Sıvı-Yumuşak Madde Etkileşiminin Gözlemlenmesi için Işık Kaynaklı In Situ İletim Elektron Mikroskobu

Özet

Mevcut protokol, bir ışık aydınlatma sistemi ile iletim elektron mikroskobu (TEM) modifikasyonlarını, sıvı hücrelerin üretimini ve bakteri hücreleri ile bir fotosensitizör arasındaki ışık kaynaklı etkileşimlerin yerinde TEM gözlemlerini açıklamaktadır. Numune hazırlama yöntemleri, elektron ışını hasarı ve görüntüleme de tartışılmaktadır.

Özet

Mevcut protokol, in situ ışık kaynaklı gözlemler için iletim elektron mikroskobu (TEM) kurulumunun modifikasyonlarını açıklamaktadır. Cihazı imal etmek için objektif lens kutup parçasının üzerindeki elektron sütununa yerleştirilmiş bir cam optik fiber ve ayarlanabilir bir ışık kaynağı olan bir lazer kullanıldı. Aydınlatıcı harici bir ölçüm sistemi kullanılarak kalibre edildikten sonra, aydınlatmanın yoğunluğunu gözlemlenen işlemin ihtiyaçlarına göre ayarlamaya izin verir. Bu aydınlatma sistemi, şu anda yoğun araştırmalara konu olan antimikrobiyal fotodinamik terapi fenomenlerini görüntülemek için kullanılmıştır. Numune, bir karbon, grafen veya silikon nitrür substratı üzerinde bir bakteri süspansiyonu tespit edilerek, fazla çözeltinin lekelenmesiyle, fotosensitizör çözeltisinin tespit edilmesiyle, fazla sıvının tekrar lekelenmesiyle ve daha sonra sıvı hücrenin ikinci bir substrat veya grafen filmi ile birleştirilmesiyle hazırlandı. Görüntüleme deneyinin kendisi, düşük büyütme ve minimum dozda elektron kullanımı ile gözlem için doğru yeri seçmeyi ve daha sonra gerekli minimum elektron miktarı ile belirli aralıklarla sonraki görüntüleri yakalamak için ışık kaynağının döngüsel aktivasyonunu içerir. Her maruziyetin elektron dozu ve kullanılan aydınlatmanın zamanı ve yoğunluğu, gözlemlenen fenomenlerin karmaşıklığı nedeniyle dikkatlice kaydedilmelidir, çünkü aynı zamanda süreç hem ışık hem de elektron güdümlüdür. Gerçek deney yapıldıktan sonra, aynı dozda elektronların kullanıldığı, ancak ek ışık etkisi olmadan ve daha yüksek ışık dozları için daha küçük dozlarda elektronların kullanıldığı ek kontrol gözlemleri yapılmalıdır. Bu, ışığın neden olduğu mikroyapısal etkileri, hem yaşam hem de malzeme bilimi alanlarında elektronların neden olduğu etkilerden ayırt etmeyi mümkün kılar.

Giriş

Yüksek çözünürlükte ışık kaynaklı fenomenler, nanomühendislik 1,2,3, kataliz ^4,5 ve biyofotonik⁶ gibi birçok alanda ilginçtir. Bu tür deneylere izin veren bazı orijinal tasarımlar, örnek tutucuların 1,4,7,8,9 ve mikroskopa bağlı optik fiber ^10,11'in modifikasyonları da dahil olmak üzere literatürde ^bulunabilir.

