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요약

여기서 프로토콜은 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 세포외 소포가 컨디셔닝 세포 배양 배지로부터 적절하게 분리될 수 있음을 보여줍니다.

초록

세포외 소포(EV)는 모든 세포에서 방출되고 모든 생체 유체에 존재하며 단백질, 핵산 및 이들이 유래한 모 세포를 반사하는 지질을 포함하는 나노 크기의 지질막 결합 구조입니다. 샘플의 다른 구성 요소에서 EV를 적절하게 분리하면 관련 화물의 특성을 분석할 수 있으며 수많은 질병에 대한 세포 간 통신기 및 비침습적 바이오마커로서의 잠재력에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 현재 연구에서 희소돌기아교세포 유래 EV는 다른 세포외 단백질 및 단백질 복합체에서 EV를 분리하기 위해 한외여과 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 포함한 최첨단 기술의 조합을 사용하여 세포 배양 배지에서 분리되었습니다. 시판되는 SEC 컬럼을 사용하여, EV는 대조군 및 소포체(ER) 스트레스 조건 모두에서 인간 희소돌기아교종 세포로부터 방출된 세포외 단백질로부터 분리되었다. 표준 EV 마커 CD9, CD63 및 CD81은 분획 1-4에서 관찰되었지만 분획 5-8에서는 관찰되지 않았습니다. 골지체의 단백질인 GM130과 ER의 필수 단백질인 칼넥신을 음성 EV 마커로 사용하였으며, 어떤 분획에서도 관찰되지 않았다. 또한, 분획 1-4를 EV 분획으로, 분획 5-8을 단백질 분획으로 풀링하여 농축하였을 때, EV 분획물에서 CD63, CD81, 및 CD9의 발현이 관찰되었다. GM130 또는 칼넥신의 발현은 분획 유형 중 어느 것에서도 관찰되지 않았다. 대조군 및 ER 스트레스 조건 모두에서 풀링된 분획을 투과 전자 현미경으로 시각화하고 소포는 EV 분획에서 관찰되었지만 단백질 분획에서는 관찰되지 않았습니다. 두 조건의 EV 및 단백질 분획의 입자도 나노입자 추적 분석으로 정량화하였다. 이러한 데이터는 SEC가 컨디셔닝 된 세포 배양 배지에서 EV를 분리하는 효과적인 방법임을 보여줍니다.

서문

세포외 소포(EV) 연구에 대한 관심의 폭발은 이러한 나노 크기의 이질적인 입자를 분리하고 연구하는 데 사용되는 기술과 기술의 주요 발전을 동반했습니다. 거의 40년 전에 발견된 이후1,2, 이 작은 막 구조는 생리활성 지질, 핵산 및 단백질을 포함하고 세포간 통신에서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌습니다3,4. EV는 모든 세포 유형에서 방출되므로 혈장과 혈청, 타액 및 소변을 포함한 모든 생물학적 체액에 존재합니다. 이러한 유체 내의 EV는 신경 염증 및 신경 퇴행성 질환, 암 및자가 면역 질환 5,6,7을 포함한 다양한 질병에 대한 비 침습적 바이오 마커 역할을 할 큰 가능성을 가지고 있습니다. 또한, 배양액(3,8,9)으로 방출된 EV를 분리하여 세포 배양 기술을 통해 체외 기계론적 연구를 수행할 수 있다.

질병 병태생리학에서 EV의 역할을 이해하려면 EV가 발견되는 유체에서 적절한 분리가 가장 중요합니다. EV 분리의 황금 표준은 오랫동안 차동 초원심분리(dUC)10였지만 다른 세포 외 구성 요소에서 EV를 더 잘 분리하기 위해 보다 정교한 기술이 등장했습니다. 이러한 기술 중 일부에는 밀도 구배, 비대칭 유동 계장 유동 분획(A4F), 유세포분석, 면역포획, 폴리에틸렌 글리콜 침전 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)11,12,13이 포함됩니다. 각 기술에는 고유 한 장점과 단점이 있습니다. 그러나, SEC는 특히 EV를 생물학적 유체 및 세포 배양 상청액 둘 다로부터 매우 효과적으로 분리하는 것으로 나타났다 8,14,15. SEC는 또한 비교적 간단하고 사용자 친화적이라는 추가 보너스를 가지고 있습니다.

SEC는 크기에 따라 유체의 구성 요소를 분리하는 방법입니다. 이 기술을 사용하면 수지 컬럼 (자체 제작 또는 상업적으로 구매)을 사용하여 샘플을 분획합니다. 샘플의 작은 입자는 수지 내의 비드 사이에 갇히는 반면, 큰 입자는 수지를 더 자유롭게 통과할 수 있으므로 공정 초기에 용리됩니다. EV는 많은 세포외 단백질 및 단백질 응집체보다 크기가 크기 때문에 EV는 컬럼을 더 빨리 통과하고 세포외 단백질보다 초기 분획에서 용리됩니다14.

