突触膜的微移植以重新激活人突触受体以进行功能研究

摘要

该方案表明，通过将突触膜微移植到 非洲爪蟾 卵母细胞中，可以记录α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸和γ-氨基丁酸受体的一致和可靠的反应。

摘要

兴奋性和抑制性离子型受体是离子通量的主要门，它们决定生理神经元通讯过程中突触的活性。因此，已经观察到它们的丰度，功能和与其他突触元素的关系的变化是神经退行性疾病和精神障碍中大脑功能改变和认知障碍的主要相关因素。了解兴奋性和抑制性突触受体的功能如何被疾病改变对于开发有效的治疗方法至关重要。为了获得与疾病相关的信息，重要的是要记录在患病人脑中保持功能的神经递质受体的电活性。到目前为止，这是评估受体功能病理改变的最接近的方法。在这项工作中，提出了一种进行突触膜微移植的方法，其包括通过注射和后融合到 非洲爪蟾 卵母细胞的膜中，从含有人类受体的速冻人脑组织中重新激活突触膜。该方案还提供了获得α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸（AMPA）和γ-氨基丁酸（GABA）受体的一致和可靠反应的方法学策略，以及用于归一化和严格数据分析的新型详细方法。

引言

神经退行性疾病影响很大一部分人群。虽然它们的毁灭性后果是众所周知的，但神经递质受体的功能改变与它们的症状之间的联系仍然知之甚少，这对大脑功能至关重要。个体间变异性，疾病的慢性性质和症状的隐匿发作只是延迟理解许多脑部疾病的一些原因，在这些疾病中，化学失衡有充分的记录^1，2。动物模型产生了宝贵的信息，并扩展了我们对进化保守系统中生理学和病理生理学机制的了解;然而，啮齿动物和人类之间的几个种间差异排除了从动物模型到人脑的受体功能的直接外推³。因此，研究天然人类受体的最初努力是由Ricardo Miledi的实验室使用手术去除的组织和冷冻样品开发的。这些初始实验使用包括神经元突触和额外突触受体以及非神经元神经递质受体在内的全膜，尽管它们提供了有关患病状态的重要信息，但人们担心受体的混合会使数据的解释复杂化^{4，5，6，7}。重要的是，突触是许多神经退行性疾病的主要靶点^8，9;因此，测试受影响突触的功能特性的测定是获取有关影响突触通讯的疾病相关变化的信息的基础。这里，描述了原始方法的修改:突触膜微移植（MSM），其重点是富集突触蛋白制剂的生理表征，并已成功应用于研究大鼠和人突触体^{10，11，12，13，14，15}.通过这种方法，可以移植曾经在人脑中起作用的突触受体，嵌入到它们自己的天然脂质中，并与它们自己的相关蛋白质队列一起移植。而且，由于MSM数据是定量的，因此可以使用该数据与大型蛋白质组学或测序数据集¹⁰集成。

重要的是要注意，突触受体的许多药理学和生物物理分析都是在重组蛋白^16，17上进行的。虽然这种方法可以更好地了解受体的结构 - 功能关系，但它无法提供有关神经元中发现的复杂多聚体受体复合物及其疾病变化的信息。因此，天然蛋白和重组蛋白的组合应该提供更全面的突触受体分析。

有许多方法可以制备突触体^{10，11，12，13，14，15} ，可以根据实验室的要求进行调整。该方案首先假设突触体富集制剂被分离并准备用于微移植实验。在实验室中，按照制造商的说明使用 Syn-Per 方法。这是因为电生理学实验中的高再现性^10，11。还有大量文献解释如何分离 非洲爪蟾 卵母细胞^18，19，其也可以购买准备注射²⁰。

研究方案

所有研究均按照机构指南进行，并得到加州大学欧文分校动物护理和使用委员会（IACUC-1998-1388）和德克萨斯大学医学分会（IACUC-1803024）的批准。加州大学欧文分校阿尔茨海默病研究中心（UCI-ADRC）提供了来自非阿尔茨海默病（AD）大脑（女性，74岁，死后间隔2.8小时）和AD脑（女性，74岁，死后间隔4.5小时）的颞叶皮层。UCI-ADRC获得了大脑捐赠的知情同意。