Işık aydınlatması, sıvı bir ortam ve transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kombinasyonu, foto-indüklenen süreçlerin ayrıntılı, dinamik çalışmaları için harika bir fırsat sunar. Bununla birlikte, mikroskop içindeki yüksek vakum koşulu, birçok sıvı, özellikle de su çözeltileri için oldukça elverişsizdir. Onu çevreden koruyan sıvı kapsülleme, esas olarak grafen¹², silikon nitrür 13 veya karbon¹⁴ substratlarına dayanan birkaç teknik kullanılarak elde edilebilir. Malzeme bilimi^2'deki araştırmalara ek olarak, sözde sıvı hücreler, doğal koşullarına yakın biyolojik örnekler üzerinde alışılmadık mikroskobik gözlemler yapma olanakları sunar¹⁵. Bu tür gözlemler, özellikle bakteri hücreleri gibi canlı mikroorganizmalar için son derece zordur. İyonlaştırıcı radyasyon olarak elektron ışını, hidratlanmış numunelerde geri dönüşü olmayan hasara neden olur, bu nedenle elektron dozu^{belirtilmelidir 16}. Bu, olumsuz etkileri en aza indirmek, hasarı kontrol etmek ve kafa karıştırıcı yapıtlardan kaçınmak için gereklidir. Canlı hücrelerin gözlemlenmesine izin veren optimal maksimum elektron dozu hala şüpheli bir konu^16'dır, ancak 30 ^e-/ nm² dozu, en azından bakteri¹⁷ için eşik değer gibi görünmektedir.

Bu tür mikroskobik çalışmalar için ilgi çekici konulardan bazıları, antimikrobiyal fotodinamik tedavi (APDT) sırasındaki ^{süreçlerdir18}. Kısacası terapi şu şekilde ilerler. Bakteri hücreleri, fotosensitizör adı verilen ışığa duyarlı sıvı ile çevrilidir. Işık aydınlatması belirli bir dalga boyunda verildiğinde, sitotoksik reaktif oksijen türleri (ROS), uyarılmış fotosensitizör moleküllerden çözeltide doğal olarak bulunan oksijene enerji veya yük transferinden üretilir. ROS'a maruz kalan patojenler, hiçbir yan etkisi olmadan, çok yüksek verimlilikle hızlı bir şekilde inaktive edilir¹⁹. Tedaviye verilen yanıt farklı mikroplar için değişir – örneğin, aynı fotosensitizörün etkisi Gram-pozitif ve Gram-negatif bakteriler için oldukça farklı olabilir²⁰. Genel olarak, ROS'un ana hedefinin, hasarın hücre zarının fonksiyonel bozukluklarına neden olduğu ve sonuç olarak bakterilerin ölümüne yol açtığı hücrelerin dış yapıları olduğu tespit edilmiştir^21,22. Bununla birlikte, nükleik asitlere ve proteinlere verilen hasar, inaktivasyonun bir nedeni olarak da düşünülebilir¹⁸, bu nedenle bu işlem sırasında hangi hücre yapılarının ana hedefler olduğu hala bilinmemektedir¹⁹. Zarar verici süreçlerin daha derin bir şekilde anlaşılması, bu kesin tedavinin iyileştirilmesine yardımcı olabilir. APDT araştırması^23'te kullanılan ışık mikroskobu yöntemleriyle karşılaştırıldığında, TEM teknikleri APDT mekanizmasına daha yüksek çözünürlük ve büyütme ile bakmak için daha fazla olanak sağlar²⁴. TEM, devam eden tedavi sırasında hücre gözlemi için zaten başarıyla kullanılmıştır, bu da Gram-pozitif bakteri hasarını incelememize ve hücre duvarında meydana gelen değişiklikleri ayrıntılı olarak tanımlamamıza izin verdi ^6,25.

