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摘要

这里的方案表明，可以使用尺寸排阻色谱从条件细胞培养基中充分分离细胞外囊泡。

摘要

细胞外囊泡（EV）是纳米大小的脂膜结合结构，从所有细胞释放，存在于所有生物流体中，并含有蛋白质，核酸和脂质，这些蛋白质，核酸和脂质反映了它们来源的母细胞。将EV与样品中的其他成分适当分离可以表征其相关货物，并深入了解它们作为细胞间通讯剂和多种疾病的非侵入性生物标志物的潜力。在目前的研究中，使用最先进的技术（包括超滤和体积排阻色谱（SEC））从细胞培养基中分离出少突胶质细胞衍生的EV，以将EV与其他细胞外蛋白质和蛋白质复合物分离。使用市售的SEC色谱柱，在对照和内质网（ER）应激条件下，将EVs与人少突胶质瘤细胞释放的细胞外蛋白分离。在分数 1-4 中观察到典型的 EV 标记 CD9、CD63 和 CD81，但在分数 5-8 中未观察到。高尔基体的一种蛋白质GM130和ER的整合蛋白calnexin被用作负EV标志物，并且未在任何部分中观察到。此外，当汇集和浓缩级分 1-4 作为 EV 级分，级分 5-8 作为蛋白质级分时，观察到 EV 级分中 CD63、CD81 和 CD9 的表达。在两种馏分类型中均未观察到GM130或钙连接蛋白的表达。使用透射电子显微镜观察来自对照和ER应力条件的混合级分，并且在EV级分中观察到囊泡，但在蛋白质级分中未观察到囊泡。两种条件下的EV和蛋白质级分中的颗粒也通过纳米颗粒跟踪分析进行定量。这些数据共同表明，SEC是从条件细胞培养基中分离EV的有效方法。

引言

对研究细胞外囊泡（EVs）的兴趣激增，伴随着用于分离和研究这些纳米大小的异质颗粒的技术和技术的重大进步。自近四十年前发现以来1，2，这些小膜结构被发现含有生物活性脂质，核酸和蛋白质，并在细胞间通讯中起主要作用3，4。EV从所有细胞类型中释放出来，因此存在于所有生物体液中，包括血浆和血清，唾液和尿液。这些液体中的电动汽车有望作为各种疾病的非侵入性生物标志物，包括神经炎症和神经退行性疾病、癌症和自身免疫性疾病5，6，7。此外，体外机理研究可以通过细胞培养技术通过分离释放到培养基中的EV来进行3，8，9。

要了解 EV 在疾病病理生理学中的作用，与发现它们的液体充分分离至关重要。长期以来，EV分离的黄金标准一直是差示超速离心（dUC）10，但是已经出现了更复杂的技术来实现EV与其他细胞外成分的更好分离。其中一些技术包括密度梯度、不对称流场流分数 （A4F）、流式细胞术、免疫捕获、聚乙二醇沉淀和体积排阻色谱 （SEC）11，12，13。每种技术都有自己的一套优点和缺点;然而，SEC尤其被证明可以非常有效地将EV从生物体液和细胞培养上清液中分离出来8，14，15。SEC还有一个额外的好处，即相对简单和用户友好。

SEC是一种根据尺寸分离流体成分的方法。使用这种技术，使用树脂柱（内部制造或商业购买）对样品进行分馏。样品中的小颗粒被困在树脂内的珠子之间，而较大的颗粒能够更自由地通过树脂，从而在过程中更早地洗脱。由于 EV 的尺寸大于许多细胞外蛋白和蛋白质聚集体，因此 EV 比细胞外蛋白更快地通过色谱柱并洗脱更早的馏分14。

