利用血管袖带的小鼠异位宫颈心脏移植

摘要

小鼠心脏移植模型是研究移植免疫学的宝贵研究工具。本方案详细介绍了小鼠异位宫颈心脏移植，涉及在受体的颈总动脉和供体的肺动脉干上放置袖带以允许层流血流。

摘要

心脏移植的小鼠模型经常用于研究缺血再灌注损伤、移植后的先天性和适应性免疫应答，以及免疫调节疗法对移植排斥反应的影响。小鼠异位宫颈心脏移植于1991年首次使用缝合吻合术进行描述，随后进行了修改以包括袖带技术。这种修改可以提高成功率，从那时起，已经有多份报告提出了进一步的技术改进。然而，由于与移植物吻合术相关的技术困难，转化为更广泛的应用仍然有限，这需要精确地达到足够的袖带长度和口径，以避免血管吻合口扭曲或过度紧张，这可能导致移植物受损。本协议描述了一种用于在小鼠中进行异位宫颈心脏移植的改进技术，该技术涉及将袖带放置在受者的颈总动脉和供体的肺动脉上，与血流方向对齐。

引言

Abbott等^人于 1964年发表了1首关于大鼠异位腹心移植的描述。这些手术技术由小野等人在1969年改进和简化^2。Corry等于1973年首次描述了一种在小鼠中进行异位腹心移植的方法;与先前报道的大鼠模型类似，这涉及通过供体肺动脉的端对侧吻合和升主动脉分别将血运重建到受者的下腔静脉和腹主动脉，从而植入宿主的腹部^3。Heron于1971年使用由16G（外径1.6mm）静脉导管制成的特氟龙袖带描述了大鼠异位宫颈心脏移植^4。Chen⁵ 和Matsuura等^人6后来 在1991年报道了小鼠的异位宫颈心脏移植，其技术主要在再吻合方法上有所不同。Chen的方法包括将供体的升主动脉缝合到受体的颈动脉，将供体的肺动脉缝合到受体的颈外静脉⁵。由于这些显微外科缝合吻合术需要先进的技术技能，因此需要大量的时间和经验才能实现高成功率。Matsuura等人描述了一种利用非缝合袖带技术的方法，类似于Heron使用的方法，该方法涉及使用袖带的腔外放置进行端到端吻合。他用 22 G（外径 0.8 毫米）和 24 克（外径 0.67 毫米）静脉导管制作了特氟龙袖带，并分别将它们放置在接受者的颈外静脉和颈总动脉上⁶.然后将这些袖带放置在供体的肺动脉和主动脉内，并通过在连接处周围绑上缝合线来固定。这种方法转化为更高的成功率。最重要的是，它缩短了完成两个颈部吻合所需的时间，从而将移植物的温暖缺血时间减少到使用腹部缝合方法的三分之一以下。此外，由于袖带放置在血管外表面周围，因此没有异物暴露在血管腔内，这大大降低了手术后血栓形成的可能性⁷。同时，使用袖带技术在吻合部位的血管周围提供支撑，而无需任何缝合，从而降低了血运重建后出血的风险⁶。

已经提出了对这种技术的多次修订。为了适应小鼠颈总动脉的短长度（约5毫米），Tomita等^{人8开发了}这种技术的改进，使用较小的动脉袖带（外径0.6毫米），同时省略了保持缝合线并用细镊子直接将动脉拉过袖带。Wang等人进一步简化了这种方法，分别在供体的右肺动脉和受者的右颈总动脉上放置22 G和24 G袖带⁹。各种报告描述了对这些方法的修改，包括使用专用袖带、显微外科夹具、血管扩张器和心脏停搏¹⁰，^11，12。值得注意的是，所有这些方法都涉及血液通过心脏的逆行循环，血液从受体颈总动脉流向供体主动脉，冠状动脉，冠状窦，然后排空到右心房并从肺动脉退出进入受体颈外静脉。

