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Resumen

El protocolo aquí demuestra que las vesículas extracelulares pueden separarse adecuadamente de los medios de cultivo celular condicionados utilizando cromatografía de exclusión de tamaño.

Resumen

Las vesículas extracelulares (EV) son estructuras unidas a la membrana lipídica de tamaño nanométrico que se liberan de todas las células, están presentes en todos los biofluidos y contienen proteínas, ácidos nucleicos y lípidos que reflejan la célula madre de la que se derivan. La separación adecuada de los EV de otros componentes en una muestra permite la caracterización de su carga asociada y brinda información sobre su potencial como comunicadores intercelulares y biomarcadores no invasivos para numerosas enfermedades. En el estudio actual, los EV derivados de oligodendrocitos se aislaron de medios de cultivo celular utilizando una combinación de técnicas de vanguardia, incluida la ultrafiltración y la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) para separar los EV de otras proteínas extracelulares y complejos de proteínas. Utilizando columnas SEC disponibles comercialmente, los EV se separaron de las proteínas extracelulares liberadas de las células de oligodendroglioma humano bajo condiciones de estrés de retículo endoplásmico (RE) y de control. Los marcadores canónicos de EV CD9, CD63 y CD81 se observaron en las fracciones 1-4, pero no en las fracciones 5-8. GM130, una proteína del aparato de Golgi, y calnexina, una proteína integral del RE, se utilizaron como marcadores EV negativos, y no se observaron en ninguna fracción. Además, al agrupar y concentrar las fracciones 1-4 como la fracción EV, y las fracciones 5-8 como la fracción de proteína, se observó la expresión de CD63, CD81 y CD9 en la fracción EV. La expresión de GM130 o calnexina no se observó en ninguno de los tipos de fracción. Las fracciones agrupadas de las condiciones de estrés de control y ER se visualizaron con microscopía electrónica de transmisión y se observaron vesículas en las fracciones EV, pero no en las fracciones de proteínas. Las partículas en el EV y las fracciones de proteínas de ambas condiciones también se cuantificaron con análisis de seguimiento de nanopartículas. Juntos, estos datos demuestran que SEC es un método eficaz para separar los EV de los medios de cultivo celular condicionados.

Introducción

La explosión de interés en el estudio de vesículas extracelulares (EV) ha ido acompañada de importantes avances en las tecnologías y técnicas utilizadas para separar y estudiar estas partículas heterogéneas de tamaño nanométrico. En el tiempo transcurrido desde su descubrimiento hace casi cuatro décadas1,2, se ha encontrado que estas pequeñas estructuras membranosas contienen lípidos bioactivos, ácidos nucleicos y proteínas, y desempeñan un papel importante en la comunicación intercelular 3,4. Los EV se liberan de todos los tipos de células y, por lo tanto, están presentes en todos los fluidos biológicos, incluidos el plasma sanguíneo y el suero, la saliva y la orina. Los EV dentro de estos fluidos son muy prometedores para servir como biomarcadores no invasivos para diversas enfermedades, incluidas enfermedades neuroinflamatorias y neurodegenerativas, cánceres y trastornos autoinmunes 5,6,7. Además, se pueden realizar estudios mecanicistas in vitro mediante técnicas de cultivo celular separando las EV liberadas en el medio de cultivo 3,8,9.

Para comprender el papel de las EV en la fisiopatología de la enfermedad, es primordial una separación adecuada del líquido en el que se encuentran. El estándar de oro para la separación de EV ha sido durante mucho tiempo la ultracentrifugación diferencial (dUC)10, sin embargo, han surgido técnicas más sofisticadas para lograr una mejor separación de los EV de otros componentes extracelulares. Algunas de estas técnicas incluyen gradientes de densidad, fracción de flujo de campo asimétrico (A4F), citometría de flujo, inmunocaptura, precipitación de polietilenglicol y cromatografía de exclusión de tamaño (SEC)11,12,13. Cada técnica tiene su propio conjunto de ventajas y desventajas; sin embargo, se ha demostrado que la SEC en particular separa los EV de los fluidos biológicos y los sobrenadantes de cultivo celular de manera bastante efectiva 8,14,15. SEC también tiene la ventaja adicional de ser relativamente sencillo y fácil de usar.

SEC es un método que separa los componentes de un fluido en función del tamaño. Con esta técnica, se utiliza una columna de resina (ya sea hecha internamente o comprada comercialmente) para fraccionar una muestra. Las partículas pequeñas en la muestra quedan atrapadas entre las perlas dentro de la resina, mientras que las partículas más grandes pueden pasar a través de la resina más libremente y, por lo tanto, eluir antes en el proceso. Debido a que los EV son más grandes en tamaño que muchas proteínas extracelulares y agregados de proteínas, los EV pasan a través de la columna más rápido y eluyen en fracciones más tempranas que las proteínas extracelulares14.

