Microscopía electrónica de transmisión in situ inducida por luz para la observación de la interacción líquido-materia blanda

Resumen

El presente protocolo describe modificaciones del microscopio electrónico de transmisión (TEM) con un sistema de iluminación de luz, la fabricación de células líquidas y observaciones TEM in situ de interacciones inducidas por la luz entre células bacterianas y un fotosensibilizador. También se discuten los métodos de preparación de muestras, el daño del haz de electrones y las imágenes.

Resumen

El protocolo actual describe las modificaciones de la configuración del microscopio electrónico de transmisión (TEM) para observaciones in situ inducidas por la luz. Una fibra óptica de vidrio insertada en la columna de electrones sobre el poste de la lente del objetivo, y un láser, una fuente de luz ajustable, se utilizó para fabricar el dispositivo. Después de que el iluminador ha sido calibrado utilizando un sistema de medición externo, permite ajustar la intensidad de la iluminación a las necesidades del proceso observado. Este sistema de iluminación se utilizó para obtener imágenes de fenómenos de terapia fotodinámica antimicrobiana, que actualmente son objeto de una intensa investigación. La muestra se preparó detectando una suspensión de bacterias en un sustrato de carbono, grafeno o nitruro de silicio, borrando el exceso de solución, detectando la solución fotosensibilizadora, secando el exceso de líquido nuevamente y luego ensamblando la celda líquida con un segundo sustrato o película de grafeno. El proceso del experimento de imágenes en sí incluye elegir el lugar correcto para la observación con el uso de un aumento bajo y una dosis mínima de electrones, y luego la activación cíclica de la fuente de luz para capturar imágenes posteriores a intervalos específicos con la cantidad mínima de electrones necesarios. La dosis de electrones de cada exposición y el tiempo y la intensidad de la iluminación utilizada deben registrarse cuidadosamente debido a la complejidad de los fenómenos observados, ya que, al mismo tiempo, el proceso es impulsado tanto por la luz como por los electrones. Después de realizar el experimento real, se deben realizar observaciones de control adicionales, en las que se usan las mismas dosis de electrones pero sin influencia de luz adicional y se usan dosis más pequeñas de electrones para dosis más altas de luz. Esto permite distinguir los efectos microestructurales inducidos por la luz de los causados por los electrones tanto en el campo de la vida como en el de la ciencia de los materiales.

Introducción

Los fenómenos inducidos por la luz en alta resolución son interesantes en muchos campos como la nanoingeniería 1,2,3, la catálisis ^4,5 y la biofotónica⁶. Algunos diseños originales que permiten tales experimentos se pueden encontrar en la literatura, incluyendo modificaciones de los portamuestras 1,4,7,8,9 y la fibra óptica unida al microscopio ^10,11.

La combinación de iluminación de luz, un ambiente líquido y microscopía electrónica de transmisión (TEM) brinda una gran oportunidad para estudios detallados y dinámicos de procesos fotoinducidos. Sin embargo, la condición de alto vacío dentro del microscopio es bastante desfavorable para muchos líquidos, especialmente soluciones de agua. La encapsulación líquida, que lo protege del medio ambiente, se puede lograr utilizando algunas técnicas basadas principalmente en sustratos de grafeno 12, nitruro de silicio¹³ o carbono¹⁴. Además de la investigación en ciencia de materiales², las llamadas células líquidas ofrecen posibilidades para realizar observaciones microscópicas no convencionales en especímenes biológicos cerca de sus condiciones nativas¹⁵. Tales observaciones son extremadamente exigentes, especialmente para microorganismos vivos como las células bacterianas. El haz de electrones como radiación ionizante causa daños irreversibles a las muestras hidratadas, por lo que la dosis de electrones debe especificarse¹⁶. Esto es necesario para minimizar los efectos desfavorables, controlar el daño y evitar artefactos confusos. La dosis máxima óptima de electrones que permite observaciones de células vivas sigue siendo un tema cuestionable¹⁶, pero la dosis de 30 e⁻/nm² parece ser el valor umbral, al menos para las bacterias¹⁷.