注意:未固定的人脑组织应被视为血源性病原体（BBP）的来源。因此，在开始实验之前需要BBP培训。该方案根据BSL2要求在生物安全2级（BSL2）实验室进行。实验室内的指导方针和预防措施包括:实验室内不允许携带食物或饮料，必须遵循良好的实验室规范，需要个人防护设备（手套，防护服，没有露趾鞋），并且门必须始终关闭。

1.非洲爪蟾卵母细胞显微注射制剂

1. 要制作注射针，请使用微量移液器拉动3.5英寸硼硅酸盐管。一旦拉动显微注射针，使用显微镜和剃须刀片切断足够的针尖，以便可以进行显微注射（通常在2-3毫米之间）。
   注意:要切割的针尖的长度可能会有所不同。
2. 通过将 200 mL 巴特储备溶液 （5x） 加入 800 mL 蒸馏水中，制备 1x Barth 溶液。用18°C 1x Barth溶液填充24孔平底组织培养板。
   1. 准备5x巴特的储备溶液，如下所示。在1升蒸馏水中，加入25.71克氯化钠（氯化钠），0.372克KCl（氯化钾），0.301克CaCl₂ （二氯化钙），0.389克Ca（NO₃）₂（4H₂O）（硝酸钙四水合物），1.01克MgSO₄（7H₂O）（七水硫酸镁），1.008克NaHCO₃ （碳酸氢钠）， 和11.91克HEPES（4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙烷磺酸）。
3. 使用^18，19中描述的方案分离非洲爪蟾卵母细胞，并使用2x放大的立体镜，选择看起来健康的V-VI期卵母细胞。每孔放置约10个卵母细胞，并使用其中一个孔容纳未注射的卵母细胞，以便在进行记录时用作对照细胞。
4. 取回一个小培养皿，高1厘米，直径6厘米，并将尼龙网放在里面，使其覆盖盘子的底部。然后，倒入15mL的1x Barth溶液，用于进行卵母细胞的显微注射。
5. 沿显微镜平台的中线放置纳米注射器。将磁体转到 关闭 位置，然后缓慢地将纳米注射器移动到所需位置，同时小心地支撑它。当纳米注射器正确定位时，将磁体转回完全 打开 位置，并确保其牢固。
6. 对于50.6 nL的样品尺寸，请在纳米注射器的侧面使用以下设置:1为D（向下），2为D，3为U（向上），4为D，5为U.在显微镜支架上放置一块自密封的热塑性塑料或微量离心管帽，将其与纳米注射器的轨迹对齐。
   注意:50 nL接近细胞质可以承受的最大注射材料量²¹。
7. 用矿物油（约0.5 mL / cc）填充胰岛素注射器约其体积的一半。使用此注射器，用矿物油填充显微注射针头。确保在针尖看到可见的油珠。
8. 将纳米注射器柱塞暴露在至少1-2厘米处。为此，请按住 EMPTY 按钮，直到柱塞以所需长度可见。柱塞暴露后，缓慢而小心地将矿物油填充的显微注射玻璃针放在纳米注射器柱塞上，并确保它很好地穿过黑色电阻O形圈并停在白色电阻环上。确保在此过程中不要弯曲纳米注射器柱塞。
9. 一旦显微注射玻璃针固定到位，按 空压 以消除任何潜在的气泡。用纸巾轻轻地擦去多余的矿物油。

2. 加载样品

1. 如^{10，11，12，13，14}，¹⁵中所述^，从人脑感兴趣区域制备突触体富集制剂（样品），并在-80°C下将其储存在约5μL的等分试样中直至注射时刻。
2. 注射前，将等分试样转移到湿冰上，并始终将其保持在冰上，除了超声处理和检索。样品的数量和类型将由实验设计决定。
3. 在带有漂浮湿冰的浴中将所选样品超声处理3倍，以避免样品变暖。每次使用5秒循环，在两次循环之间在湿冰上等待1分钟。
4. 将1μL样品置于热塑性塑料上。如果需要，在样品放置之前在表面进行压痕，以防止样品移动。
5. 使用握住纳米注射器的机械手的旋钮定位针，并将其移向要填充的样品。一旦针尖进入样品中，按住 FILL 按钮，直到取出足够的样品。10个卵母细胞需要约0.5μL。使用旋钮，将纳米注射器的针移回最高位置。

