光诱导 原 位透射电子显微镜观察液-软物质相互作用

摘要

本协议描述了使用光照明系统进行透射电子显微镜（TEM）修饰，制造液体细胞以及细菌细胞和光敏剂之间光诱导相互作用的 原位 TEM观察。还讨论了样品制备方法、电子束损伤和成像。

摘要

当前协议描述了用于 原位 光诱导观察的透射电子显微镜（TEM）设置的修改。将玻璃光纤插入物镜极片上方的电子柱中，并使用可调节光源激光器来制造该装置。使用外部测量系统校准照明器后，它允许人们根据观察过程的需要调整照明强度。该照明系统用于对抗菌光动力治疗现象进行成像，这是目前深入研究的主题。通过在碳、石墨烯或氮化硅衬底上点样细菌悬浮液，印迹过量溶液，点样光敏剂溶液，再次吸干过量液体，然后用第二种底物或石墨烯膜组装液池来制备样品。成像实验本身的过程包括使用低放大倍率和最小剂量的电子选择合适的观察地点，然后周期性激活光源，以指定的间隔以最少的电子量捕获后续图像。由于观察到的现象的复杂性，需要仔细记录每次曝光的电子剂量以及使用的照明时间和强度，因为同时该过程既是光驱动的，也是电子驱动的。在进行实际实验后，必须进行额外的控制观察，其中使用相同剂量的电子但没有额外的光影响，并且较小剂量的电子用于更高剂量的光。这使得在生命和材料科学领域将光诱导的微观结构效应与电子引起的微结构效应区分开来成为可能。

引言

高分辨率的光诱导现象在许多领域都很有趣，例如纳米工程¹，²，³，催化^4，5和生物光子学⁶。可以在文献中找到一些允许这种实验的原始设计，包括样品架¹，⁴，⁷，⁸，⁹和连接到显微镜^10，11的光纤的修改。

光照明、液体环境和透射电子显微镜（TEM）的结合为光诱导过程的详细动态研究提供了很好的机会。然而，显微镜内部的高真空条件对许多液体相当不利，尤其是水溶液。液体封装可以保护其免受环境的影响，可以使用一些主要基于石墨烯¹²，氮化硅¹³或碳¹⁴ 基底的技术来实现。除了材料科学研究²外，所谓的液体细胞还提供了对生物标本在其天然条件附近进行非常规显微镜观察的可能性¹⁵。这样的观察要求非常高，特别是对于细菌细胞等活微生物。电子束作为电离辐射对水合标本造成不可逆的损伤，因此必须指定电子剂量¹⁶。这对于最大程度地减少不利影响、控制损坏和避免混淆伪影是必要的。允许观察活细胞的最佳最大电子剂量仍然是一个有问题的话题¹⁶，但30 e^{− / nm 2} 的剂量似乎是阈值，至少对于细菌¹⁷。

此类显微镜研究感兴趣的一些主题是抗菌光动力治疗（APDT）期间的过程¹⁸。简而言之，治疗进行如下。细菌细胞被称为光敏剂的光敏液体包围。当以特定波长进行光照明时，细胞毒性活性氧（ROS）是由激发的光敏剂分子的能量或电荷转移到溶液中天然存在的氧气产生的。暴露于ROS的病原体以非常高的效率快速灭活，没有副作用¹⁹。对于不同的微生物，对治疗的反应各不相同 - 例如，对于革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌²⁰，同一光敏剂的影响可能完全不同。一般来说，已经确定ROS的主要目标是细胞的外部结构，其中损伤导致细胞膜的功能紊乱，从而导致细菌死亡^21，22。然而，对核酸和蛋白质扫描的损伤也被认为是失活的原因¹⁸，因此在此过程中哪些细胞结构是主要靶标仍然未知¹⁹。更深入地了解破坏性过程可能有助于改善这种确定性疗法。与APDT研究中使用的光学显微镜方法²³相比，TEM技术为以更高的分辨率和放大倍率观察APDT机制提供了更多的可能性²⁴。TEM已经成功地用于正在进行的治疗期间的细胞观察，这使我们能够研究革兰氏阳性细菌损伤并详细描述细胞壁内发生的变化^6，25。