Algunos de los temas de interés para tales estudios microscópicos son los procesos durante la terapia fotodinámica antimicrobiana (APDT)¹⁸. En resumen, la terapia procede de la siguiente manera. Las células bacterianas están rodeadas por el líquido fotosensible llamado fotosensibilizador. Cuando la iluminación de la luz se da a una longitud de onda específica, las especies reactivas citotóxicas de oxígeno (ROS) se generan a partir de la transferencia de energía o carga de las moléculas fotosensibilizadoras excitadas al oxígeno naturalmente presente en la solución. Los patógenos expuestos a ROS se inactivan rápidamente con una eficiencia muy alta, sin efectos secundarios¹⁹. La respuesta a la terapia varía para distintos microbios; por ejemplo, el impacto del mismo fotosensibilizador puede ser bastante diferente para las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas²⁰. En general, se ha establecido que el objetivo principal de ROS son las estructuras externas de las células, donde el daño resulta en trastornos funcionales de la membrana celular y, en consecuencia, conducen a la muerte de las bacterias^21,22. Sin embargo, el daño a los ácidos nucleicos y proteínas también puede considerarse una causa de inactivación¹⁸, por lo que aún se desconoce qué estructuras celulares son los principales objetivos durante este proceso¹⁹. Una comprensión más profunda de los procesos dañinos podría ayudar a mejorar esta terapia definitiva. En comparación con los métodos de microscopía óptica utilizados en la investigación de APDT²³, las técnicas TEM ofrecen más posibilidades de observar el mecanismo APDT con mayor resolución y aumento²⁴. TEM ya se ha utilizado con éxito para la observación celular durante la terapia en curso, lo que nos permitió estudiar el daño bacteriano grampositivo y describir los cambios que ocurren dentro de la pared celular en detalle ^6,25.

El protocolo actual presenta una configuración experimental adecuada para imágenes de alta resolución de la inactivación de bacterias inducida por la luz utilizando TEM, que requiere un sistema de iluminación de luz adecuado, la encapsulación de células con un líquido y un estricto control de la dosis de electrones. La bacteria utilizada para la observación fue Staphylococcus aureus, y se utilizó una solución de azul de metileno como fotosensibilizador. La configuración especial de iluminación de luz comprende un láser semiconductor sintonizable conectado directamente a la columna del microscopio utilizando la fibra de luz. Este diseño proporciona una irradiación uniforme en toda la muestra debido a la colocación casi paralela de la fibra óptica en el eje del microscopio. La luz monocromática de alta intensidad generada por el láser se puede utilizar para estudiar diversos efectos fotoquímicos. La luz utilizada en el experimento tenía una longitud de onda igual a 660 nm porque, en la región visible, el azul de metileno tiene picos de absorción a 613 nm y 664 nm²⁶. El protocolo para la encapsulación líquida se basa en sustratos de carbono, lo que hace que el procedimiento sea rápido y sin complicaciones. Finalmente, se presenta un método para la observación de TEM in situ de baja dosis de células en líquido. Se discuten las dificultades con respecto a la preparación de la muestra, los efectos de la dosis de electrones en la muestra sensible y la interpretación razonable de la imagen.

Protocolo

1. Modificación del microscopio electrónico de transmisión

1. Modifique el microscopio electrónico de transmisión conectando la fibra óptica (consulte la Tabla de materiales) a la columna del microscopio en la parte superior de la lente del objetivo. Permita unos pocos centímetros de espacio entre la lente del objetivo y la lente del condensador, además de una ranura libre para accesorios.
   NOTA: También se puede emplear un portamuestras dedicado⁴ o un soporte para observaciones cattodoluminiscentes en configuración inversa¹ .
2. Compruebe si el sistema tiene fugas utilizando bombas de vacío rugosas. Si el sistema no muestra una fuga de vacío, pruebe el sistema bajo un vacío alto.
   1. Compruebe que el accionamiento del sistema de vacío no se desvíe del inicio estándar del microscopio ventilado. En caso de problemas con la ejecución, montaje o puesta en marcha del módulo, póngase en contacto con el personal de servicio autorizado o con el fabricante del dispositivo.
      NOTA: El iluminador correctamente fabricado y montado no oscurecerá el haz de electrones. Si el haz se desplaza sucesivamente durante el funcionamiento del microscopio, la fibra óptica no conductora no estará suficientemente cubierta con un blindaje metálico y acumulará una carga eléctrica. En este caso, deslice la fibra óptica profundamente en la cubierta conductora.
3. Mida la intensidad de la luz utilizando el sensor de potencia de fotodiodo (consulte la Tabla de materiales). Si el espacio entre las piezas del polo de la lente del objetivo no permite la medición dentro del microscopio, mida la geometría de la muestra y del iluminador y reproduzca estas condiciones en una configuración de medición externa.
4. Si el microscopio no está equipado con un sistema de medición de dosis de electrones, realice la calibración midiendo la corriente del haz con una copa de Faraday (consulte la Tabla de materiales) y calculando numéricamente la densidad de los electrones que golpean la muestra²⁷.