En este documento de métodos, se describe el uso de SEC para la separación de EV de medios de cultivo celular (CCM) de oligodendrocitos humanos bajo condiciones de estrés de retículo endoplásmico (RE) y control. Usando este protocolo, se muestra que los EV separados con esta técnica se encuentran dentro de fracciones específicas que pueden agruparse y concentrarse para la caracterización posterior, y que los EV separados se derivan de células y no de una fuente exógena como el suero bovino fetal (FBS) utilizado para complementar el CCM. La presencia de los marcadores canónicos de EV, CD63, CD81 y CD916,17,18,19 en las fracciones EV, y su ausencia en las fracciones proteicas se demuestra con western blotting. Usando microscopía electrónica de transmisión (TEM), los EV se visualizan y muestran la morfología esperada y solo se observan en la fracción EV. Las partículas también se cuentan en las fracciones EV y proteica de las condiciones de estrés de control y ER, y se observa un gran número de partículas dentro del rango de tamaño esperado de 50-200 nm de diámetro en las muestras EV. Juntos, estos datos apoyan la noción de que SEC es un método eficiente y efectivo para separar los EV de los medios de cultivo celular.

Protocolo

1. Preparación de tampones y reactivos

NOTA: Haga reactivos de cultivo celular en la campana de cultivo celular para mantener la esterilidad.

  1. Preparación de reactivos de cultivo celular
    1. Prepare el DMEM normal de glucosa alta agregando 50 ml de FBS y 5 ml de penicilina-estreptococo (Pen-Strep) en 500 ml de DMEM de glucosa alta y guárdelo a 4 °C. Utilice este medio para cultivar y expandir células.
    2. Prepare DMEM de glucosa alta sin exosomas agregando 50 ml de FBS sin exosomas y 5 ml de Pen-Strep en 500 ml de DMEM de glucosa alta y guárdelo a 4 °C. Utilice este medio para tratamientos celulares antes del aislamiento de EV.
    3. Prepare la tunicamicina agregando 10 mg de tunicamicina a 1 ml de dimetilsulfóxido (DMSO). Hacer 50 μL de alícuotas en tubos de 0,2 ml y almacenar a -20 °C.
  2. Preparación de reactivos de separación EV
    1. Prepare 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) agregando 9.89 g de polvo PBS a 1 L de agua desionizada (DI) en un cilindro graduado de 1 L. Revuelva la solución en una placa de agitación hasta que el PBS se disuelva.
    2. Utilice el autoclave para esterilizar la cristalería antes de añadir PBS. Coloque la cristalería en un contenedor, cierre la puerta y esterilice durante 30 minutos a 121 °C.
    3. Dentro de un gabinete de flujo laminar, conecte una aspiradora al filtro de 0,22 μm y coloque el filtro en la parte superior de la botella esterilizada en autoclave. Vierta lentamente el PBS en el filtro y recoja el PBS filtrado en la botella esterilizada en autoclave.
    4. Prepare 0,5 M de hidróxido de sodio añadiendo 9,99 g de hidróxido de sodio a 500 ml de 1x PBS en un cilindro graduado de 500 ml. Revuelva la solución en una placa de agitación hasta que el hidróxido de sodio se disuelva en el PBS y luego filtre con un filtro de 0,22 μm en una botella de 500 ml esterilizada en autoclave.
    5. Prepare azida de sodio al 0,05% agregando 0,25 g de azida de sodio a 500 ml de 1x PBS en un cilindro graduado de 500 ml. Revuelva la solución en una placa de agitación hasta que la azida de sodio se disuelva en el PBS, y luego filtre con un filtro de 0.22 μm en una botella de 500 ml esterilizada en autoclave.
  3. Preparación de reactivos de aislamiento, cuantificación e identificación de proteínas
    1. Prepare 100 ml de tampón de lisis RIPA combinando 1 ml de 1 M Tris (pH 7.4), 1 ml de dodecil sulfato de sodio (SDS) al 10%, 1 g de desoxicolato, 1 ml de NP-40 y 0.89 g de cloruro de sodio (NaCl). Llevar el volumen a 100 ml conH2Odestilado y almacenar a 4 °C. Para producir RIPA más solución de inhibidor de la fosfatasa y proteasa, añadir 10 μL de fosfatasa e inhibidor de la proteasa por cada 1 ml de tampón RIPA en un tubo de 15 ml y conservar la solución a 4 °C.
    2. Inmediatamente antes de su uso, prepare el reactivo de trabajo del ensayo BCA añadiendo 10 ml de reactivo A y 200 μL de reactivo B proporcionados por el kit de ensayo BCA en un tubo de 15 ml. Inmediatamente antes de su uso, prepare el reactivo de trabajo del ensayo de microBCA agregando 25 partes de reactivo A, 24 partes de reactivo B y 1 parte de reactivo C en un tubo de 15 ml.
    3. Prepare 10x electroforesis en gel agregando 30.3 g de base de Tris, 144 g de glicina y 10 g de SDS en 1 L de agua DI. Conservar el búfer en ejecución a 4 °C. Prepare 1x tampón de transferencia agregando 3.03 g de base de Tris, 14.4 g de glicina y 200 ml de metanol y ajuste el volumen a 1 L con agua DI. Conservar el búfer de transferencia a 4 °C.
    4. Prepare solución salina tamponada Tris con Tween-20 (TBS-Tween) agregando 2.4 g de Tris base, 8 g de NaCl y 1 ml de Tween-20 en 1 L de agua DI. Conservar el TBS-Tween a 4 °C.
    5. Prepare una solución bloqueante al 5% agregando 5 g de leche en polvo descremada a 100 ml de TBS-Tween. Conservar el tampón de bloqueo a 4 °C.
    6. Inmediatamente antes de usar, prepare el sustrato quimioluminiscente agregando 4 ml de solución de peróxido y 4 ml de solución de luminol/potenciador en un tubo de 15 ml e invierta suavemente para mezclar.