이 방법 논문에서는 제어 및 소포체(ER) 스트레스 조건 모두에서 인간 희소돌기아교세포로부터 세포 배양 배지(CCM)로부터 EV를 분리하기 위한 SEC의 사용에 대해 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하면 이 기술로 분리된 EV가 함께 풀링되고 다운스트림 특성화를 위해 농축될 수 있는 특정 분획 내에서 발견되며, 분리된 EV는 CCM을 보충하는 데 사용되는 태아 소 혈청(FBS)과 같은 외인성 공급원이 아닌 세포에서 파생되는 것으로 나타났습니다. EV 분획에서 표준 EV 마커 CD63, CD81 및 CD9 16,17,18,19의 존재와 단백질 분획에서의 이들의 부재는 웨스턴 블로팅으로 입증된다. 투과 전자 현미경(TEM)을 사용하여 EV를 시각화하고 예상 형태를 표시하며 EV 분획에서만 관찰됩니다. 입자는 또한 대조군 및 ER 스트레스 조건 모두에서 EV 및 단백질 분획에서 계수되며, EV 샘플에서 직경 50-200nm의 예상 크기 범위 내의 많은 수의 입자가 관찰됩니다. 이러한 데이터는 SEC가 세포 배양 배지에서 EV를 분리하는 효율적이고 효과적인 방법이라는 개념을 뒷받침합니다.

프로토콜

1. 완충액 및 시약의 제조

알림: 세포 배양 후드에서 세포 배양 시약을 만들어 멸균 상태를 유지하십시오.

  1. 세포 배양 시약의 제조
    1. 고혈당 DMEM 500mL에 FBS 50mL와 페니실린-연쇄상구균(Pen-Strep) 5mL를 첨가하여 정상 고혈당 DMEM을 제조하고 4°C에서 보관한다. 이 배지를 사용하여 세포를 배양하고 확장합니다.
    2. 고포도당 DMEM 500mL에 엑소좀 고갈 FBS 50mL와 Pen-Strep 5mL를 첨가하여 엑소좀이 고포도당 DMEM을 제조하고 4°C에서 보관한다. EV 분리 전에 세포 치료에 이 배지를 사용하십시오.
    3. 디메틸설폭사이드(DMSO) 1mL에 튜니카마이신 10mg을 첨가하여 투니카마이신을 준비합니다. 0.2mL 튜브에 50μL 분취량을 만들고 -20°C에서 보관합니다.
  2. EV 분리 시약의 제조
    1. 1L 눈금이 매겨진 실린더에 1L의 탈이온화(DI) 물에 PBS 분말 9.89g을 첨가하여 1x 인산염 완충 식염수(PBS)를 준비합니다. PBS가 녹을 때까지 교반 플레이트에서 용액을 저어줍니다.
    2. PBS를 추가하기 전에 오토클레이브를 사용하여 유리 제품을 멸균하십시오. 유리 제품을 쓰레기통에 넣고 문을 닫고 121 ° C에서 30 분 동안 살균합니다.
    3. 층류 캐비닛 내부에서 0.22μm 필터에 진공을 연결하고 오토클레이브 병 위에 필터를 놓습니다. PBS를 필터에 천천히 붓고 여과된 PBS를 오토클레이브 병에 수집합니다.
    4. 500mL 눈금 실린더의 1x PBS 500mL에 수산화나트륨 9.99g을 첨가하여 0.5M 수산화나트륨을 준비합니다. 수산화나트륨이 PBS에 용해될 때까지 교반 플레이트에서 용액을 저어준 다음 0.22μm 필터를 사용하여 오토클레이브된 500mL 병에 여과합니다.
    5. 500mL 눈금이 매겨진 실린더에 1x PBS 500mL에 아지드화나트륨 0.25g을 첨가하여 0.05% 아지드화나트륨을 준비합니다. 아지드화나트륨이 PBS에 용해될 때까지 교반 플레이트에서 용액을 저어준 다음 0.22μm 필터를 사용하여 오토클레이브된 500mL 병에 여과합니다.
  3. 단백질 분리, 정량 및 식별 시약의 제조
    1. 1M 트리스(pH 7.4) 1mL, 10% 도데실 황산나트륨(SDS) 1mL, 데옥시콜레이트 1g, NP-40 1mL 및 염화나트륨(NaCl) 0.89g을 혼합하여 RIPA 용해 완충액 100mL를 준비합니다. 증류된H2O와 함께 부피를 100 mL로 가져오고 4°C에서 보관한다. RIPA와 포스파타제 및 프로테아제 억제제 용액을 만들기 위해 15mL 튜브에 RIPA 완충액 1mL당 10μL의 포스파타제 및 프로테아제 억제제를 추가하고 용액을 4°C에 보관합니다.
    2. 사용 직전에 BCA 분석 키트에서 제공하는 시약 A 10mL와 시약 B 200μL를 15mL 튜브에 추가하여 BCA 분석 작업 시약을 준비합니다. 사용 직전에 시약 A 25부, 시약 B 24부, 시약 C 1부를 15mL 튜브에 추가하여 microBCA 분석 작업 시약을 준비합니다.
    3. 1L의 DI 물에 30.3g의 트리스 염기, 144g의 글리신 및 10g의 SDS를 추가하여 10x 겔 전기영동 실행 완충액을 준비합니다. 실행 버퍼를 4°C에 보관합니다. 트리스 염기 3.03g, 글리신 14.4g 및 메탄올 200mL를 첨가하여 1x 전달 완충액을 준비하고 DI 물로 부피를 1L로 조정합니다. 전달 완충액을 4°C에 보관한다.
    4. 1 L의 DI 물에 2.4 g의 트리스 염기, 8 g의 NaCl 및 1 mL의 트윈-20을 첨가하여 트윈-20 (TBS-Tween)으로 트리스 완충 식염수를 준비합니다. TBS-트윈을 4°C에서 보관하십시오.
    5. TBS-트윈 100mL에 무지방 분유 5g을 첨가하여 5% 차단 용액을 준비합니다. 블로킹 완충액을 4°C에 보관한다.
    6. 사용 직전에 15mL 튜브에 4mL의 과산화물 용액과 4mL의 루미놀/인핸서 용액을 첨가하여 화학발광 기질을 준비하고 부드럽게 뒤집어 혼합합니다.