3. 注射卵母细胞

注意:标准化的大鼠皮质突触体膜也在所有实验中注射到一组卵母细胞中，以测量不同批次卵母细胞之间融合能力的变化。

1. 将选定的卵母细胞放在具有拟合尼龙网和Barth溶液（约10个卵母细胞）的小培养皿上。排列卵母细胞，使它们不相互叠加;这将在注射过程中有所帮助。
2. 使用握住纳米注射器的机械手上的旋钮，将针头向卵母细胞移动。一旦针浸没在Barth溶液中，使用纳米注射器的脚踏板确保显微注射针释放样品。如果样品正在释放，从显微镜视图中可以看到它。
3. 一旦确信样品正在释放，请继续显微注射卵母细胞。如果样品没有被释放，重复填充针头的过程。
4. 用针头穿透表面正下方的卵母细胞，不要更深，并用脚踏板注射样品。当样品释放时，脚踏板会发出蜂鸣声。等待约2-3秒。如果注射成功，细胞将膨胀。发生这种情况后，使用操纵器上的旋钮退出单元格。
   注意:卵母细胞膜的融合是一个极化过程;因此，卵母细胞应注射在动物侧的细胞中，优选在赤道上方，使针头的角度朝向动物侧，以最大化膜融合。
5. 移动培养皿，使下一个卵母细胞与针对齐，并重复该过程，直到培养皿中的所有卵母细胞都注射完毕。重复此过程，直到注射了所需数量的卵母细胞。确保一孔卵母细胞未注射以用作对照。
6. 注射所有卵母细胞后，将纳米注射器缩回其原始位置并取出针头。