2. Cultivo y tratamiento de células

  1. Sembrar dos matraces de cultivo celular T175 con 2,3 x 106 células de oligodendroglioma humano (HOG) cada uno. Llevar el volumen final de DMEM normal de glucosa alta a 25 mL e incubar a 37 °C con 5% deCO2 en una incubadora de cultivo celular durante 48 h.
  2. Al final de las 48 h, DMEM alto de glucosa sin exosomas calientes en un baño de agua a 37 °C. Para el tratamiento, añadir 25 μL de 10 mg/ml de tunicamicina a 25 ml de medios sin exosomas, concentración final de 10 μg/ml de tunicamicina para inducir el estrés por RE. Para el control, agregue 25 μL de DMSO a 25 ml de medios sin exosomas.
  3. Retire y deseche el DMEM normal de glucosa alta de las células y enjuague suavemente las células y el matraz con 10 ml de 1x PBS. Aspirar y desechar PBS.
  4. Añadir 25 ml de medios de control en el matraz marcado como control, y 25 ml de 10 μg/ml de tunicamicina en medios en el tratamiento marcado con matraz. Devolver los matraces a la incubadora de cultivo celular durante 24 h.

3. Recolección y concentración de MCC condicionada (Figura 1)

  1. Colocar PBS en un baño maría a 37 °C. Observe los frascos bajo un microscopio compuesto con lente de objetivo 10x y 100x. Tome nota de cualquier diferencia entre los frascos. Realice los siguientes pasos tanto para el matraz de control como para los tratados.
  2. Retirar el medio del matraz y colocarlo en un tubo de 50 ml. Centrifugar el tubo a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 50 ml.
  3. Centrifugar el tubo a 2.000 x g durante 20 min a 4 °C. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 50 ml y colóquelo en hielo.
  4. Obtenga cuatro unidades de ultrafiltración de corte de 15 mL 3 kDa y agregue 5 mL de PBS a cada tubo. Prepare el filtro centrifugando las unidades de ultrafiltración a 4.000 x g durante 10 min a 4 °C.
    NOTA: Se utilizaron unidades de ultrafiltración de corte de peso molecular de 3 kDa en el protocolo actual para retener todas las proteínas extracelulares liberadas de las células. Las unidades de ultrafiltración de corte de peso molecular más grandes (por ejemplo, 30 kDa) también funcionarían con este protocolo, sin embargo, las proteínas extracelulares menores de 30 kDa se filtrarían y eliminarían de las muestras20,21.
  5. Retire PBS de las unidades de ultrafiltración. Divida el sobrenadante de cada condición (control y tunicamicina tratada) en dos unidades de ultrafiltración cada una, aproximadamente 12.5 mL de medios en cada una.
  6. Centrifugar los tubos a 4.000 x g durante 1 h 45 min a 4 °C, o hasta que el medio concentrado (denominado retentado) de cada unidad de ultrafiltración se concentre a 250 μL o menos.
  7. Transfiera el retén de ambas unidades de ultrafiltración de control a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml marcado. Transfiera el retentado de ambas unidades de ultrafiltración tratadas a otro tubo de microcentrífuga de 1,5 ml marcado.
  8. Medir el volumen total del retén en cada tubo de microcentrífuga para que sea de 500 μL. Si la muestra es inferior a 500 μL, añadir 0,22 μm filtrados 1x PBS hasta que el volumen final sea de 500 μL. Colocar los tubos en un congelador a -80 °C.

