainers 100 µM	Fisher Scientific	22363549
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-500
Vancomycin Hydrochloride	Goldbio	V-200-1
Zombie Aqua	Biolegend	423102	fluorescent dye for flow cytometry analysis