Mevcut protokol, uygun bir ışık aydınlatma sistemi, hücrelerin bir sıvı ile kapsüllenmesi ve sıkı elektron dozu kontrolü gerektiren TEM kullanarak ışığa bağlı bakteri inaktivasyonunun yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi için uygun bir deneysel kurulum sunmaktadır. Gözlem için kullanılan bakteriler Staphylococcus aureus idi ve fotosensitizör olarak metilen mavisi bir çözelti kullanıldı. Özel ışık aydınlatma kurulumu, ışık fiberi kullanılarak doğrudan mikroskop kolonuna bağlanan ayarlanabilir bir yarı iletken lazerden oluşur. Bu tasarım, optik fiberin mikroskop eksenine neredeyse paralel yerleştirilmesi nedeniyle numune boyunca eşit ışınlama sağlar. Lazer tarafından üretilen yüksek yoğunluklu monokromatik ışık daha sonra çeşitli fotokimyasal etkileri incelemek için kullanılabilir. Deneyde kullanılan ışık 660 nm'ye eşit bir dalga boyuna sahipti, çünkü görünür bölgede metilen mavisi 613 nm ve 664 nm^26'da absorpsiyon zirvelerine sahipti. Sıvı kapsülleme protokolü, prosedürü hızlı ve karmaşık hale getiren karbon substratlarına dayanmaktadır. Son olarak, sıvı içindeki hücrelerin düşük doz in situ TEM gözlemi için bir yöntem sunulmuştur. Numune hazırlama ile ilgili zorluklar, hassas numune üzerindeki elektron dozu etkileri ve makul görüntü yorumlama tartışılmıştır.

Protokol

1. İletim elektron mikroskobu modifikasyonu

1. Optik fiberi (bkz. Malzeme Tablosu) objektif lensin üstündeki mikroskop sütununa bağlayarak iletim elektron mikroskobunu değiştirin. Objektif lens ile kondansatör lens arasında birkaç santimetre boşluk bırakın, ayrıca aksesuarlar için boş bir yuva bırakın.
   NOT: Özel bir numune tutucu⁴ veya ters konfigürasyon^1'deki katodoluminesan gözlemler için bir tutucu da kullanılabilir.
2. Kaba vakum pompaları kullanarak sistemde sızıntı olup olmadığını kontrol edin. Sistem vakum sızıntısı göstermiyorsa, sistemi yüksek vakum altında test edin.
   1. Vakum sisteminin çalıştırılmasının standart havalandırmalı mikroskop başlangıcından sapmadığını kontrol edin. Modülün çalıştırılması, montajı veya devreye alınması ile ilgili sorunlar olması durumunda, yetkili servis personeline veya cihaz üreticisine başvurun.
      NOT: Doğru yapılmış ve monte edilmiş aydınlatıcı, elektron ışınını gizlemeyecektir. Işın mikroskobun çalışması sırasında art arda değişirse, iletken olmayan optik fiber metal bir kalkanla yeterince kaplanmayacak ve bir elektrik yükü biriktirecektir. Bu durumda, optik fiberi iletken ceketin derinliklerine kaydırın.
3. Fotodiyot güç sensörünü kullanarak ışık yoğunluğunu ölçün (bkz. Objektif lensin kutup parçaları arasındaki boşluk mikroskop içinde ölçüme izin vermiyorsa, numunenin ve aydınlatıcının geometrisini ölçün ve bu koşulları harici bir ölçüm kurulumunda yeniden üretin.
4. Mikroskop bir elektron dozu ölçüm sistemi ile donatılmamışsa, ışın akımını bir Faraday kabı ile ölçerek (bakınız Malzeme Tablosu) ve numuneye çarpan elektronların yoğunluğunu sayısal olarak hesaplayarak kalibrasyonu gerçekleştirin²⁷.