4. Recolección de células

  1. Coloque tripsina, PBS y DMEM sin exosomas en un baño de agua a 37 °C. Añadir 7 ml de tripsina tanto a los matraces de control como a los tratados y colocarlos en la incubadora durante 5 min.
  2. Ver bajo el microscopio para ver si las células se levantan. Si las células no se levantan, golpee firmemente el matraz contra la palma de la mano para desalojar las células.
  3. Lavar el matraz con 7 ml de DMEM sin exosomas. Recoger la suspensión celular del matraz y colocarla en tubos de 15 ml.
  4. Centrifugar los tubos durante 10 min a 500 x g a 4 °C. Retire el sobrenadante y agregue 5 ml de 1x PBS al pellet celular. Mezcle suavemente la pipeta para romper el pellet.
  5. Centrifugar los tubos a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Retire el sobrenadante y agregue 200 μL de RIPA más solución inhibidora de fosfatasa y proteasa a la gránula celular, pipeta a mezcla.
  6. Transfiera las células de la solución RIPA en tubos de 1,5 ml. Deje que los tubos reposen sobre hielo durante 5 minutos. Centrifugar los tubos a 14.000 x g durante 10 min a 4 °C.
  7. Transfiera el sobrenadante a nuevos tubos de 1,5 ml. Etiquete los tubos con la condición y la fecha del tratamiento. Colocar los tubos en un congelador a -80 °C.
    NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.

5. Separación de EV mediante cromatografía de exclusión de tamaño (Figura 2)

NOTA: Realice los siguientes pasos dos veces, una para el retén de control y otra para el retentado tratado con tunicamicina.
NOTA: El PBS utilizado en esta sección es 0.22 μm filtrado 1x PBS.

  1. Active el selector automático de fracciones (AFC) y ajuste la configuración para recopilar ocho fracciones, 0,5 ml por fracción y el volumen del búfer (vacío) a los valores predeterminados.
    NOTA: Las condiciones de funcionamiento del AFC son las siguientes: volumen de columna/lecho = 10 ml; volumen vacío = 2,70 ml; volumen de lavado = 15 ml; tamaño óptimo de la fracción = 500 μL; búfer requerido por ejecución = 65 ml; caudal a 20 °C = 1,0 ml/min; Reutilización de la columna = cinco usos.
  2. Retire la columna (consulte la Tabla de materiales) a 4 °C y deje que la columna se caliente a temperatura ambiente antes de comenzar (generalmente ~ 30 min).
  3. Retirar las muestras retenidas del congelador a -80 °C y colocarlas en hielo para descongelar. Mientras espera, coloque ocho tubos etiquetados de 1.5 ml en el carrusel AFC con las tapas hacia adentro.
  4. Inserte la columna en el AFC con el código de barras orientado hacia el lector. Comience la recolección siguiendo las instrucciones en pantalla para verificar que haya tubos en el carrusel y que el recolector de residuos funcione correctamente.
  5. Comience a vaciar la columna agregando 15 ml de 1x PBS a la columna después de que el búfer de almacenamiento se absorba completamente en la parte superior de la matriz de columna. No agregue PBS demasiado pronto, ya que esto diluirá el tampón de almacenamiento y evitará el lavado adecuado.
  6. Justo antes de que la matriz absorba todos los 15 ml de PBS, haga clic en Aceptar para detener el lavado y eliminar cualquier PBS residual de la parte superior de la matriz de columna con una micropipeta. No toque la matriz.
  7. Añadir 500 μL de muestra al centro de la columna. Haga clic en Aceptar para comenzar la ejecución. Observe cómo la muestra se absorbe en la matriz y agregue rápidamente 8 ml de PBS a la columna inmediatamente después de que la muestra se absorba por completo.
  8. AFC disipará automáticamente el volumen vacío en el centro del carrusel y luego recogerá las ocho fracciones de 500 μL cada una. Al final de la carrera, retire las fracciones del carrusel y colóquelas en hielo. Las fracciones 1-4 contienen EV, mientras que las fracciones 5-8 contienen proteínas extracelulares. Retire el volumen vacío del centro del carrusel.
  9. Agregue 10 ml de PBS a la columna después de que se hayan recolectado las ocho fracciones para lavar cualquier muestra residual de la columna. Después de que la muestra retenida se haya lavado completamente a través de la columna, agregue 15 ml de 1x PBS a la columna.
  10. A medida que el PBS final está siendo absorbido por la matriz, agregue 500 μL de hidróxido de sodio 0.5 M al centro de la matriz de la columna. A medida que se absorbe el hidróxido de sodio, agregue 30 ml de 1x PBS a la columna y déjela enjuagar.
  11. Si ejecuta otra muestra, agregue ocho tubos de microcentrífuga etiquetados de 1.5 ml al carrusel y repita los pasos 5.7-5.10.
  12. Una vez hecho con todas las muestras, complete los siguientes pasos para conservar la columna para su uso posterior. Después de enjuagar 30 ml de PBS a través de la columna como se describe en el paso 5.10, agregue 15 ml de azida de sodio al 0.05% a la columna.
  13. Deje aproximadamente 5 ml de azida de sodio en la parte superior de la matriz de la columna. Retire la columna del AFC y coloque las tapas superior e inferior. Vuelva a colocar la columna a 4 °C para guardarla (la columna se puede utilizar hasta cinco veces).