与腹部植入相比，宫颈心脏移植具有多种优势。如前所述，宫颈暴露可以更快地进行血运重建和更短的温暖缺血时间⁶。宫颈法的侵入性也较小，并且由于避免了剖腹手术⁶，因此术后恢复时间较短。重要的是，可以进行带袖带的端到端吻合术，而不是端对侧吻合术，从而降低吻合口出血等并发症的风险。腹部入路也增加了在腹主动脉或下腔静脉发生血栓并发症的风险，导致脊髓缺血和后肢麻痹。移植的宫颈浅表位置便于通过触诊、心电图和有创或非侵入性成像进行移植物活力评估。虽然宫颈移植物在再灌注后恢复自发的心脏活动，但它们不会显着影响受者的收缩和舒张期参数。该模型为研究移植后的细胞反应提供了有价值的见解，例如缺血再灌注损伤和移植排斥反应。此外，该模型提供了一种理想的方法，允许移植后成像，例如活体双光子显微镜或正电子发射断层扫描（PET）成像。为此，我们的实验室之前已经报道了对小鼠中移动组织和器官进行成像的方法，包括异位宫颈移植后的跳动鼠心脏和主动脉弓移植物，以可视化缺血再灌注损伤期间和动脉粥样硬化斑块内的白细胞运输，分别¹³，^14，15.此外，由于其表面位置和易于暴露，该模型适用于心脏再移植¹⁶。

本报告描述了一种允许层流血流的技术，该技术通过将血管袖带外部放置在血流起源的血管上来实现。这允许血流从一血管平稳过渡到另一血管，避免远端血管边缘暴露在血管腔中。此外，该技术使用更大的20 G袖带，而不是以前使用的22 G袖带，用于供体肺动脉，以确保充足的血流返回受体。

研究方案

所有动物处理程序均按照NIH实验动物护理和使用指南进行，并得到华盛顿大学医学院动物研究委员会的批准。将来自C57BL / 6（B6）和BALB / c小鼠（重量20-25g）的心脏移植到性别匹配的B6受体（6-8周龄）中。小鼠是从商业来源获得的（见 材料表）。进行同源移植以评估与缺血再灌注损伤相关的细胞反应，并进行同种异体移植以研究与移植物耐受性和排斥反应有关的免疫机制。B6溶菌酶M-绿色荧光蛋白（LysM-GFP）报告小鼠¹⁷最初从加利福尼亚州拉霍亚过敏和免疫学研究所的Klaus Ley获得，随后在我们的设施中繁殖，被用作选定实验的接受者，以可视化中性粒细胞浸润到心脏移植物中。使用无菌程序进行生存手术。

1. 捐赠程序

1. 通过将氯胺酮（80-100mg / kg）和甲苯噻嗪（8-10mg / kg）（参见 材料表）腹膜内注射到供体小鼠中来麻醉小鼠。用脚趾和尾部捏住确认麻醉的手术平面。
2. 通过使用电动剃须刀从胸部和腹部剃除头发来准备手术区域。
3. 静脉注射100单位肝素（见 材料表）到静脉（男性）或颈外静脉（男性或女性）。
4. 将小鼠置于仰卧位，前肢在头顶。用手术胶带固定前肢和后肢，并用3种0.75%碘和70%乙醇交替擦洗皮肤。
5. 从脐部到胸骨角（3-4 cm）进行切口，正中剖腹胸切开术，然后沿每个肋缘（双侧 2 cm）进行双侧开胸术。将前胸壁折叠在颈部，以充分暴露纵隔。
6. 切除胸腺并露出胸内下腔静脉。
7. 横断横跨腹主动脉宽度以进行放血。
8. 对于逆行灌注，将1.5mL的4°C盐水注入胸内下腔静脉，针头朝向移植物，如前所述¹³。
9. 使用8-0连接上腔静脉丝缝合并远端分叉。
10. 通过下腔静脉注射另外1.5mL的4°C盐水来重复逆行灌注。
11. 使用8-0结扎下腔静脉丝缝合并远端分叉。
12. 解剖主动脉弓和肺动脉干以进行移植物采集，并在远端横断。使用6-0丝线结扎心脏后表面的肺静脉，并在远端分开。
13. 通过从胸腔中取出供体心脏来进行移植准备。将切除的心脏放入装有4°C肝素化盐水的塑料容器中1-2分钟。将移植物转移到装满冰块的无菌塑料烧瓶上以进行袖带放置（图1A）。
    注意:心脏移植物需要在烧瓶上停留约5分钟，以放置供体肺动脉袖带。
14. 将1mm长的20G血管导管（ 材料 表）袖带放在供体袖带的肺动脉上。使用细镊子，将动脉边缘轻轻折叠回袖带上。使用10-0尼龙领带将折叠的容器固定在袖口上，如前^所述18 （图1B，C）。
15. 将供体心脏储存在肝素化盐水或其他保存溶液中，温度为4°C。
    注意:虽然有些人可能更喜欢特定的保存解决方案（例如，威斯康星大学的解决方案）来延长缺血性保存，但它可能很昂贵¹⁹。生理盐水可能是短时间缺血（<1小时）²⁰的合适替代品。最终，保存溶液的选择取决于实验设计²¹。