2. 세포 배양 및 처리

  1. 2개의 T175 세포 배양 플라스크에 각각 2.3 x 106 개의 인간 희소돌기아교종(HOG) 세포를 시드합니다. 정상 고포도당 DMEM의 최종 부피를 25mL로 가져오고, 세포 배양 인큐베이터에서 5%CO2 와 함께 37°C에서 48시간 동안 배양한다.
  2. 48 h의 끝에서, 37°C 수조에서 따뜻한 엑소좀-고갈 고글루코스 DMEM. 치료를 위해 엑소좀이 고갈된 배지 25mL에 튜니카마이신 10mg/mL 25μL를 추가하고 최종 농도는 튜니카마이신 10μg/mL를 추가하여 ER 스트레스를 유도합니다. 대조군의 경우 25mL의 DMSO를 엑소좀이 고갈된 배지 25mL에 추가합니다.
  3. 세포에서 정상 고포도당 DMEM을 제거하고 세포를 부드럽게 헹구고 10mL의 1x PBS로 플라스크를 헹굽니다. PBS를 흡입하고 폐기하십시오.
  4. 25mL의 대조군 배지를 플라스크 표지 대조군에 추가하고 배지에 25mL의 10μg/mL 튜니카마이신을 표지된 플라스크 처리에 추가합니다. 플라스크를 세포 배양 인큐베이터로 24시간 동안 되돌립니다.

3. 컨디셔닝 CCM의 수집 및 농축 (그림 1)

  1. PBS를 37°C 수조에 넣습니다. 10x 및 100x 대물 렌즈가 있는 복합 현미경으로 플라스크를 관찰합니다. 플라스크 간의 차이점을 기록해 두십시오. 대조군 플라스크와 처리된 플라스크 모두에 대해 다음 단계를 수행하십시오.
  2. 플라스크에서 배지를 제거하고 50mL 튜브에 넣습니다. 튜브를 500 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 새로운 50mL 튜브로 옮깁니다.
  3. 튜브를 2,000 x g 에서 4°C에서 20분 동안 원심분리합니다. 상청액을 새 50mL 튜브로 옮기고 얼음 위에 놓습니다.
  4. 4개의 15mL 3kDa 차단 한외여과 장치를 얻고 각 튜브에 5mL의 PBS를 추가합니다. 한외여과 장치를 4,000 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 필터를 프라이밍합니다.
    참고: 3kDa 분자량 차단 한외여과 장치는 세포에서 방출된 모든 세포외 단백질을 유지하기 위해 현재 프로토콜에서 사용되었습니다. 더 큰 분자량 차단 한외여과 장치(예: 30kDa)도 이 프로토콜과 함께 작동하지만 30kDa보다 작은 세포외 단백질은 여과되어 샘플(20,21)에서 제거됩니다.
  5. 한외 여과 장치에서 PBS를 제거하십시오. 각 조건(대조군 및 튜니카마이신 처리)의 상청액을 각각 약 12.5mL의 배지인 두 개의 한외여과 장치로 나눕니다.
  6. 튜브를 4°C에서 1시간 45분 동안 4,000 x g 로 원심분리하거나, 또는 각 한외여과 유닛 내의 농축된 배지(잔류물로 지칭됨)가 250 μL 이하로 농축될 때까지 원심분리한다.
  7. 두 대조 한외여과 장치의 잔류물을 라벨이 부착된 1.5mL 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다. 처리된 두 한외여과 장치의 잔류물을 라벨링된 다른 1.5mL 미세원심분리 튜브로 옮깁니다.
  8. 각 마이크로 원심분리 튜브에서 잔류물의 총 부피가 500 μL가 되도록 측정합니다. 샘플이 500μL 미만인 경우 최종 부피가 500μL가 될 때까지 0.22μm 여과된 1x PBS를 추가합니다. 튜브를 -80°C 냉동고에 넣습니다.