4. 使用双电极电压钳记录离子电流

1. 要制作两个电极电压钳（TEVC）电极针，请使用微量移液器拉动15厘米长的火抛光硼硅酸盐玻璃管。一旦拉动完成，使用长毛细管针填充3 M KCl，或者将针浸入3 M KCl溶液中并在连续真空下煮沸15分钟。高温有助于电极的填充和气泡的去除。
   1. 通过使用结晶形式的KCl和去离子水制备3 M KCl电极填充溶液，并仔细遵循这些步骤以使电极的参比电位不变。在烤箱中小心地干燥KCl2-3小时。使用分析天平，小心称量223.68克KCl，将KCl转移到1升玻璃瓶中。使用该溶液对银电极丝进行氯化处理。
      注意:对于拉动玻璃电极，移液器食谱可以在这里下载:https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf。
2. 打开用于记录离子电流的所有设备:主系统，溶液阀，显微镜灯，阀门系统，卵母细胞夹和真空系统。打开台式计算机，登录到 WinEDR V3.9.1.，并确保程序正在运行并且设置值正确无误，如下所示:记录到磁盘，设置录制持续时间，并清除模拟器选项。
   1. 为放大器提供以下初始设置值:对于电压电极（Vm）部分，关闭负容量补偿（-C）;对于浴电极（Im）部分，将增益选择器开关（范围从0.1到10）设置为10，并将三位切换开关设置为x1.0，该开关选择增益乘法器（x0.1，x1.0和x10）。LED灯将指示增益倍增器的选择;对于箝位部分，关闭箝位模式选择器，将直流增益控制设置为 IN，增益控制全带宽开环（范围0至2000）设置为1200左右;对于命令，设置为40mV，并将保持控制负和比例乘法器设置为x2;对于电流电极，在刺穿卵母细胞之前，使用Ve偏移建立零参考。
   2. 要录制，请打开WinEDR V3.9.1软件，转到顶部菜单，然后选择 文件>打开新文件"。创建您自己的文件夹并保存文件。
   3. 接下来，在主菜单中选择" 录制>录制到磁盘"。当两个电极位于ooctyte内部时，打开VC-8阀门控制器中的振铃器，然后在OC-725C放大器中将钳位转为 慢速 。然后，返回到 WinEDR 软件并选择屏幕左上角的" 录制 "。
   4. 在左下角的标记表中，记下您的初始膜电位，然后按 Enter 键。随着实验的不断进行，您可以写下正在使用的药物的名称。实验结束后，选择屏幕左上角的 "停止 "。
      注意:我们使用WinEDR或WinWCP软件来执行TEVC，因为它们是免费的，非常适合实验，但可以使用任何其他可用的软件。
3. 组成执行实验所需的所有药物溶液（例如，GABA，Kainate），并通过打开和关闭溶液阀并观察夹管阀的位移来确认溶液阀正常工作。
4. 通过将相应的溶液倒入连接到管子的注射器容器上来填充管子，并标记阀门控制器以与溶液管相关联。确保溶液流动稳定，没有气泡，并且真空系统正常工作。
5. 设置显微镜和记录室区域。将琼脂桥（见下文）放在记录室后面的相应圆孔中（距离处理区域远端），连接用作接地参考的电极和记录室的孔。将Ringer的工作溶液（1x）添加到记录室和接地参比电极孔中。
   1. 琼脂桥是U形硼硅酸盐管，长2-3厘米，在Ringer的溶液中填充3%琼脂。通过切割15厘米长的管子，在明火上弯曲它们，然后使用胰岛素注射器用热的3%琼脂填充它们来制作U形管。将装满的琼脂桥存放在冰箱的Ringer溶液中，直到使用。
   2. 制作20x林格的储备溶液如下:在1升蒸馏水中，加入134.4克NaCl，2.982克KCl，5.29克CaCl₂和23.83克HEPES（4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙烷磺酸）。对于 1x Ringer 的工作溶液，在容量瓶中，将 200 mL 林格的储备溶液 （20x） 加入 3，800 mL 蒸馏水中。
6. 在每次实验之前，通过将银线放入3 M KCl溶液中并将银电极连接到9 V电池的正端，通过电解制备氯化银电极。约3分钟后，将AgCl的固体棕色层沉积到电极中。将氯化银电极丝放入电极外壳中。
   注:接地参比电极和记录氯化电极是银/氯化银 （Ag/AgCl） 电极。
7. 从KCl溶液中取出硼硅酸盐针。使用注射器从电极针的开口端提取少量KCl溶液，并用矿物油代替KCl溶液;这将避免针内水分蒸发和KCl浓度的变化。将玻璃针滑过氯化银电极丝并拧紧到位。
8. 使用左右手持电极的机械手，将电极针引导到装满Ringer's溶液的记录室中。
9. 通过将 Vm 和 Ve 偏移旋钮归零，然后按下 电极测试 按钮来检查每个电极的电阻。电阻应在0.5-3 MΩ之间（在屏幕中直接读取为5-30 mV）。如果电阻超出范围，请使用新的微电极进行更换。
10. 用新鲜的林格溶液填充录音室。使用玻璃移液器，将非注射或微移植的卵母细胞放在记录室的中心。确保卵母细胞在显微镜下清晰可见，动物面朝上（参见步骤3.4中的注）。
11. 将电极引导到振铃器溶液中，直到它们接触到卵母细胞膜。用两个电极轻轻刺穿动物侧的卵母细胞膜（参见步骤3.4中的注），并记录静息膜电位。打开铃声的求解流。
12. 使用卵母细胞钳位放大器，将模式更改为 电压钳位 ，并将保持电压设置为-80 mV。显示器上的电流应为负，通常在 0 到 0.4 微安之间。
13. 创建一个新文件以将录制文件另存为 文件>新建>在软件上保存录制文件 。开始录制，按 录制>录制到磁盘。使用标记框对话框（测试名称，使用的药物等）将相关信息添加到文件中。
14. 应用激动剂（例如，GABA、谷氨酸或海藻酸盐）进行化学刺激，方法是打开瓣膜并将其灌注到记录室中 15 秒。通常，使用增益 10x 绘制最大点数并重建响应。如果电流非常小，请增加放大或增益，以便对其进行评估和可见。请始终记下这些更改。
    注意:灌注的持续时间取决于实验范式。如果主要目标是测量最大振幅，15秒将足以达到GABA的峰值或kainate的平台。
15. 始终监视解决方案级别。Ringer的解决方案需要经常重新填充，因为它在所有解决方案用途之间使用。记录完成后，将电压钳位转到 OFF 位置，然后关闭振铃器的溶液阀。取出卵母细胞。停止录制并保存文件。对所有注射的卵母细胞重复这些步骤。