目前的协议为使用TEM对光诱导细菌灭活的高分辨率成像提供了一种合适的实验设置，这需要适当的光照明系统，用液体封装细胞以及严格的电子剂量控制。用于观察的细菌是 金黄色葡萄球菌，并使用亚甲蓝溶液作为光敏剂。特殊的光照明设置包括使用光光纤直接连接到显微镜柱的可调谐半导体激光器。由于光纤几乎平行于显微镜轴线，因此这种设计在整个样品中提供了均匀的照射。然后，激光产生的高强度单色光可用于研究各种光化学效应。实验中使用的光的波长等于660nm，因为在可见光区域，亚甲蓝在613nm和664nm处具有吸收峰²⁶。液体封装方案基于碳基质，这使得该过程快速而简单。最后，提出了一种对液体中细胞进行低 剂量原位 TEM观察的方法。讨论了样品制备的难点、电子剂量对敏感样品的影响以及合理的图像解释。

研究方案

1.透射电子显微镜改性

1. 通过将光纤（见 材料表）连接到物镜顶部的显微镜柱来修改透射电子显微镜。物镜和聚光镜之间留出几厘米的空间，外加一个用于存放配件的空闲插槽。
   注意:也可以使用专用样品架⁴ 或反向配置¹ 的阴极发光观察支架。
2. 使用粗真空泵检查系统是否有泄漏。如果系统没有显示真空泄漏，请在高真空下测试系统。
   1. 检查真空系统的驱动是否偏离标准排气显微镜启动。如果模块的执行、组装或调试出现问题，请联系授权服务人员或设备制造商。
      注意:正确制造和安装的照明器不会遮挡电子束。如果光束在显微镜操作过程中连续移动，非导电光纤将无法被金属屏蔽充分覆盖，并会积聚电荷。在这种情况下，将光纤深入导电护套。
3. 使用光电二极管功率传感器测量光强度（参见 材料表）。如果物镜极片之间的空间不允许在显微镜内进行测量，请测量样品和照明器的几何形状，并在外部测量设置中重现这些条件。
4. 如果显微镜没有配备电子剂量测量系统，则通过用法拉第杯测量光束电流（见 材料表）并数值计算击中样品的电子密度²⁷来执行校准。

2. 用光敏剂包封细菌

1. 将两个未经处理的TEM网格覆盖着无定形碳，放在两个交叉的镊子之间，面向碳涂层侧到顶部。使网格尽可能靠近边缘。
   注意:对于某些基材、溶液和样品组合，在一个或两个网格上使用辉光放电来去除工厂杂质并获得最大的亲水表面²⁸ 可能是有益的。以 金黄色葡萄球菌 细菌和亚甲蓝溶液为例，确定在铜网格上未经处理的新碳上获得最佳和最可重复的结果，无需额外的辉光放电或等^{离子清洗6}。
2. 将 4 μL 细菌溶液放在其中一个网格上。样品的光密度必须在5-10的范围内。
   注意:研究中使用的细菌从培养物中纯化并分散在PBS缓冲液中。强烈建议每次使用新鲜样品时检查细菌浓度，例如，按照可用的既定方案使用阴性染色方法²⁹，^30，31。
3. 等待60秒，然后使用滤纸小心地吸干液体。在此过程中，尝试将液体散布在整个网格表面。
4. 将 4 μL 光敏剂放在同一网格上。
   注意:浓度为2μg/ mL的亚甲蓝用作本研究的光敏剂。
5. 5秒后，吸干液体。在基材上留下一层非常薄的液体。
6. 快速将干燥的网格放在覆盖有液体的网格顶部。
7. 轻轻地将上部网格移动到第二个网格的边缘，并使用镊子挤压边缘的基板。
   注意:在此阶段，一些液体可能会从样品中流出，这意味着没有排出足够的液体。然而，这并不一定意味着液体电池的形成将不成功。
8. 小心地重复挤压。
   注意:通过将镊子旋转 90°，使它们垂直于桌子并且两个镊子的尖端保持相同的高度，而不依赖于打开/关闭位置，可以更轻松地执行此步骤。
9. 将液体细胞留在镊子之间1分钟。
10. 完成制备后立即将样品插入TEM支架。
    注意: 支架安装板/环的张力将有助于基材粘附并将液体保持在内部。
    1. 如果可能，将标本支架泵入外部泵站，以减少蒸发液体对显微镜的污染。