4. 세포 수집

  1. 트립신, PBS 및 엑소좀이 고갈된 DMEM을 37°C 수조에 넣습니다. 대조군과 처리된 플라스크 모두에 트립신 7mL를 넣고 인큐베이터에 5분 동안 넣습니다.
  2. 현미경으로 보고 세포가 들어 올려졌는지 확인합니다. 세포가 들어 올려지지 않으면 플라스크를 손바닥에 대고 단단히 두드려 세포를 제거합니다.
  3. 엑소좀이 고갈된 DMEM 7mL로 플라스크를 세척합니다. 플라스크에서 세포 현탁액을 수집하고 15mL 튜브에 넣습니다.
  4. 4 °C에서 500 x g 에서 10분 동안 튜브를 원심분리합니다. 상청액을 제거하고 5mL의 1x PBS를 세포 펠릿에 추가합니다. 부드럽게 피펫 믹스하여 펠릿을 분해합니다.
  5. 튜브를 500 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 제거하고 200 μL의 RIPA와 포스파타제 및 프로테아제 억제제 용액을 세포 펠릿에 첨가하고, 피펫하여 혼합한다.
  6. RIPA 용액의 세포를 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 튜브를 얼음 위에 5분 동안 그대로 두십시오. 튜브를 14,000 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.
  7. 상청액을 새 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 튜브에 치료 상태와 날짜를 표시하십시오. 튜브를 -80 ° C 냉동고에 넣습니다.
    참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.

5. 크기 배제 크로마토그래피를 사용한 EV 분리(그림 2)

알림: 다음 단계를 두 번, 한 번은 대조군 잔류물에 대해 한 번, 튜니카마이신 처리된 잔류물에 대해 한 번 수행하십시오.
알림: 이 섹션에서 사용되는 PBS는 0.22μm 필터링된 1x PBS입니다.

  1. 자동 분획 수집기(AFC)를 켜고 8개의 분획, 분획당 0.5mL 및 버퍼(공극) 부피를 수집하도록 설정을 기본값으로 조정합니다.
    참고: AFC 작동 조건은 다음과 같습니다: 컬럼/베드 부피 = 10mL; 공극 부피 = 2.70 mL; 플러시 부피 = 15mL; 최적 분획 크기 = 500 μL; 실행당 필요한 완충액 = 65mL; 20 °C에서의 유속 = 1.0 mL / 분; 컬럼의 재사용 가능성 = 5회 사용.
  2. 4°C에서 컬럼(재료 표 참조)을 제거하고 시작하기 전에 컬럼을 실온으로 예열합니다(보통 ~30분).
  3. -80°C 냉동고에서 잔류물 샘플을 제거하고 얼음 위에 올려 해동합니다. 기다리는 동안 뚜껑이 안쪽을 향하도록 AFC 캐러셀에 라벨이 붙은 1.5mL 튜브 8개를 놓습니다.
  4. 바코드가 리더를 향하도록 열을 AFC에 삽입합니다. 화면의 지침에 따라 수거를 시작하여 캐러셀에 튜브가 있고 폐기물 수집기가 제대로 작동하는지 확인합니다.
  5. 저장 버퍼가 컬럼 매트릭스의 상단 부분에 완전히 흡수된 후 컬럼에 15mL의 1x PBS를 추가하여 컬럼 플러시를 시작합니다. PBS를 너무 일찍 추가하면 저장소 버퍼가 희석되고 적절한 플러시가 방지되므로 너무 일찍 추가하지 마십시오.
  6. 15mL의 PBS가 모두 매트릭스에 흡수되기 직전에 확인을 클릭하여 플러싱을 중지하고 마이크로피펫으로 컬럼 매트릭스 상단에서 잔류 PBS를 제거합니다. 매트릭스를 만지지 마십시오.
  7. 컬럼 중앙에 500μL의 시료를 추가합니다. 확인을 클릭하여 실행을 시작합니다. 시료가 매트릭스에 흡수되는 것을 관찰하고 시료가 완전히 흡수된 직후 컬럼에 8mL의 PBS를 빠르게 추가합니다.
  8. AFC는 캐러셀 중앙으로 보이드 볼륨을 자동으로 제거한 다음 각각 500μL의 8개 분획을 모두 수집합니다. 달리기가 끝나면 회전 목마에서 분수를 제거하고 얼음 위에 놓습니다. 분획 1-4는 EV를 포함하고 분획 5-8은 세포 외 단백질을 포함합니다. 캐러셀 중앙에서 빈 볼륨을 제거합니다.
  9. 8개의 분획을 수집한 후 컬럼에 PBS 10mL를 추가하여 컬럼에서 잔류 샘플을 세척합니다. 잔류물 샘플이 컬럼을 통해 완전히 플러시된 후 15mL의 1x PBS를 컬럼에 추가합니다.
  10. 최종 PBS가 매트릭스에 흡수되면 컬럼 매트릭스 중앙에 0.5M 수산화나트륨 500μL를 추가합니다. 수산화나트륨이 흡수되면 컬럼에 1x PBS 30mL를 넣고 플러시합니다.
  11. 다른 샘플을 실행하는 경우 캐러셀에 라벨이 부착된 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브 8개를 추가하고 5.7-5.10단계를 반복합니다.
  12. 모든 샘플에 대해 완료되면 다음 단계를 완료하여 나중에 사용할 수 있도록 컬럼을 보존합니다. 단계 5.10에 설명된 대로 컬럼을 통해 PBS 30mL를 플러싱한 후 0.05% 아지드화나트륨 15mL를 컬럼에 추가합니다.
  13. 컬럼 매트릭스 상단에 약 5mL의 아지드화나트륨을 남겨 둡니다. AFC에서 컬럼을 제거하고 상단 및 하단 캡을 부착합니다. 보관을 위해 컬럼을 4°C에 다시 놓습니다(컬럼은 최대 5회까지 사용 가능).