在该方法论文中，概述了在对照和内质网（ER）应激条件下使用SEC从细胞培养基（CCM）中分离人少突胶质细胞的EV。使用该协议，表明用该技术分离的EV存在于特定的部分中，这些部分可以汇集在一起并浓缩以进行下游表征，并且分离的EV来自细胞而不是外源，例如胎牛血清（FBS）用于补充CCM。蛋白质印迹法证明 EV 级分中存在典型的 EV 标志物 CD63、CD81 和 CD916、17、18、19，蛋白质级分中不存在这些标志物。使用透射电子显微镜（TEM），EV被可视化并显示预期的形态，并且仅在EV部分中观察到。在对照和ER应力条件下的EV和蛋白质级分中也计数颗粒，并且在EV样品中观察到直径为50-200nm的预期尺寸范围内的大量颗粒。这些数据共同支持了SEC是从细胞培养基中分离EV的高效方法的观点。

研究方案

1. 缓冲液和试剂的制备

注意:在细胞培养罩中制作细胞培养试剂以保持无菌。

  1. 细胞培养试剂的制备
    1. 通过将50mL FBS和5mL青霉素链球菌（Pen-Strep）加入500 mL高葡萄糖DMEM中并储存在4°C来制备正常的高葡萄糖DMEM。 使用该培养基培养和扩增细胞。
    2. 通过将 50 mL 去除外泌体的 FBS 和 5 mL 笔链球菌加入 500 mL 高葡萄糖 DMEM 中制备外泌体去除的高葡萄糖 DMEM，并储存在 4 °C。 在EV分离之前使用该培养基进行细胞处理。
    3. 通过将 10 mg tunicamycin 加入 1 mL 二甲基亚砜 （DMSO） 来制备图尼霉素。在 0.2 mL 管中制作 50 μL 等分试样，并储存在 -20 °C。
  2. EV分离试剂的制备
    1. 通过在 1 L 量筒中将 9.89 g PBS 粉末添加到 1 L 去离子 （DI） 水中来制备 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）。在搅拌板上搅拌溶液，直到PBS溶解。
    2. 在添加PBS之前，使用高压灭菌器对玻璃器皿进行消毒。将玻璃器皿放入垃圾箱，关上门，在121°C下灭菌30分钟。
    3. 在层流柜内，将真空连接到0.22μm过滤器，并将过滤器放在高压灭菌瓶的顶部。慢慢将PBS倒入过滤器上，并将过滤后的PBS收集在高压灭菌的瓶中。
    4. 通过在 500 mL 量筒中将 9.99 g 氢氧化钠加入 500 mL 的 1x PBS 中来制备 0.5 M 氢氧化钠。在搅拌板上搅拌溶液，直到氢氧化钠溶解到PBS中，然后使用0.22μm过滤器过滤到高压灭菌的500mL瓶中。
    5. 通过在 500 mL 量筒中将 0.25 g 叠氮化钠加入 500 mL 的 1x PBS 中来制备 0.05% 叠氮化钠。在搅拌板上搅拌溶液，直到叠氮化钠溶解到PBS中，然后使用0.22μm过滤器过滤到高压灭菌的500mL瓶中。
  3. 蛋白质分离、定量和鉴定试剂的制备
    1. 通过混合 1 mL 1 M Tris （pH 7.4）、1 mL 10% 十二烷基硫酸钠 （SDS）、1 g 脱氧胆酸盐、1 mL NP-40 和 0.89 g 氯化钠 （NaCl） 制备 100 mL RIPA 裂解缓冲液。用蒸馏的H2O将体积降至100mL，并储存在4°C。 要制备 RIPA 加磷酸酶和蛋白酶抑制剂溶液，请在 15 mL 管中每 1 mL RIPA 缓冲液中加入 10 μL 磷酸酶和蛋白酶抑制剂，并将溶液储存在 4 °C。
    2. 使用前，将 BCA 检测试剂盒提供的 10 mL 试剂 A 和 200 μL 试剂 B 加入 15 mL 管中，制备 BCA 检测工作试剂。使用前，通过将 25 份试剂 A、24 份试剂 B 和 1 份试剂 C 加入 15 mL 管中来制备 microBCA 测定工作试剂。
    3. 通过在 1 L 去离子水中加入 30.3 g Tris 碱、144 g 甘氨酸和 10 g SDS 来制备 10x 凝胶电泳电泳缓冲液。将电泳缓冲液储存在4°C。 通过加入 3.03 g Tris 碱、14.4 g 甘氨酸和 200 mL 甲醇制备 1x 转膜缓冲液，并用去离子水将体积调节至 1 L。将转印缓冲液储存在4°C。
    4. 将 2.4 克 Tris 碱、8 克 NaCl 和 1 mL 吐温-20 加入 1 L 去离子水中，用吐温-20 （TBS-吐温） 制备 Tris 缓冲盐水。将TBS-吐温储存在4°C。
    5. 通过将 5 g 脱脂奶粉加入 100 mL TBS-吐温中来制备 5% 封闭溶液。将封闭缓冲液储存在4°C。
    6. 使用前，通过将 4 mL 过氧化物溶液和 4 mL 鲁米诺/增强剂溶液加入 15 mL 管中并轻轻倒置以混合来制备化学发光底物。