6. Ultrafiltración de EV y fracciones proteicas

  1. Obtener dos unidades de ultrafiltración de corte de 2 mL, 3 kDa por muestra. Use una unidad para concentrar las fracciones EV (fracciones 1-4) y la otra para concentrar las fracciones de proteína (fracciones 5-8). Cada unidad se compone de tres partes: cono, filtro y cilindro de flujo continuo; Etiquete cada parte correctamente.
  2. Construya la unidad de ultrafiltración y agregue 1 ml de 0.22 μm filtrado 1x PBS a la porción del filtro y la tapa con la pieza de cono. Centrifugar la unidad de ultrafiltración, con el lado cónico hacia arriba a 3.500 x g durante 10 min a 4 °C.
  3. Retire el PBS filtrado del cilindro de flujo continuo. Voltee la unidad de ultrafiltración boca abajo (con el lado cónico hacia abajo) y centrifugar durante 2 minutos a 1.000 x g a 4 °C. Retire cualquier PBS restante del cono.
  4. Agregue las fracciones apropiadas (el volumen total de 500 μL) a cada unidad de ultrafiltración (el volumen total será de 2 ml). Columnas de centrifugación con el lado cónico hacia arriba durante 1 h 45 min a 3.500 x g a 4 °C, o hasta que el nivel de retención esté en 100 μL.
  5. Retire el cilindro de flujo continuo y deseche el flujo a través. Voltee la unidad de ultrafiltración boca abajo (con el lado cónico hacia abajo) y centrifugar durante 2 minutos a 1.000 x g a 4 °C.
  6. Transfiera el retentado en el cono a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml marcado y lleve cada volumen de muestra a 150 μL con 0,22 μm filtrado 1x PBS. Colocar los tubos en un congelador a -80 °C.
    NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.

7. Controles de medios

  1. Obtener dos matraces de cultivo celular T175. Etiquetar un control del matraz y el otro el tratamiento. DMEM alto de glucosa sin exosomas calientes en un baño de agua a 37 °C.
  2. Añadir 25 μL de solución madre de tunicamicina (10 mg/ml) a 25 ml de medio y poner en el matraz el tratamiento etiquetado. Añadir 25 μL de DMSO a 25 ml de medio y poner en el matraz etiquetado como control. Mantener los matraces en una incubadora de cultivo celular durante 24 h.
  3. Recopile los medios y procese para separar los vehículos eléctricos como se describe en los pasos 3.2-3.8. Posteriormente, realice todos los pasos descritos en las secciones 5 y 6.