6. EV 및 단백질 분획의 한외여과

  1. 시료당 2개의 2mL, 3kDa 차단 한외여과 장치를 얻습니다. 한 단위를 사용하여 EV 분획(분획 1-4)을 농축하고 다른 단위를 사용하여 단백질 분획(분획 5-8)을 농축합니다. 각 단위는 세 부분으로 구성됩니다 : 원뿔, 필터 및 플로우 스루 실린더; 각 부품에 적절하게 라벨을 붙입니다.
  2. 한외여과 장치를 구성하고 필터 부분에 0.22μm 여과된 1x PBS 1mL를 추가하고 원뿔 조각으로 캡합니다. 한외여과 장치를 원심분리하고, 원뿔 면이 위로 향하도록 하여 4°C에서 10분 동안 3,500 x g 로 한다.
  3. 플로우 스루 실린더에서 여과 된 PBS를 제거합니다. 한외여과 장치를 뒤집고(원뿔 쪽이 아래로) 4°C에서 1,000 x g 에서 2분 동안 원심분리합니다. 원뿔에서 남아 있는 PBS를 제거합니다.
  4. 적절한 분획 (전체 500 μL 부피)을 각 한외 여과 장치에 첨가하십시오 (총 부피는 2mL입니다). 원심분리 컬럼은 4°C에서 3,500 x g 에서 1시간 45분 동안 또는 잔류물 수준이 100μL가 될 때까지 원뿔이 위로 향하게 합니다.
  5. 플로우 스루 실린더를 제거하고 플로우 스루를 폐기하십시오. 한외여과 장치를 뒤집고(원뿔 쪽이 아래로) 4°C에서 1,000 x g 에서 2분 동안 원심분리합니다.
  6. 콘의 잔류물을 라벨이 부착된 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 0.22μm 여과된 1x PBS를 사용하여 각 샘플 부피를 150μL로 가져옵니다. 튜브를 -80 ° C 냉동고에 넣습니다.
    참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.

7. 미디어 컨트롤

  1. 2개의 T175 세포 배양 플라스크를 얻습니다. 하나의 플라스크 대조군과 다른 처리에 레이블을 지정합니다. 37°C 수조에서 엑소좀이 고갈된 고포도당 DMEM을 따뜻하게 한다.
  2. 25mL의 배지에 25μL의 튜니카마이신 원액(10mg/mL)을 추가하고 라벨이 붙은 처리된 플라스크에 넣습니다. 25mL의 배지에 25μL의 DMSO를 추가하고 라벨링된 대조군 플라스크에 넣습니다. 플라스크를 세포 배양 인큐베이터에 24 시간 동안 보관하십시오.
  3. 미디어를 수집하고 3.2-3.8단계에 설명된 대로 EV를 분리하는 프로세스를 수행합니다. 그런 다음 섹션 5와 6에 설명된 모든 단계를 수행합니다.