2. 培养和处理细胞

  1. 接种两个 T175 细胞培养瓶，每个培养瓶含有 2.3 x 106 个人少突胶质细胞瘤 （HOG） 细胞。将正常高葡萄糖DMEM的最终体积降至25mL，并在37°C下与5%CO2 在细胞培养箱中孵育48小时。
  2. 在48小时结束时，在37°C水浴中加热外泌体耗尽的高葡萄糖DMEM。对于治疗，将 25 μL 的 10 mg/mL 图尼卡霉素加入 25 mL 的去除外泌体培养基中，终浓度为 10 μg/mL 的图尼霉素以诱导 ER 应激。对照组，将 25 μL DMSO 加入 25 mL 外泌体去除培养基中。
  3. 从细胞中取出并处理正常的高葡萄糖DMEM，并用10mL的1x PBS轻轻冲洗细胞和烧瓶。吸出并丢弃 PBS。
  4. 将25 mL对照培养基加入标有对照的烧瓶中，将25 mL 10 μg/mL图尼霉素的培养基加入标示处理的烧瓶中。将烧瓶放回细胞培养箱24小时。

3. 条件CCM的收集和浓缩（图1）

  1. 将PBS置于37°C水浴中。在具有10x和100x物镜的复合显微镜下观察烧瓶。记下烧瓶之间的任何差异。对对照和处理过的烧瓶执行以下步骤。
  2. 从烧瓶中取出培养基并放入 50 mL 管中。在4°C下以500× g 离心管5分钟。 将上清液转移到新的 50 mL 管中。
  3. 将管在4°C下以2，000× g 离心20分钟。 将上清液转移到新的 50 mL 管中并置于冰上。
  4. 获得四个 15 mL 3 kDa 截止超滤单元，并向每个管中加入 5 mL PBS。通过在4°C下以4，000× g 离心超滤单元10分钟来启动过滤器。
    注意:当前方案中使用3 kDa截止分子量超滤单元来保留从细胞释放的所有细胞外蛋白。较大的分子量截止超滤单元（例如，30 kDa）也可以使用该协议，但是小于30 kDa的细胞外蛋白将被过滤并从样品中去除20，21。
  5. 从超滤装置中取出PBS。将每种条件（对照和妥尼霉素处理）的上清液分成两个超滤单元，每个单元中约12.5mL培养基。
  6. 在4°C下以4，000× g 离心管1小时45分钟，或直到每个超滤单元中的浓缩培养基（称为截留物）浓缩至250μL或更少。
  7. 将两个对照超滤单元的截留物转移到一个标记的 1.5 mL 微量离心管中。将截留物从两个处理过的超滤单元转移到另一个标记的 1.5 mL 微量离心管中。
  8. 测量每个微量离心管中截留物的总体积为 500 μL。如果样品小于 500 μL，则加入 0.22 μm 过滤的 1x PBS，直到最终体积为 500 μL。 将试管放入-80°C冰箱中。