2. Bakterilerin fotosensitizör ile kapsüllenmesi

1. Amorf karbonla kaplı iki işlenmemiş TEM ızgarasını, karbon kaplı tarafa bakan iki çapraz cımbız arasına yerleştirin. Izgaraları kenara mümkün olduğunca yakın tutun.
   NOT: Belirli substrat, çözelti ve numune kombinasyonları için, fabrika safsızlıklarını gidermek ve maksimum hidrofilik yüzey elde etmek için bir veya her iki ağda kızdırma deşarjı kullanmak faydalı olabilir²⁸. S. aureus bakterileri ve metilen mavisi çözeltisi örneği kullanılarak, ek kızdırma deşarjı veya plazma temizliği olmadan bakır ızgaralarda yeni, işlenmemiş karbon üzerinde en iyi ve en tekrarlanabilir sonuçların elde edildiği belirlenmiştir⁶.
2. Izgaralardan birine 4 μL bakteri çözeltisi koyun. Numunenin optik yoğunluğu 5-10 aralığında olmalıdır.
   NOT: Çalışmada kullanılan bakteriler kültürden saflaştırıldı ve PBS tamponunda dağıldı. Taze numunedeki bakteri konsantrasyonunun, örneğin negatif boyama yöntemlerini kullanarak, mevcut^29,30,31 yerleşik protokolleri izleyerek her seferinde kontrol edilmesi şiddetle tavsiye edilir.
3. 60 saniye bekleyin ve filtre kağıdı kullanarak sıvıyı dikkatlice lekeleyin. Bu işlem sırasında sıvıyı tüm ızgara yüzeyine yaymaya çalışın.
4. Aynı ızgaraya 4 μL fotosensitizör koyun.
   NOT: Bu çalışmada fotosensitizör olarak 2 μg/mL konsantrasyonda metilen mavisi kullanılmıştır.
5. 5 s'den sonra sıvıyı kurulayın. Substrat üzerinde çok ince bir sıvı tabakası bırakın.
6. Kuru ızgarayı sıvı ile kaplı olanın üzerine hızlıca yerleştirin.
7. Üst ızgarayı yavaşça ikincisinin kenarına hareket ettirin ve cımbız kullanarak kenarlardaki substratları sıkın.
   NOT: Bu aşamada numuneden bir miktar sıvı akabilir, bu da yeterince boşaltılmadığı anlamına gelir. Bununla birlikte, bu mutlaka sıvı hücrenin oluşumunun başarısız olacağı anlamına gelmez.
8. Sıkmayı dikkatlice tekrarlayın.
   NOT: Bu adımı, cımbızları masaya dik duracak şekilde 90° döndürerek gerçekleştirmek daha kolaydır ve her iki cımbızın ucu da açık/kapalı konuma bağlı olarak aynı yükseklikte kalır.
9. Sıvı hücreyi cımbız arasında 1 dakika bekletin.
10. Hazırlığı bitirdikten hemen sonra numuneyi TEM tutucuya yerleştirin.
    NOT: Tutucu montaj plakasının/halkasının gerginliği, alt tabakaların sıvıyı içeride tutmasına ve tutmasına yardımcı olacaktır.
    1. Mümkünse, sıvıyı buharlaştırarak mikroskobun kirlenmesini azaltmak için numune tutucuyu harici bir pompa istasyonuna pompalayın.

3. Sıvı-elektron doz etkisinde bakteri hücrelerinin yerinde TEM gözlemleri

1. Numuneyi mikroskopa yerleştirin.
2. Uygun bir gözlem alanı bulmak için gözlemleri düşük büyütme modunda başlatın.
   NOT: Daha koyu bölgelerin elektron ışını saçılması nedeniyle sıvı olma olasılığı daha yüksektir.
   1. Gözlemler sırasında, elektron dozunu mümkün olduğunca düşük tutun. Pozlama süresini genişletin (150 kV'luk bir hızlanma voltajı ve 5.000x büyütme için 2 sn'ye kadar). Alttan montajlı kamera için 5.000x büyütme (yaklaşık görüş alanı 10 μm'dir), ~1 μm çapındaki bakterileri görüntülemek için yeterlidir.
      NOT: Bazen, sıvıyı ayırt etmek kolay değildir, bu nedenle, gözlemlerin başında, elektron ışınını sıvı olması muhtemel yere odaklamak yararlıdır. Sıvı, odaklanmış bir elektron ışını üzerinde hareket etmeli ve kabarcıklar görünecektir. Bu doğrulamadan sonra, daha fazla gözlem için başka bir alan bulmak gerekir.
3. Sıvıyla çevrili hücreleri, uzatılmış pozlama süresiyle uygun büyütmede bulun ve ilk görüntüyü hemen yakalayın. Elektron dozunu sabit tutun ve değişiklikleri gözlemlemek için her 30 saniyede bir görüntü toplayın.
4. Görüntüleri dikkatlice inceleyin ve hücrelerdeki ilk görünür değişikliklere karşılık gelen toplam elektron dozu^27'yi hesaplayın.