8. 웨스턴 블로팅

  1. BCA 분석을 통한 세포 용해물 및 단백질 분획의 단백질 정량
    참고: 대조군 및 튜니카마이신 처리 샘플 모두의 단백질 정량화는 다음 단계로 수행됩니다.
    1. 용해된 세포와 단백질 분획을 얼음에서 해동합니다. 각 샘플에 대해 3개의 희석 튜브를 만드십시오. 1:2, 1:10 및 1:100.
    2. 96웰 투명 바닥 분석 플레이트, 25μL의 소 혈청 알부민(BSA) 단백질 표준물질 및 25μL의 각 샘플 희석액에 삼중으로 로드합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 표준물질 또는 시료가 포함된 각 웰에 200μL 작동 시약을 추가합니다.
    3. 플레이트를 37°C에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, 플레이트 판독기로 플레이트를 562nm의 흡광도에서 판독한다. 각 샘플의 단백질 농도를 계산하고 세포 용해물용 단백질 20μg과 단백질 분획용 단백질 15μg을 얻는 데 필요한 샘플의 부피를 결정합니다.
  2. microBCA 분석을 통한 EV 분획의 단백질 정량 분석
    1. 얼음에서 EV 샘플을 해동합니다. 각 샘플에 대해 1:50과 1:100의 두 가지 희석을 만듭니다.
    2. 96웰 투명 바닥 분석 플레이트, 100μL의 BSA 단백질 표준물질 및 100μL의 각 샘플 희석액에 삼중으로 로드합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 표준물질 또는 샘플이 포함된 각 웰에 100μL의 microBCA 작동 시약을 추가합니다.
    3. 플레이트를 37°C에서 2시간 동안 인큐베이션한 다음, 플레이트 리더로 플레이트를 562nm의 흡광도에서 판독합니다. 각 샘플의 단백질 농도를 계산하고 EV 분획에 대해 15μg의 단백질을 얻는 데 필요한 샘플의 부피를 결정합니다.
  3. 웨스턴 블로팅
    참고: 웨스턴 블롯팅 프로토콜은도 22에 기재된 바와 유사하게 수행되었고, 하기에 요약된 바와 같이 수정되었다.
    1. 제조업체의 지침에 따라 젤 제조 키트로 10 % 폴리 아크릴 아미드 젤을 만드십시오.
    2. 겔 전기영동을 위해 1.5mL 튜브에 20μg의 단백질에 필요한 세포 용해물의 부피, 5μL의 4x Laemmli 완충액 및 총 부피를 20μL로 만드는 데 필요한 RIPA 완충액의 부피를 결합하여 세포 용해물 샘플을 준비합니다.
    3. 1.5mL 튜브에서 15μg의 단백질, 5μL의 4x Laemmli 버퍼 및 RIPA 버퍼에 필요한 샘플 부피를 20μL의 부피로 결합하여 EV 및 단백질 분획 샘플을 준비합니다.
    4. 1.5mL 튜브에 15μL의 시료와 5μL의 4x Laemmli 완충액을 결합하여 배지 대조 시료를 준비합니다.
      참고: 사용할 항체에 따라 Laemmli 완충액은 50mM 디티오트레이톨(DTT)과 같은 환원제를 함유할 필요도 없고 함유하지 않을 수도 있습니다.
    5. 모든 샘플을 95 ° C에서 5 분 동안 끓여서 샘플을 얼음으로 옮겨 식히고 10,000 x g에서 30 초 동안 잠시 원심 분리 한 다음 샘플을 얼음으로 되돌립니다.
    6. 전기 영동 탱크에 젤을 추가하고 1x 겔 전기 영동 실행 버퍼를 추가하십시오. 15 μL의 단백질 래더와 20 μL의 시료를 로드합니다. 200V에서 30-50분 동안 또는 샘플이 젤 바닥에 도달할 때까지 젤을 실행합니다.
    7. 단백질을 4°C에서 1x 전달 완충액을 사용하여 100V에서 30분 동안 또는 전달이 완료될 때까지 PVDF 막으로 옮깁니다. 보충 그림 1, 보충 그림 2 및 보충 그림 3 은 전송이 완료된 후 각 블롯의 얼룩없는 이미지를 보여줍니다.
    8. 셰이커의 실온에서 5% 우유/TBS-트윈으로 멤브레인을 1시간 동안 차단합니다. 1차 항체 용액에서 막을 4°C에서 진탕기에서 밤새 인큐베이션한다. 항체 희석 정보는 표 1 을 참조하십시오.
    9. 다음날, 1차 항체를 제거하고 멤브레인을 TBS-트윈으로 3x 세척하고 쉐이커에서 실온에서 각각 5분 동안 세척합니다.
    10. 5% 우유/TBS-트윈에 적절한 2차 항체를 준비합니다. 희석 정보는 표 1 을 참조하십시오. 2차 항체를 막에 첨가하고 실온에서 셰이커에서 1시간 동안 배양한 다음 셰이커에서 실온에서 각각 5분 동안 TBS-트윈으로 3회 세척합니다.
    11. 화학발광 기질을 멤브레인에 첨가하고 셰이커에서 실온에서 5분 동안 배양합니다. 비색 및 화학발광 분석을 이용한 이미지 블롯. 보충 그림 4, 보충 그림 5 및 보충 그림 6 은 각 블롯의 잘리지 않은 이미지를 보여줍니다.

9. TEM 이미징

  1. 글로우 방전23 400 메쉬 탄소 / formvar 코팅 그리드는 탄화수소를 제거하고 그리드를 친수성으로 만듭니다.
  2. 5 μL의 EV 또는 단백질 분획 샘플을 그리드에 추가합니다. 그리드를 실온에서 3-5 분 동안 배양하십시오.
  3. 여과지로 위킹하여 과도한 용액을 제거하십시오. 그리드를 나노 순수 5μL로 씻고 위킹하여 초과분을 제거합니다.
  4. 1% 수성 우라닐 아세테이트 5μL를 바르고 즉시 닦아냅니다. 그리드를 말리십시오. 투과 전자 현미경에서 120kV의 이미지 그리드를 만들고 충전 커플 장치 카메라로 이미지를 캡처합니다.