4. 细胞采集

  1. 将胰蛋白酶，PBS和外泌体去除的DMEM置于37°C水浴中。向对照和处理过的烧瓶中加入7mL胰蛋白酶，并置于培养箱中5分钟。
  2. 在显微镜下观察细胞是否被提升。如果细胞没有被提起，用手掌用力敲击烧瓶以移开细胞。
  3. 用 7 mL 外泌体去除的 DMEM 洗涤烧瓶。从烧瓶中收集细胞悬液并放入 15 mL 管中。
  4. 在4°C下以500× g 离心管10分钟。 取出上清液，向细胞沉淀中加入 5 mL 的 1x PBS。轻轻移液混合物以分解沉淀。
  5. 在4°C下以500× g 离心管5分钟。 取出上清液，将 200 μL RIPA 加磷酸酶和蛋白酶抑制剂溶液加入细胞沉淀中，移液器混合。
  6. 将 RIPA 溶液中的细胞转移到 1.5 mL 管中。让试管在冰上静置5分钟。将试管在4°C下以14，000× g 离心10分钟。
  7. 将上清液转移到新的 1.5 mL 管中。在试管上标记治疗条件和日期。将试管放入-80°C冰箱中。
    注意:协议可以在此处暂停。

5. 使用体积排阻色谱法进行EV分离（图2）

注意:执行以下步骤两次，一次用于对照截留物，一次用于图尼霉素处理的截留物。
注意:本节中使用的PBS是0.22μm过滤的1x PBS。

  1. 打开自动馏分收集器 （AFC） 并调整设置以收集 8 个馏分，每个馏分 0.5 mL，缓冲液（空）体积为默认值。
    注意:AFC操作条件如下:色谱柱/床体积= 10 mL;空隙体积 = 2.70 mL;冲洗体积 = 15 mL;最佳馏分大小 = 500 μL;每次运行所需的缓冲液 = 65 mL;20 °C 时的流速 = 1.0 mL/min;列的可重用性 = 五种用途。
  2. 从4°C取出色谱柱（参见材料表），并在开始前让色谱柱升温至室温（通常~30分钟）。
  3. 从-80°C冰箱中取出截留样品，放在冰上解冻。在等待期间，将八个标记的 1.5 mL 管放在 AFC 转盘中，盖子朝内。
  4. 将列插入AFC，条形码面向阅读器。按照屏幕上的说明开始收集，以验证转盘中是否有管子以及废物收集器是否正常工作。
  5. 在储存缓冲液完全吸收到色谱柱基质的顶部后，通过向色谱柱中加入15 mL 的1x PBS开始冲洗色谱柱。不要过早添加PBS，因为这会稀释存储缓冲液并防止充分冲洗。
  6. 在15 mL PBS全部被基质吸收之前，单击 OK 停止冲洗，并用微量移液器从柱基质顶部去除任何残留的PBS。请勿触摸矩阵。
  7. 将 500 μL 样品添加到色谱柱中心。单击" 确定 "开始运行。观察样品吸收到基质中，并在样品完全吸收后立即向色谱柱中快速加入8 mL PBS。
  8. AFC将自动将空隙体积分散到转盘的中心，然后收集所有8个馏分，每个500μL。在运行结束时，从旋转木马中取出部分并放在冰上。馏分 1-4 含有 EV，而馏分 5-8 含有细胞外蛋白。移除轮播中心的空白空间。
  9. 收集八个馏分后，向色谱柱中加入10 mL PBS，以洗涤色谱柱中的任何残留样品。截留物样品通过色谱柱完全冲洗后，向色谱柱中加入 15 mL 的 1x PBS。
  10. 当最终PBS被基质吸收时，在色谱柱基质的中心加入500 μL的0.5 M氢氧化钠。当氢氧化钠被吸收时，向色谱柱中加入 30 mL 的 1x PBS 并使其冲洗通过。
  11. 如果运行其他样品，将八个标记的 1.5 mL 微量离心管添加到转盘中，然后重复步骤 5.7-5.10。
  12. 完成所有样品后，请完成以下步骤以保留色谱柱供以后使用。如步骤5.10所述，通过色谱柱冲洗30 mL PBS后，向色谱柱中加入15 mL 0.05%叠氮化钠。
  13. 在柱基质顶部留下约5 mL叠氮化钠。从AFC上取下色谱柱并安装顶部和底部盖子。将色谱柱放回4°C进行储存（色谱柱最多可使用五次）。