2. Encapsulación de bacterias con el fotosensibilizador

1. Coloque dos rejillas TEM sin tratar cubiertas con carbono amorfo entre dos pinzas cruzadas orientadas hacia el lado recubierto de carbono hacia la parte superior. Mantenga las rejillas lo más cerca posible del borde.
   NOTA: Para ciertas combinaciones de sustrato, solución y muestra, puede ser beneficioso utilizar descarga luminosa en una o ambas mallas para eliminar las impurezas de fábrica y obtener una superficie hidrófila máxima²⁸. Utilizando el ejemplo de la bacteria S. aureus y la solución de azul de metileno, se determinó que los mejores y más reproducibles resultados se obtuvieron en carbono nuevo, no tratado en rejillas de cobre sin descarga incandescente adicional o limpieza por plasma⁶.
2. Ponga 4 μL de solución bacteriana en una de las rejillas. La densidad óptica de la muestra debe estar en el rango de 5-10.
   NOTA: Las bacterias utilizadas en el estudio se purificaron del cultivo y se dispersaron en tampón PBS. Se recomienda encarecidamente verificar la concentración de bacterias en la muestra fresca cada vez que se utilice, por ejemplo, utilizando métodos de tinción negativa, siguiendo los protocolos establecidos disponibles 29,30,31.
3. Espere 60 s y seque cuidadosamente el líquido con papel de filtro. Trate de esparcir el líquido por toda la superficie de la rejilla durante este proceso.
4. Coloque 4 μL de fotosensibilizador en la misma rejilla.
   NOTA: El azul de metileno a una concentración de 2 μg/ml se utilizó como fotosensibilizador para el presente estudio.
5. Después de 5 s, borre el líquido. Deje una capa muy delgada de líquido sobre el sustrato.
6. Coloque rápidamente la rejilla seca encima de la cubierta con líquido.
7. Mueva suavemente la rejilla superior hasta el borde de la segunda y apriete los sustratos en los bordes con pinzas.
   NOTA: Algo de líquido puede fluir fuera de la muestra en esta etapa, lo que significa que no se drenó lo suficiente. Sin embargo, esto no significa necesariamente que la formación de la célula líquida no tendrá éxito.
8. Repita cuidadosamente el apretón.
   NOTA: Es más fácil realizar este paso girando las pinzas 90° para que queden perpendiculares a la mesa y las puntas de ambas pinzas permanezcan a la misma altura, sin depender de la posición de apertura/cierre.
9. Deje la celda líquida entre las pinzas durante 1 minuto.
10. Inserte la muestra en el soporte TEM justo después de terminar la preparación.
    NOTA: La tensión de la placa / anillo de montaje del soporte ayudará a que los sustratos se adhieran y mantengan el líquido en el interior.
    1. Si es posible, bombee el portamuestras a una estación de bombeo externa para reducir la contaminación del microscopio por evaporación del líquido.