3. 细菌细胞液电子剂量效应的 原位 透射电镜观察

1. 将样品插入显微镜。
2. 以低倍率模式开始观察，以找到合适的观察区域。
   注意:由于电子束散射，较暗的区域最有可能是液体。
   1. 在观察过程中，保持电子剂量尽可能低。延长曝光时间（150 kV 加速电压和 5，000 倍放大倍率最多 2 秒）。底部安装相机的5，000倍放大倍率（近似视场为10μm）足以对直径为~1μm的细菌进行成像。
      注意:有时，区分液体并不容易，因此，在观察开始时，将电子束聚焦在可能是液体的地方是有帮助的。液体应该在聚焦的电子束上移动，气泡就会出现。在此验证之后，有必要找到另一个区域进行进一步观察。
3. 在适当的放大倍率下找到被液体包围的细胞，并延长曝光时间，并立即捕获第一张图像。保持电子剂量恒定，每30秒收集一次图像以观察变化。
4. 仔细检查图像并计算对应于细胞中第一个可见变化的总电子剂量²⁷ 。

4. 细菌细胞和光敏剂之间光诱导过程的 原位 TEM观察

1. 在开始实验之前，通过调整电流值来设置激光强度。根据光敏剂的吸收光谱选择合适的波长。根据前面的校准图（步骤1.4.），选择对应于最低光强度的电流值。
   注意:本研究中使用的光波长为660 nm。
2. 将样品插入显微镜并按照步骤3.2找到观察区域。在上一节中。
3. 在开始对样品进行照明之前捕获细胞的第一张图像，并使用光束遮蔽器关闭电子束以避免电子辐射的影响。
4. 打开激光。从较短的照明时间（此处为30秒）开始，因为激光具有相对较高的强度。之后，关闭光源。
5. 关闭光束遮光器并立即捕获图像。如果可能，请使用自动算法仅在拍摄图像所需的时间内曝光样本。仔细测量电子照射时间以计算用于成像的电子剂量²⁷ 。
6. 重复步骤 4.4。和步骤 4.5。以获得预期的光照时间。

结果

该实验装置旨在以高分辨率观察液体中发生的光诱导过程。对图像的竞争分析使我们能够区分电子束造成的损伤与与光化学反应相关的变化。当电子均匀地穿透它时，电子束对敏感样品（在这种情况下，用液体包裹的细胞）的影响在整个照射区域都是可见的。当然，效果取决于电子剂量，因此对于更聚焦的光束，可以更快地观察到样品形态的更显着变化。与这种严重的损伤相比，光动力失活的实?...

讨论

照明器的安装和调试需要基本的维修知识，并且可能会损坏显微镜。将光线引入显微镜的最简单方法是从物镜顶部连接光纤，那里通常有空间容纳TEM偏转线圈和额外的探测器。较旧的顶部入口设备也可以获得更多可用空间，其中相同的位置容纳样品真空锁和样品安装机构。这种配置在先前的报告25中被广泛描述，该报告²⁵包含示例性照明器设计。如果显微镜内部不允许将光纤安装...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carbon film on 200 mesh copper grid	Agar Scientific	AGS160	The standard TEM grids for observations and liquid cell preparation
Crossover Tweezers	Dumont	N5	The tweezers are neecesarry for liquid cell preparation
Photodiode Power Sensor	ThorLabs	S130C	The sensor used for light intensity measurement
Polyimide-Coated Multimode Fiber	Thorlabs	FG400UEP	Must be built into the microscope using the on-site built adapter, according to the 10.1016/j.ultramic.2021.113388
Transmission Electron Microscope	Hitachi	H-800	Can be replaced with any side-entry microscope, available for modification
Tuneable Diode Laser	CNI	MRL-III-660D	The light wavelength must be chosen basing on photosensitizer's absorption spectrum