6. 电动汽车和蛋白质馏分的超滤

  1. 每个样品获得两个 2 mL、3 kDa 截止超滤单元。使用一个单位浓缩EV级分（馏分1-4），另一个单位浓缩蛋白质级分（馏分5-8）。每个单元由三部分组成:锥体、过滤器和流通缸;正确标记每个部分。
  2. 构建超滤单元，并向过滤器部分加入 1 mL 的 0.22 μm 过滤 1x PBS 并用锥形片盖上盖子。离心超滤装置，锥面在4°C下以3，500× g 向上10分钟。
  3. 从流通式气缸中取出过滤后的PBS。将超滤单元倒置（锥面朝下），并在4°C下以1，000× g 离心2分钟。 从锥体中取出所有剩余的 PBS。
  4. 向每个超滤单元（总体积为 2 mL）中加入适当的馏分（整个 500 μL 体积）。在4°C下以3，500× g 离心柱锥面朝上1小时45分钟，或直到截留液水平为100μL。
  5. 拆通气缸并丢弃流通。将超滤单元倒置（锥面朝下），并在4°C下以1，000× g 离心2分钟。
  6. 将锥体中的截留物转移到标记的 1.5 mL 微量离心管中，并用 0.22 μm 过滤的 1x PBS 使每个样品体积达到 150 μL。将试管放入-80°C冰箱中。
    注意:协议可以在此处暂停。

7. 媒体控制

  1. 获得两个T175细胞培养瓶。标记一个烧瓶对照和另一个处理。在37°C水浴中温热的外泌体耗尽高葡萄糖DMEM。
  2. 将 25 μL 图尼霉素储备溶液 （10 mg/mL） 加入到 25 mL 培养基中，并放入标示处理的烧瓶中。将 25 μL DMSO 加入 25 mL 培养基中，并放入标有对照的烧瓶中。将烧瓶在细胞培养箱中保存24小时。
  3. 收集介质并按照步骤 3.2-3.8 中所述处理以分离 EV。随后，执行第 5 节和第 6 节中描述的所有步骤。