5. 分析 TEVC 录音

1. 将录制文件的副本保存到 USB 驱动器。从那里，打开要分析的所需文件。在打开的文件中，可以查看、标记和测量记录。最常见的分析包括测量最大振幅、激活时间、脱敏和重复应用的运行情况。
2. 测量 AMPA 最大响应和 GABA 峰值响应。要获取这些测量值，首先通过用光标找到红线并将其拖动到Ringer应用程序或基线生成的电流来建立零电平或基线。
3. 建立零电平后，通过使用鼠标将绿色的垂直读出光标拖动到图形示踪剂的所需部分来确定响应测量值。如果需要，请导出要在任何其他首选软件中分析的痕迹
   注意:如果无法定义零电平，或者示踪剂上指示的噪声过多，请将 WinEDR 文件导出到脱机分析软件，这将允许进行修改以提供电平基线并添加过滤器以降低噪声。

结果

在注射后几个小时内，携带其神经递质受体和离子通道的突触膜开始与卵母细胞质膜融合。图1显示了将AMPA和GABA_A受体微移植到非洲爪蟾卵母细胞中的记录。对于大多数分析，使用来自不同青蛙的两到三批卵母细胞来测量每个样品中两个或三个卵母细胞的反应，每个样品总共六到九个卵母细胞。这是为一大群人类受试者观察群体差异而完成的。分析很简单，可?...

讨论

需要分析来自人类大脑的天然蛋白质复合物，以了解脑部疾病的稳态和病理过程，并制定预防或治疗疾病的治疗策略。因此，含有快速冷冻样本的脑库是大量且大部分未开发的丰富生理信息^29，30的宝贵来源。使用死后组织的最初担忧是mRNA或蛋白质降解的明显可能性，这可能会混淆数据的解释。例如，大脑的pH值始终与通过定量实时荧光定量PCR定量mRNA呈...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
For Microinjection
3.5" Glass Capillaries	Drummond	3-000-203-G/X
24 well, flat bottom Tissue Culture Plate	Thermofisher	FB012929
Flaming/Brown type micropipette puller	Sutter	P-1000
Injection Dish	Thermofisher	08-772B
Microcentrifuge Tubes	Thermofisher	02-682-002
Mineral Oil	Thermofisher	O121-1
Nanoject II	Drummond	3-000-204
Nylon mesh	Industrial Netting	WN0800
Parafilm	Thermofisher	S37440
Stereoscope	Fisher Scientific	03-000-037
Syringe	Thermofisher	14-841-31
Ultrasonic cleaning bath	Thermofisher	FS20D
Xenopus laevis frogs	Xenopus 1	4217
For Two Electrode Voltage clamp
15 cm long fire polished borosilicate glass capillaries	Sutter	B200-116-15
Any PC computer or laptop
Low-pass Bessel Filter	Warner Instruments	LPF-8
Stereoscope	Fisher Scientific	03-000-037
Two electrode voltage clamp workstation	Warner Instruments	TEV-700
ValveLink 8.2 Perfusion Controller	Automate Scientific	SKU:01-18
WInEDR Free software	University of Strathclyde Glasgow	https://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm
X Series Multifunction DAQ	National Instruments	NI USB-6341
Reagents
Calcium dichloride	Thermofisher	C79
Calcium nitrate tetrahydrate	Thermofisher	C109
Collagenase	Sigma-Aldrich	C0130
GABA	Sigma-Aldrich	A2129
HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)	Thermofisher	BP310
Kainic acid	Tocris	0222
Magnesium sulfate heptahydrate	Thermofisher	M63
Potassium chloride	Thermofisher	P217
Sodium bicarbonate	Thermofisher	S233
Sodium chloride	Thermofisher	S271-1
Ultrafree-0.1 µm MC filter,	Amicon