3. Observaciones TEM in situ de células bacterianas en efecto de dosis de electrones líquidos

1. Inserte la muestra en el microscopio.
2. Inicie las observaciones en modo de bajo aumento para encontrar un área de observación adecuada.
   NOTA: Las áreas más oscuras tienen más probabilidades de ser líquidas debido a la dispersión del haz de electrones.
   1. Durante las observaciones, mantenga la dosis de electrones lo más baja posible. Amplíe el tiempo de exposición (hasta 2 s para una tensión de aceleración de 150 kV y un aumento de 5.000x). El aumento de 5.000x para la cámara de montaje inferior (el campo de visión aproximado es de 10 μm) es suficiente para obtener imágenes de bacterias con un diámetro de ~ 1 μm.
      NOTA: A veces, no es fácil distinguir el líquido, por lo que, al comienzo de las observaciones, es útil enfocar el haz de electrones donde es probable que sea líquido. El líquido debe moverse sobre un haz de electrones enfocado, y aparecerán las burbujas. Después de esta verificación, es necesario encontrar otra área para observaciones adicionales.
3. Encuentre las celdas rodeadas de líquido con el aumento apropiado con un tiempo de exposición prolongado y capture la primera imagen inmediatamente. Mantenga constante la dosis de electrones y recopile imágenes cada 30 s para observar los cambios.
4. Examine cuidadosamente las imágenes y calcule la dosis total de electrones²⁷ que corresponde a los primeros cambios visibles en las células.

4. Observaciones TEM in situ de procesos inducidos por la luz entre células bacterianas y fotosensibilizadores

1. Antes de comenzar el experimento, ajuste la intensidad de la luz láser ajustando el valor actual. Elija la longitud de onda adecuada de acuerdo con el espectro de absorción del fotosensibilizador. De acuerdo con la gráfica de calibración anterior (paso 1.4.), elija el valor actual correspondiente a la intensidad de luz más baja.
   NOTA: La longitud de onda de la luz utilizada en este estudio fue de 660 nm.
2. Inserte la muestra en el microscopio y encuentre el área de observación siguiendo el paso 3.2. en la sección anterior.
3. Capture la primera imagen de la célula antes de comenzar la iluminación de la muestra y use la manta del haz para apagar el haz de electrones y evitar los efectos de la irradiación de electrones.
4. Encienda el láser. Comience con un tiempo de iluminación corto (aquí 30 s) ya que la luz láser tiene una intensidad relativamente alta. Después de ese tiempo, apague la fuente de luz.
5. Apague la manta de haz y capture la imagen inmediatamente. Si es posible, utilice un algoritmo automático para exponer la muestra sólo durante el tiempo necesario para tomar la imagen. Mida cuidadosamente el tiempo de irradiación de electrones para calcular la dosis de electrones²⁷ utilizada para obtener imágenes.
6. Repita el paso 4.4. y paso 4.5. para obtener el tiempo de iluminación de la luz esperado.

Resultados

La configuración experimental fue diseñada para observar los procesos inducidos por la luz que ocurren en un líquido con alta resolución. El análisis competitivo de las imágenes nos permitió distinguir el daño causado por el haz de electrones de los cambios relacionados con la reacción fotoquímica. El efecto del haz de electrones en la muestra sensible (en este caso, las células encapsuladas con líquido) fue visible en toda el área irradiada a medida que los electrones penetraban a través de ella uniformeme...

Discusión

La instalación y puesta en marcha del iluminador requieren conocimientos básicos de servicio y pueden dañar el microscopio. La forma más sencilla de introducir la luz en el microscopio es conectar la fibra óptica desde la parte superior de la lente del objetivo, donde generalmente hay espacio para las bobinas de deflexión TEM y detectores adicionales. También se puede esperar más espacio libre de los dispositivos de entrada superior más antiguos, donde la misma ubicación alberga el bloqueo de vacío de muestra ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carbon film on 200 mesh copper grid	Agar Scientific	AGS160	The standard TEM grids for observations and liquid cell preparation
Crossover Tweezers	Dumont	N5	The tweezers are neecesarry for liquid cell preparation
Photodiode Power Sensor	ThorLabs	S130C	The sensor used for light intensity measurement
Polyimide-Coated Multimode Fiber	Thorlabs	FG400UEP	Must be built into the microscope using the on-site built adapter, according to the 10.1016/j.ultramic.2021.113388
Transmission Electron Microscope	Hitachi	H-800	Can be replaced with any side-entry microscope, available for modification
Tuneable Diode Laser	CNI	MRL-III-660D	The light wavelength must be chosen basing on photosensitizer's absorption spectrum