8. 蛋白质印迹

  1. 使用BCA测定从细胞裂解物和蛋白质组分中定量蛋白质
    注意:通过以下步骤对对照和妥尼霉素处理的样品进行蛋白质定量。
    1. 在冰上解冻裂解的细胞和蛋白质级分。为每个样品制作三个稀释管;1:2、1:10 和 1:100。
    2. 在 96 孔透明底测定板、25 μL 牛血清白蛋白 （BSA） 蛋白标准品和 25 μL 每种样品稀释液上一式三份上样。使用多通道移液器向每个含有标准品或样品的孔中加入 200 μL 工作试剂。
    3. 将板在37°C孵育30分钟，然后用读板器以562nm的吸光度读取板。计算每个样品中的蛋白质浓度，并确定获得20 μg蛋白质用于细胞裂解物和15 μg蛋白质用于蛋白质级分所需的样品体积。
  2. 使用微BCA测定法对EV级分进行蛋白质定量
    1. 在冰上解冻电动汽车样品。为每个样品进行两次稀释:1:50和1:100。
    2. 在 96 孔透明底测定板、100 μL BSA 蛋白标准品和 100 μL 每种样品稀释液上一式三份上样。使用多通道移液器向每个含有标准品或样品的孔中加入 100 μL microBCA 工作试剂。
    3. 将板在37°C孵育2小时，然后用读板器以562nm的吸光度读取板。计算每个样品中的蛋白质浓度，并确定获得 EV 级分的 15 μg 蛋白质所需的样品体积。
  3. 蛋白质印迹
    注意:蛋白质印迹方案的执行方式与22中所述类似，并按如下所述进行了修改。
    1. 使用制造商的说明，使用凝胶制作套件制作10%聚丙烯酰胺凝胶。
    2. 对于凝胶电泳，通过在 1.5 mL 管中合并 20 μg 蛋白质所需的细胞裂解物体积、5 μL 4x Laemmli 缓冲液和使总体积达到 20 μL 所需的 RIPA 缓冲液体积来制备细胞裂解物样品。
    3. 通过在 1.5 mL 管中将 15 μg 蛋白质、5 μL 4x Laemmli 缓冲液和 RIPA 缓冲液所需的样品体积合并至 20 μL 体积来制备 EV 和蛋白质级分样品。
    4. 通过在 1.5 mL 管中混合 15 μL 样品和 5 μL 4x Laemmli 缓冲液来制备培养基对照样品。
      注意:根据要使用的抗体，Laemmli缓冲液可能需要也可能不需要含有还原剂，例如50mM二硫苏糖醇（DTT）。
    5. 将所有样品在95°C下煮沸5分钟，将样品转移到冰中冷却，并以10，000×g短暂离心30秒，然后将样品放回冰中。
    6. 将凝胶添加到电泳槽中，并加入1x凝胶电泳电泳缓冲液。上样 15 μL 蛋白质分子量标准和 20 μL 样品。在200 V下运行凝胶30-50分钟，或直到样品到达凝胶底部，就在运行之前。
    7. 将蛋白质转移到具有1x转印缓冲液的PVDF膜中，在4°C下在100V下转移30分钟，或直到转印完成。补充图 1、补充图2和 补充图3 显示了转印完成后每个印迹的免染图像。
    8. 在室温下在摇床上将膜封闭在5%牛奶/ TBS-吐温中1小时。将膜在一抗溶液中在4°C的摇床上孵育过夜。 抗体稀释信息见 表1 。
    9. 第二天，去除一抗并在室温下在摇床上用TBS-吐温洗涤膜3x，每次5分钟。
    10. 在 5% 牛奶/TBS-吐温中制备适当的二抗。有关稀释信息，请参见 表1 。将二抗加入膜上，在室温下在摇床上孵育1小时，然后在室温下在摇床上用TBS-吐温洗涤3次5分钟。
    11. 将化学发光底物加入膜上，并在室温下在摇床上孵育5分钟。使用比色和化学发光分析的图像印迹。补充图 4、补充图5和 补充图6 显示了每个印迹的未裁剪图像。

9. 透射电镜成像

  1. 辉光放电23 400目碳/甲瓦涂层网格以去除碳氢化合物并使网格亲水。
  2. 向网格中加入 5 μL EV 或蛋白质级分样品。在室温下孵育网格3-5分钟。
  3. 用滤纸吸湿排汗去除多余的溶液。用 5 μL 纳米纯水清洗网格，并通过吸芯吸去除多余的网格。
  4. 涂上 5 μL 1% 乙酸铀酰水溶液，立即吸干。让网格干燥。在透射电子显微镜上以120 kV对网格进行成像，并使用带电偶器件相机捕获图像。