10. 나노 입자 추적 분석 (NTA)

  1. -80 °C에서 EV 및 단백질 분획 샘플을 얻고 얼음에서 해동합니다.
  2. 컴퓨터와 NTA 계측기를 켭니다. NTA 소프트웨어를 열면 자동으로 초기화가 시작됩니다.
  3. 입자가 없는 물이 포함된 적절한 펌프를 선택하고 기기 헹굼을 클릭하여 셀을 헹굽니다. 헹구는 동안 주사기를 사용하여 기기 전면의 주입 포트에 10-20mL의 입자가 없는 물을 주입하고 기포를 피하십시오.
  4. 셀 품질 확인 화면이 나타납니다. 확인을 클릭하면 셀 품질 검사가 시작됩니다. 검사가 성공적으로 통과되면 자동 정렬 팝업 화면이 나타납니다. 셀을 100nm 정렬 현탁액(희석 1:250,000)으로 채우십시오.
    1. 튜브에 입자가 없는 물 10mL와 100nm 폴리스티렌 비드 10μL를 추가하여 정렬 현탁액의 희석 1을 준비합니다(1:1,000 희석). 부드럽게 뒤집어 섞습니다. 희석액 1은 4°C에서 2-3일의 저장 수명을 갖는다.
    2. 튜브에 20mL의 입자가 없는 물과 80μL의 희석 1(1:1,000)을 추가하여 정렬 현탁액의 희석액 2를 생성하여 1:250,000의 희석액을 생성합니다. 튜브를 부드럽게 뒤집어 혼합합니다. 희석액 2는 실온에서 30-60분의 저장 수명을 갖는다.
  5. 2mL의 희석액 2(1:250,000)로 세포를 채웁니다. 확인을 클릭하면 프로그램이 자동 정렬 (초점) 및 초점 최적화를 완료합니다. 분석 탭이 열리면 포물선으로 측정 셀의 청결도와 대칭 결과를 제공하는 프로파일이 생성됩니다. 다음과 같은 팝업 화면이 나타납니다 : 비디오 현미경보기는 이제 실험 준비가되었습니다. 확인을 클릭하면 프로그램이 셀 검사 탭으로 돌아갑니다.
  6. 세포를 세척하기 위해 주입 포트에 입자가없는 물을 주입하여 세포에서 폴리스티렌 비드를 헹굽니다. 검출된 입자의 수가 0-10(보통 5-10mL)이 될 때까지 계속 세척하십시오. 1mL의 0.22μm 여과된 PBS를 추가하여 첫 번째 샘플에 대한 셀을 프라이밍합니다.
  7. 첫 번째 샘플을 0.22μm 여과된 PBS(1:1000 희석으로 시작)로 희석하고 희석 계수를 프로그램에 입력합니다. 1mL의 샘플을 셀에 삽입하고 처음에는 화면에서 매우 빠르게 이동하므로 입자 이동이 느려질 때까지 5분 동안 기다립니다. 감도와 셔터를 각각 75.0과 100으로 설정합니다.
  8. 이상적인 샘플 희석을 위해 검출된 입자의 수는 50-200개의 입자입니다. 50 미만 또는 200 이상의 입자가보고되면 샘플의 희석을 조정하십시오. 새로운 희석이 필요한 경우 0-10 개의 입자가 감지 될 때까지 입자가없는 물로 셀을 씻으십시오. 희석된 샘플을 추가하고 이상적인 희석액이 발견될 때까지 세척을 반복합니다.
  9. 11개의 카메라 위치를 모두 확인하여 파티클 움직임이 느려졌는지 시각화하고 감지된 파티클의 수가 모든 카메라 위치 간에 비슷한지 확인합니다. 입자 수가 카메라 위치에 따라 크게 다르면 샘플을 더 추가합니다.
  10. 측정 탭을 클릭하고 비디오 수집을 실행합니다. 비디오 수집 탭에서 샘플의 사용자 지정 이름을 입력하고 안전한 위치를 식별합니다. 자동 저장.txt 및 자동 저장.pdf 상자를 선택하여 데이터를 저장합니다.
  11. 온도를 25 ° C로 설정하고 488nm 를 클릭하여 레이저를 설정하고 카메라 위치에 대해 11 을 클릭합니다. 확인을 클릭하여 데이터 수집을 실행합니다. 프로그램은 11개 위치 모두에서 입자 수와 크기 분석을 시작합니다. 분석 탭 아래에 막대 그래프가 나타나며 x축에 직경/nm이 있고 y축에 입자/mL가 표시됩니다.
  12. 데이터가 수집되면 11개 포지션 각각에 대한 데이터를 제공하는 포지션 개요라는 팝업 화면이 나타납니다. 분석에서 제거된 위치가 두 개 이상인 경우 더 많은 샘플로 절차를 반복합니다. 그렇지 않은 경우 계속 버튼을 클릭하십시오. 결과가 포함된 PDF 및 txt 파일이 열립니다. 파일을 안전한 위치에 저장합니다.
  13. 다른 샘플을 실행하려면 셀 검사 탭으로 이동하여 10.6-10.12단계를 반복합니다. 완료되면 검출된 입자의 수가 0-10(약 5-10mL)이 될 때까지 입자가 없는 물로 세포를 세척합니다. 1mL의 0.22μm 여과된 PBS로 셀을 헹구고 프로그램을 닫은 다음 컴퓨터를 끕니다.