8. Western blot

  1. Cuantificación de proteínas a partir de lisados celulares y fracciones de proteínas con ensayo de BCA
    NOTA: La cuantificación de proteínas a partir de muestras de control y tratadas con tunicamicina se realiza con los siguientes pasos.
    1. Descongelar las células lisadas y las fracciones de proteínas en hielo. Hacer tres tubos de dilución para cada muestra; 1:2, 1:10 y 1:100.
    2. Cargar por triplicado en una placa de ensayo de fondo claro de 96 pocillos, 25 μL de patrones de proteína de albúmina sérica bovina (BSA) y 25 μL de cada dilución de muestra. Añadir 200 μL de reactivo de trabajo a cada pocillo que contenga patrón o muestra, utilizando una pipeta multicanal.
    3. Incubar la placa a 37 °C durante 30 min, luego leer la placa con un lector de placas a una absorbancia de 562 nm. Calcular la concentración de proteínas en cada muestra y determinar el volumen de muestra necesario para obtener 20 μg de proteína para lisados celulares y 15 μg de proteína para fracciones proteicas.
  2. Cuantificación de proteínas a partir de fracciones EV con ensayo de microBCA
    1. Descongele las muestras de EV en hielo. Haga dos diluciones para cada muestra: 1:50 y 1:100.
    2. Cargar por triplicado en una placa de ensayo de fondo claro de 96 pocillos, 100 μL de patrones de proteína BSA y 100 μL de cada dilución de muestra. Añadir 100 μL de reactivo de trabajo microBCA a cada pocillo que contenga patrón o muestra, utilizando una pipeta multicanal.
    3. Incubar la placa a 37 °C durante 2 h, luego leer la placa con un lector de placas a una absorbancia de 562 nm. Calcular la concentración de proteína en cada muestra y determinar el volumen de muestra necesario para obtener 15 μg de proteína para fracciones EV.
  3. Western blot
    NOTA: El protocolo Western blotting se realizó de manera similar a la descrita en22 y se modificó como se describe a continuación.
    1. Haga geles de poliacrilamida al 10% con un kit de fabricación de gel, siguiendo las instrucciones del fabricante.
    2. Para la electroforesis en gel, preparar muestras de lisado celular combinando en un tubo de 1,5 ml, el volumen de lisado celular necesario para 20 μg de proteína, 5 μL de tampón Laemmli 4x y el volumen de tampón RIPA necesario para llevar el volumen total a 20 μL.
    3. Preparar muestras de EV y fracción proteica combinando en un tubo de 1,5 ml el volumen de muestra necesario para 15 μg de proteína, 5 μL de tampón Laemmli 4x y tampón RIPA hasta un volumen de 20 μL.
    4. Preparar muestras de control de medios combinando en un tubo de 1,5 ml 15 μL de muestra y 5 μL de tampón Laemmli 4x.
      NOTA: Dependiendo de los anticuerpos que se utilicen, el tampón de Laemmli puede o no necesitar contener un agente reductor, como 50 mM de ditiothreitol (DTT).
    5. Hervir todas las muestras a 95 °C durante 5 minutos, transferir las muestras al hielo para que se enfríen y centrifugar brevemente durante 30 s a 10.000 x g, luego devolver las muestras al hielo.
    6. Agregue geles al tanque de electroforesis y agregue 1x tampón de ejecución de electroforesis en gel. Carga 15 μL de escalera proteica y 20 μL de muestra. Pase el gel a 200 V durante 30-50 minutos, o hasta que las muestras hayan llegado al fondo del gel, justo antes de escurrir.
    7. Transfiera la proteína a una membrana de PVDF con tampón de transferencia 1x a 4 °C durante 30 min a 100 V, o hasta que se complete la transferencia. La Figura Suplementaria 1, la Figura Suplementaria 2 y la Figura Suplementaria 3 muestran imágenes sin manchas de cada mancha después de completar la transferencia.
    8. Bloquear la membrana en leche al 5% / TBS-Tween durante 1 h a temperatura ambiente en una coctelera. Incubar la membrana en solución de anticuerpos primarios durante la noche en un agitador a 4 °C. Consulte la Tabla 1 para obtener información sobre la dilución de anticuerpos.
    9. Al día siguiente, retire el anticuerpo primario y lave la membrana 3 veces con TBS-Tween durante 5 minutos cada uno a temperatura ambiente en un agitador.
    10. Preparar anticuerpos secundarios apropiados en leche al 5%/TBS-Tween. Consulte la Tabla 1 para obtener información sobre la dilución. Agregue el anticuerpo secundario a la membrana e incube en un agitador a temperatura ambiente durante 1 h, luego lave 3 veces con TBS-Tween durante 5 minutos cada una a temperatura ambiente en un agitador.
    11. Agregue sustrato quimioluminiscente a la membrana e incube durante 5 minutos a temperatura ambiente en un agitador. Mancha de imagen mediante análisis colorimétrico y quimioluminiscente. La Figura Suplementaria 4, la Figura Suplementaria 5 y la Figura Suplementaria 6 muestran imágenes sin recortar de cada mancha.

9. Imágenes TEM

  1. Rejillas recubiertas de carbono / formvar de descarga incandescente23 400 para eliminar los hidrocarburos y hacer que las rejillas sean hidrófilas.
  2. Agregue 5 μL de EV o muestra de fracción de proteína a las rejillas. Incubar las rejillas a temperatura ambiente durante 3-5 min.
  3. Retire el exceso de solución absorbiendo con papel de filtro. Lave las rejillas con 5 μL de agua nanopura y elimine el exceso absorbiéndolo.
  4. Aplicar 5 μL de acetato de uranilo acuoso al 1% y eliminar inmediatamente. Deje que las rejillas se sequen. Rejillas de imágenes a 120 kV en un microscopio electrónico de transmisión y captura imágenes con una cámara de dispositivo de acoplamiento cargado.

10. Análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA)

  1. Obtener muestras de EV y fracción proteica a partir de -80 °C y descongelar en hielo.
  2. Encienda el ordenador y el instrumento NTA. Abra el software NTA y comenzará a inicializarse automáticamente.
  3. Seleccione la bomba adecuada que contenga agua libre de partículas y haga clic en Enjuagar el instrumento para enjuagar la celda. Mientras se enjuaga, inyecte 10-20 ml de agua libre de partículas en el puerto de inyección en la parte frontal del instrumento con una jeringa y evite las burbujas de aire.
  4. Aparecerá la pantalla de verificación de calidad celular; haga clic en Aceptar y comenzará la comprobación de calidad de la celda. Una vez superada correctamente la comprobación, aparecerá la pantalla emergente de alineación automática que indica: Llene la celda con una suspensión de alineación de 100 nm (dilución 1:250.000).
    1. Preparar la dilución 1 de la suspensión de alineación añadiendo 10 ml de agua libre de partículas y 10 μL de perlas de poliestireno de 100 nm a un tubo (dilución 1:1.000). Invertir suavemente para mezclar. La dilución 1 tiene una vida útil de 2-3 días a 4 °C.
    2. Crear la dilución 2 de la suspensión de alineación añadiendo 20 ml de agua libre de partículas y 80 μL de dilución 1 (1:1.000) en un tubo para crear la dilución de 1:250.000. Invierta suavemente el tubo para mezclar. La dilución 2 tiene una vida útil de 30-60 min a temperatura ambiente.
  5. Llenar la celda con 2 ml de dilución 2 (1:250.000). Haga clic en Aceptar y el programa completará la alineación automática (enfoque) y la optimización del enfoque. La pestaña de análisis se abrirá creando un perfil que proporciona resultados de la limpieza y simetría de la celda de medición en una parábola. Aparecerá una pantalla emergente que dice: Ver Video El microscopio ahora está listo para los experimentos; haga clic en Aceptar y el programa volverá a la ficha Comprobación de celdas.
  6. Enjuague las perlas de poliestireno de la celda inyectando agua libre de partículas en el puerto de inyección para lavar la celda. Continúe lavando hasta que el número de partículas detectadas esté entre 0-10 (generalmente entre 5-10 mL). Agregue 1 ml de PBS filtrado de 0.22 μm para preparar la celda para la primera muestra.
  7. Diluir la primera muestra con PBS filtrado de 0,22 μm (comience con una dilución 1:1000) e introduzca el factor de dilución en el programa. Inserte 1 ml de muestra en la celda y espere 5 minutos para que el movimiento de las partículas disminuya, ya que inicialmente se moverán muy rápidamente a través de la pantalla. Ajuste la sensibilidad y el obturador en 75.0 y 100, respectivamente.
  8. El número de partículas detectadas para una dilución ideal de la muestra es de 50-200 partículas. Si se informa de partículas inferiores a 50 o superiores a 200, ajuste la dilución de la muestra. Si se requiere una nueva dilución, lave la celda con agua libre de partículas hasta que haya 0-10 partículas detectadas. Repita la adición de la muestra diluida y el lavado hasta que se encuentre la dilución ideal.
  9. Compruebe las 11 posiciones de la cámara para visualizar que el movimiento de partículas se ha ralentizado y asegúrese de que el número de partículas detectadas sea similar entre todas las posiciones de la cámara. Si el número de partículas difiere mucho entre las posiciones de la cámara, agregue más muestra.
  10. Haga clic en la pestaña Medición y ejecute adquisición de video. En la pestaña de adquisición de video, ingrese el nombre personalizado para la muestra e identifique una ubicación segura. Marque las casillas autoguardado.txt y autoguardado.pdf para guardar datos.
  11. Ajuste la temperatura a 25 °C, haga clic en 488 nm para configurar el láser y haga clic en 11 para las posiciones de la cámara. Haga clic en Aceptar para ejecutar la recopilación de datos. El programa comenzará a analizar el número de partículas y el tamaño en las 11 posiciones. En la pestaña de análisis, aparecerá un gráfico de barras con diámetro/nm en el eje x y partículas/ml en el eje y.
  12. Después de recopilar los datos, aparecerá una pantalla emergente titulada Descripción general de las posiciones que proporciona datos para cada una de las 11 posiciones. Si hay más de dos posiciones eliminadas del análisis, repita el procedimiento con más muestra. Si no, haga clic en el botón Continuar . Se abrirá un archivo PDF y txt que contiene los resultados. Guarde los archivos en un lugar seguro.
  13. Para ejecutar otro ejemplo, vaya a la pestaña Comprobación de celda y repita los pasos 10.6 a 10.12. Si lo hace, lave la celda con agua libre de partículas hasta que el número de partículas detectadas sea 0-10 (aproximadamente 5-10 ml). Enjuague la celda con 1 ml de PBS filtrado de 0,22 μm, cierre el programa y apague el equipo.