10. 纳米颗粒跟踪分析

  1. 从-80°C获取EV和蛋白质级分样品并在冰上解冻。
  2. 打开计算机和 NTA 仪器。打开NTA软件，它将开始自动初始化。
  3. 选择含有无颗粒水的适当泵，然后单击冲洗 仪器 以冲洗细胞。冲洗时，使用注射器将 10-20 mL 无颗粒水注入仪器前部的进样口，避免气泡。
  4. 将弹出细胞质量检查屏幕;单击 确定 ，细胞质量检查将开始。检查成功通过后，将出现自动对准弹出屏幕，指出:请用 100 nm 对准悬浮液填充细胞（稀释 1:250，000）。
    1. 通过将 10 mL 无颗粒水和 10 μL 100 nm 聚苯乙烯珠加入管中（1:1，000 稀释）来制备取向悬浮液的稀释 1。轻轻倒置混合。稀释1在4°C下的保质期为2-3天。
    2. 通过将 20 mL 无颗粒水和 80 μL 稀释液 1 （1:1，000） 加入试管中以产生 1:250，000 的稀释度，创建取向悬浮液的稀释液 2。轻轻倒置试管进行混合。稀释2在室温下的保质期为30-60分钟。
  5. 用 2 mL 稀释液 2 （1:250，000） 填充细胞。单击 "确定" ，程序将完成自动对齐（对焦）和对焦优化。分析选项卡将打开，创建一个配置文件，该配置文件提供抛物线中测量单元的清洁度和对称性的结果。将出现一个弹出屏幕，指出:查看视频显微镜现已准备好进行实验;单击 "确定" ，程序将返回到单元格检查选项卡。
  6. 通过将无颗粒水注入注射口以清洗细胞，从细胞中冲洗聚苯乙烯珠。继续洗涤，直到检测到的颗粒数量在 0-10 之间（通常在 5-10 mL 之间）。加入 1 mL 的 0.22 μm 过滤 PBS 以为第一个样品启动细胞。
  7. 用0.22μm过滤的PBS稀释第一个样品（从1:1000稀释开始），并将稀释因子输入程序。将 1 mL 样品插入池中并等待 5 分钟以使颗粒移动减慢，因为它们最初会在屏幕上非常快速地移动。将感光度和快门分别设为75.0和100。
  8. 理想样品稀释的检测到的颗粒数为50-200个颗粒。如果报告低于 50 或高于 200 个颗粒，请调整样品的稀释度。如果需要新的稀释液，请用无颗粒水洗涤细胞，直到检测到0-10个颗粒。重复加入稀释的样品并洗涤，直到找到理想的稀释度。
  9. 检查所有 11 个相机位置，以可视化粒子移动已减慢，并确保检测到的粒子数量在所有相机位置之间相似。如果不同相机位置的粒子数量差异很大，请添加更多样本。
  10. 单击 测量 选项卡并 运行视频采集。在视频采集选项卡下，输入样本的自定义名称并确定安全位置。选中 自动保存.txt 和自动 保存.pdf 框以保存数据。
  11. 将温度设置为 25 °C，单击 488 nm 设置激光，然后单击 11 查看相机位置。单击" 确定 "运行数据收集。该程序将开始分析所有11个位置的颗粒数量和大小。在分析选项卡下，将显示一个条形图，其中直径/nm 在 x 轴上，颗粒/mL 在 y 轴上。
  12. 收集数据后，将出现一个标题为"职位概览"的弹出屏幕，提供 11 个职位中每个职位的数据。如果从分析中移除了两个以上的位置，请对更多样品重复该过程。如果没有，请单击 "继续" 按钮。将打开一个包含结果的 PDF 和 txt 文件。将文件保存在安全的位置。
  13. 若要运行另一个示例，请转到 "单元格检查 "选项卡并重复步骤 10.6 到 10.12。如果完成，用无颗粒水洗涤细胞，直到检测到的颗粒数量为 0-10（约 5-10 mL）。用 1 mL 的 0.22 μm 过滤 PBS 冲洗细胞，关闭程序，然后关闭计算机。

结果

蛋白质印迹显示EV与CCM充分分离
为了评估SEC从细胞培养基中分离EV的有效性，使用对照样品中的每个单独级分进行蛋白质印迹，以检测三种典型EV标志物CD9，CD63和CD81以及用作阴性对照的GM130和calnexin18的表达（图3）。还研究了白蛋白表达18 ，以确保CCM中的细胞外蛋白可以与EV充分分离。在馏分 1-4 中观察到 CD9、CD63 和 CD81 的强...

讨论

SEC是一种用户友好的方法，用于将EV与条件CCM充分分离。为了特异性分离细胞衍生的EV，必须仔细考虑CCM的类型及其补充剂。许多细胞培养基需要补充FBS，FBS含有来自收获血清的动物的EV。这些血清 EV 可能会饱和并掩盖源自培养细胞的 EV 产生的任何信号26。因此，在进行实验时，应尽可能使用EV耗尽的FBS，以确保发现的EV可以归因于细胞衍生的EV，而不是牛衍生的EV，这可以商业购?...