4. Bakteriyel hücreler ve fotosensitizör arasındaki ışığa bağlı süreçlerin yerinde TEM gözlemleri

1. Deneye başlamadan önce, mevcut değeri ayarlayarak lazer ışık yoğunluğunu ayarlayın. Fotosensitizörün absorpsiyon spektrumuna göre uygun dalga boyunu seçin. Önceki kalibrasyon grafiğine göre (adım 1.4.), en düşük ışık yoğunluğuna karşılık gelen mevcut değeri seçin.
   NOT: Bu çalışmada kullanılan ışık dalga boyu 660 nm idi.
2. Numuneyi mikroskopa yerleştirin ve adım 3.2'yi izleyerek gözlem alanını bulun. önceki bölümde.
3. Numunenin aydınlatılmasına başlamadan önce hücrenin ilk görüntüsünü yakalayın ve elektron ışınlamasının etkilerinden kaçınmak için elektron ışınını kapatmak için ışın karartıcısını kullanın.
4. Lazeri açın. Lazer ışığı nispeten yüksek yoğunluğa sahip olduğu için kısa bir aydınlatma süresiyle (burada 30 s) başlayın. Bu süreden sonra, ışık kaynağını kapatın.
5. Işın karartıcıyı kapatın ve görüntüyü hemen yakalayın. Mümkünse, örneği yalnızca görüntüyü çekmek için gereken süre boyunca ortaya çıkarmak için otomatik bir algoritma kullanın. Görüntüleme için kullanılan elektron dozu^27'yi hesaplamak için elektron ışınlama süresini dikkatlice ölçün.
6. 4.4 adımını yineleyin. ve adım 4.5. beklenen ışık aydınlatma süresini elde etmek için.

Sonuçlar

Deney düzeneği, yüksek çözünürlüklü bir sıvıda meydana gelen ışık kaynaklı süreçleri gözlemlemek için tasarlanmıştır. Görüntülerin rekabetçi analizi, elektron ışınının neden olduğu hasarı fotokimyasal reaksiyonla ilgili değişikliklerden ayırt etmemizi sağladı. Elektron ışınının hassas numune üzerindeki etkisi (bu durumda, sıvı ile kapsüllenmiş hücreler), elektronlar düzgün bir şekilde nüfuz ettikçe ışınlanmış alanın her yerinde görülebiliyordu. Tabii ki, etki ...

Tartışmalar

Aydınlatıcının kurulumu ve devreye alınması temel servis bilgisi gerektirir ve mikroskopa zarar verebilir. Işığı mikroskopa tanıtmanın en basit yolu, optik fiberi, genellikle TEM sapma bobinleri ve ek dedektörler için yer bulunan objektif lensin üstünden bağlamaktır. Aynı konumun numune vakum kilidini ve numune kurulum mekanizmasını barındırdığı eski üstten girişli cihazlardan daha fazla boş alan da beklenebilir. Bu yapılandırma, örnek bir aydınlatıcı tasarımı içeren önceki bir rapo...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carbon film on 200 mesh copper grid	Agar Scientific	AGS160	The standard TEM grids for observations and liquid cell preparation
Crossover Tweezers	Dumont	N5	The tweezers are neecesarry for liquid cell preparation
Photodiode Power Sensor	ThorLabs	S130C	The sensor used for light intensity measurement
Polyimide-Coated Multimode Fiber	Thorlabs	FG400UEP	Must be built into the microscope using the on-site built adapter, according to the 10.1016/j.ultramic.2021.113388
Transmission Electron Microscope	Hitachi	H-800	Can be replaced with any side-entry microscope, available for modification
Tuneable Diode Laser	CNI	MRL-III-660D	The light wavelength must be chosen basing on photosensitizer's absorption spectrum