Resultados

Western blot revela una separación adecuada de los vehículos eléctricos de CCM
Para evaluar la efectividad de SEC para separar EVs de medios de cultivo celular, se ejecutó un western blot utilizando cada fracción individual de las muestras de control para sondear la expresión de los tres marcadores canónicos de EV, CD9, CD63 y CD81, así como GM130 y calnexina18, que se utilizaron como controles negativos (Figura 3). La expresión de albúmi...

Discusión

SEC es un método fácil de usar para separar adecuadamente los vehículos eléctricos de los CCM acondicionados. Para aislar específicamente las EV derivadas de células, se debe tener en cuenta cuidadosamente el tipo de MCP y sus suplementos. Muchos medios de cultivo celular deben complementarse con FBS, que contiene EV derivados del animal en el que se recolectó el suero. Estos EV séricos pueden saturar y enmascarar cualquier señal producida por EVs derivada de células en cultivo26. Por lo...

Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a Penn State Behrend y a la Fundación de Salud Hamot por la financiación, así como a la Instalación de Microscopía de Penn State en University Park, PA.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
2-MercaptoethanolVWR97064-588
4X Laemmli Sample BufferBioRad1610747
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit, Ultracel, 3 KDa, 15mLSigma-AldrichUFC9003083 kDa cutoff
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membraneSigma-AldrichUFC2003243 kDa cutoff
Ammonium PersulfateSigma-AldrichA3678-100G
Anti rabbit IgG, HRP linked AntibodyCell Signaling Technology7074V1:1000 Dilution
Anti-Calnexin antibodyAbcam ab225951:500 Dilution
Anti-CD9 Mouse Monoclonal AntibodyBioLegend3121021:500 Dilution
Anti-GM130 antibody [EP892Y] - cis-Golgi MarkerAbcamab526491:500 Dilution
Anti-mouse IgG, HRP-linked AntibodyCell Signaling Technology7076V1:1000 Dilution
Automatic Fraction CollectorIzon Science
BCA assay KitBio-Rad
CCD cameraGatan Orius SC200
Cd63 Mouse anti HumanBD5560191:1000 Dilution
CD81 AntibodySanta Cruz Biotechnologysc-239621:1000 Dilution
Cellstar Filter Cap Cell Culture FlasksGreiner Bio-One660175
ChemiDoc MP ImagerBioRad
Clarity Western ECL SubstrateBioRad1705061
deoxycholateSigma-AldrichD6750-10G
dithiothreitolSigma3483-12-3
DMEM/High glucose with L-glutamine; without sodiumCytivaSH300022.FS
Fetal Bovine Serum Premium gradeVWR97068-085
Fetal Bovine Serum, exosome-depletedThermo ScientificA2720801
GlycineBioRad1610718
Great Value Nonfat Dry MilkAmazonB076NRD2TZ
HOG Human Oligodendroglioma Cell LineSigma-AldrichSCC163
Izon Science Usa Ltd qev Size Exclusion Columns 5pkIzon Science
Methanol >99.8% ACSVWRBDH1135-4LP
Mini-PROTEAN Glass platesBioRad1653310with 0.75mm spacers
Mini-PROTEAN Short platesBioRad1653308
NP-40Sigma-Aldrich492016
Penicillin-Streptomycin,SolutionSigma-AldrichP4458-100mL
Phosphate Buffered Saline PBSFisher ScientificBP66150
Pierce BCA Protein Assay Kits and ReagentsThermo Fisher Scientific23227
Pierce PVDF Transfer MembranesThermo Scientific88518
Pierce Western Blotting Filter PaperThermo Scientific84783
Polyoxyethylene-20 (TWEEN 20), 500mLBio BasicTB0560
Protease/phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)Cell Signaling Technology5872S
Recombinant Anti-TSG101 antibody [EPR7130(B)]ABCamab1250111:1000 dilution
Slodium hydroxideSigma-AldrichSX0603
Sodium azideFisher ScientificBP922I-500
Sodium ChlorideSigma-AldrichS9888-500G
Sodium dodecyl sulfate,≥99.0% (GC), dust-free pelletsSigma-Aldrich75746-1KG
TetramethylethylenediamineSigma-AldrichT9281-25ML
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 10%BioRad1610183
Transmission Electron MicroscopeFEI Tecnai 12 Biotwin
TrisBioRad1610716
Trypsin 0.25% protease with porcine trypsin, HBSS, EDTA; without calcium, magnesiumCytivaSH30042.01
TunicamycinTocris3516
Zeta View softwareAnalytikNTA software

Referencias

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