결과

웨스턴 블로팅은 CCM에서 EV의 적절한 분리를 보여줍니다.
세포 배양 배지에서 EV를 분리하기 위한 SEC의 효과를 평가하기 위해 대조군 샘플의 각 개별 분획을 사용하여 웨스턴 블롯을 실행하여 음성 대조군으로 사용된 3개의 표준 EV 마커인 CD9, CD63 및 CD81과 GM130 및 칼넥신18의 발현을 조사했습니다(그림 3). 알부민 발현18 은 또?...

토론

SEC는 컨디셔닝 CCM에서 EV를 적절하게 분리하기 위한 사용자 친화적인 방법입니다. 세포 유래 EV를 특이적으로 분리하기 위해서는 CCM의 유형과 보충제를 신중하게 고려해야 합니다. 많은 세포 배양 배지에는 혈청을 수확한 동물에서 추출한 EV가 포함된 FBS가 보충되어야 합니다. 이들 혈청 EV는 배양물(26)에서 세포로부터 유래된 EV에 의해 생성된 임의의 신호를 포화시키고 마스킹할...

공개

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 말

저자는 Penn State Behrend와 Hamot Health Foundation의 자금 지원과 펜실베이니아 주 유니버시티 파크에있는 Penn State Microscopy Facility에 감사드립니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
2-MercaptoethanolVWR97064-588
4X Laemmli Sample BufferBioRad1610747
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit, Ultracel, 3 KDa, 15mLSigma-AldrichUFC9003083 kDa cutoff
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membraneSigma-AldrichUFC2003243 kDa cutoff
Ammonium PersulfateSigma-AldrichA3678-100G
Anti rabbit IgG, HRP linked AntibodyCell Signaling Technology7074V1:1000 Dilution
Anti-Calnexin antibodyAbcam ab225951:500 Dilution
Anti-CD9 Mouse Monoclonal AntibodyBioLegend3121021:500 Dilution
Anti-GM130 antibody [EP892Y] - cis-Golgi MarkerAbcamab526491:500 Dilution
Anti-mouse IgG, HRP-linked AntibodyCell Signaling Technology7076V1:1000 Dilution
Automatic Fraction CollectorIzon Science
BCA assay KitBio-Rad
CCD cameraGatan Orius SC200
Cd63 Mouse anti HumanBD5560191:1000 Dilution
CD81 AntibodySanta Cruz Biotechnologysc-239621:1000 Dilution
Cellstar Filter Cap Cell Culture FlasksGreiner Bio-One660175
ChemiDoc MP ImagerBioRad
Clarity Western ECL SubstrateBioRad1705061
deoxycholateSigma-AldrichD6750-10G
dithiothreitolSigma3483-12-3
DMEM/High glucose with L-glutamine; without sodiumCytivaSH300022.FS
Fetal Bovine Serum Premium gradeVWR97068-085
Fetal Bovine Serum, exosome-depletedThermo ScientificA2720801
GlycineBioRad1610718
Great Value Nonfat Dry MilkAmazonB076NRD2TZ
HOG Human Oligodendroglioma Cell LineSigma-AldrichSCC163
Izon Science Usa Ltd qev Size Exclusion Columns 5pkIzon Science
Methanol >99.8% ACSVWRBDH1135-4LP
Mini-PROTEAN Glass platesBioRad1653310with 0.75mm spacers
Mini-PROTEAN Short platesBioRad1653308
NP-40Sigma-Aldrich492016
Penicillin-Streptomycin,SolutionSigma-AldrichP4458-100mL
Phosphate Buffered Saline PBSFisher ScientificBP66150
Pierce BCA Protein Assay Kits and ReagentsThermo Fisher Scientific23227
Pierce PVDF Transfer MembranesThermo Scientific88518
Pierce Western Blotting Filter PaperThermo Scientific84783
Polyoxyethylene-20 (TWEEN 20), 500mLBio BasicTB0560
Protease/phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)Cell Signaling Technology5872S
Recombinant Anti-TSG101 antibody [EPR7130(B)]ABCamab1250111:1000 dilution
Slodium hydroxideSigma-AldrichSX0603
Sodium azideFisher ScientificBP922I-500
Sodium ChlorideSigma-AldrichS9888-500G
Sodium dodecyl sulfate,≥99.0% (GC), dust-free pelletsSigma-Aldrich75746-1KG
TetramethylethylenediamineSigma-AldrichT9281-25ML
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 10%BioRad1610183
Transmission Electron MicroscopeFEI Tecnai 12 Biotwin
TrisBioRad1610716
Trypsin 0.25% protease with porcine trypsin, HBSS, EDTA; without calcium, magnesiumCytivaSH30042.01
TunicamycinTocris3516
Zeta View softwareAnalytikNTA software

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