披露声明

作者声明不存在利益冲突。

致谢

作者要感谢宾夕法尼亚州立大学贝伦德和哈莫特健康基金会的资助，以及宾夕法尼亚州大学公园的宾夕法尼亚州立大学显微镜设施。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
2-MercaptoethanolVWR97064-588
4X Laemmli Sample BufferBioRad1610747
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit, Ultracel, 3 KDa, 15mLSigma-AldrichUFC9003083 kDa cutoff
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membraneSigma-AldrichUFC2003243 kDa cutoff
Ammonium PersulfateSigma-AldrichA3678-100G
Anti rabbit IgG, HRP linked AntibodyCell Signaling Technology7074V1:1000 Dilution
Anti-Calnexin antibodyAbcam ab225951:500 Dilution
Anti-CD9 Mouse Monoclonal AntibodyBioLegend3121021:500 Dilution
Anti-GM130 antibody [EP892Y] - cis-Golgi MarkerAbcamab526491:500 Dilution
Anti-mouse IgG, HRP-linked AntibodyCell Signaling Technology7076V1:1000 Dilution
Automatic Fraction CollectorIzon Science
BCA assay KitBio-Rad
CCD cameraGatan Orius SC200
Cd63 Mouse anti HumanBD5560191:1000 Dilution
CD81 AntibodySanta Cruz Biotechnologysc-239621:1000 Dilution
Cellstar Filter Cap Cell Culture FlasksGreiner Bio-One660175
ChemiDoc MP ImagerBioRad
Clarity Western ECL SubstrateBioRad1705061
deoxycholateSigma-AldrichD6750-10G
dithiothreitolSigma3483-12-3
DMEM/High glucose with L-glutamine; without sodiumCytivaSH300022.FS
Fetal Bovine Serum Premium gradeVWR97068-085
Fetal Bovine Serum, exosome-depletedThermo ScientificA2720801
GlycineBioRad1610718
Great Value Nonfat Dry MilkAmazonB076NRD2TZ
HOG Human Oligodendroglioma Cell LineSigma-AldrichSCC163
Izon Science Usa Ltd qev Size Exclusion Columns 5pkIzon Science
Methanol >99.8% ACSVWRBDH1135-4LP
Mini-PROTEAN Glass platesBioRad1653310with 0.75mm spacers
Mini-PROTEAN Short platesBioRad1653308
NP-40Sigma-Aldrich492016
Penicillin-Streptomycin,SolutionSigma-AldrichP4458-100mL
Phosphate Buffered Saline PBSFisher ScientificBP66150
Pierce BCA Protein Assay Kits and ReagentsThermo Fisher Scientific23227
Pierce PVDF Transfer MembranesThermo Scientific88518
Pierce Western Blotting Filter PaperThermo Scientific84783
Polyoxyethylene-20 (TWEEN 20), 500mLBio BasicTB0560
Protease/phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)Cell Signaling Technology5872S
Recombinant Anti-TSG101 antibody [EPR7130(B)]ABCamab1250111:1000 dilution
Slodium hydroxideSigma-AldrichSX0603
Sodium azideFisher ScientificBP922I-500
Sodium ChlorideSigma-AldrichS9888-500G
Sodium dodecyl sulfate,≥99.0% (GC), dust-free pelletsSigma-Aldrich75746-1KG
TetramethylethylenediamineSigma-AldrichT9281-25ML
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 10%BioRad1610183
Transmission Electron MicroscopeFEI Tecnai 12 Biotwin
TrisBioRad1610716
Trypsin 0.25% protease with porcine trypsin, HBSS, EDTA; without calcium, magnesiumCytivaSH30042.01
TunicamycinTocris3516
Zeta View softwareAnalytikNTA software

参考文献

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