2. 收件人程序

1. 腹腔内将氯胺酮（80-100mg / kg）和甲苯噻嗪（8-10mg / kg）注射到受体小鼠中进行麻醉。皮下注射缓释丁丙诺啡（0.5-1.0mg/kg）用于镇痛。用脚趾和尾部捏住确认麻醉的手术平面。
2. 通过使用电动剃须刀从颈部区域剃毛来准备手术区域。将无菌、非药物眼药膏涂抹在眼睛上，以防止角膜干燥。
3. 将动物置于仰卧位，前肢与身体相邻，头部略微向左转动。用手术胶带固定前肢和后肢。用 0.75% 碘和 70% 乙醇的三种交替磨砂膏对皮肤进行消毒。
4. 从下颌骨到胸骨做一个中线颈椎切口。
5. 横断右侧胸锁乳突肌。切除下颌下腺的右叶，为移植物植入创造空间。
6. 使用6-0丝线在近端颈外静脉上打一个滑结。使用 8-0 结扎远端颈外静脉和相邻分支丝绸缝合线。在颈外静脉前壁上做一个横向切口。
7. 在袖带插入期间，将10-0尼龙缝合线穿过近端颈外静脉和下层组织的边缘，以固定静脉（图1D）。
8. 使用 8-0 结扎右颈总动脉远端丝线仅不如颈动脉分叉。使用6-0丝线在颈总动脉近端打一个滑结。在缝合线之间远端横断动脉。
9. 与供体袖带类似，将 0.6 mm 长的 24 G 血管导管袖带放在受者的右颈总动脉上。使用细镊子，将动脉边缘轻轻折叠回袖带上。使用10-0尼龙领带将折叠的容器固定在袖口上。
10. 将供体心脏置于右颈椎区域上方。
11. 在植入过程中每隔几分钟将冷盐水滴到心脏移植物上。
12. 将10-0尼龙缝合线穿过供体主动脉的边缘，并通过下层组织的浅表咬合将移植物固定到位（图1E）。
13. 用 0.5 mL 的 0.9% 肝素化盐水冲洗供体主动脉。
14. 将受者的颈总动脉袖带插入供体主动脉。用 8-0 固定吻合口真丝领带（图1F）。移除主动脉锚缝线。
15. 用 0.5 mL 的 0.9% 肝素化盐水冲洗受者的颈外静脉，使颈外静脉脱气。
16. 通过将供体肺动脉袖带插入受者的颈外静脉并进行肺动脉吻合术，并用 8-0 固定真丝领带（图1G）。移除颈外静脉锚缝线并横断颈外静脉的剩余后壁，以将移植物从下层组织中释放出来。确保移植物方向正确，没有吻合口扭结或扭曲。
17. 释放受体颈外静脉上的滑结，然后释放颈总动脉以启动心脏移植再灌注（图1H）。
18. 使用中断的6-0尼龙缝合线关闭宫颈皮肤切口。

3. 术后护理

1. 手术后立即将受体置于温暖的恢复室中，并密切监测直到从麻醉中完全恢复（约1小时）。
2. 手术后继续密切监测动物（每6-8小时）至少72小时，以发现异常行为的迹象，如嗜睡，颤抖，呼吸急促或厌食。
3. 为了控制疼痛，每8-12小时皮下注射卡洛芬（5mg / kg）用于镇痛，此外，每8-12小时皮下注射丁丙诺啡（0.05mg / kg），从手术结束时开始24-48小时。

4. 心脏移植物中白细胞运输的活体双光子成像

1. 在移植物再灌注后¹⁷ 小时腹膜内将氯胺酮（80-100mg / kg）和甲苯噻嗪（8-10mg / kg）注射到B6 LysM-GFP受体小鼠中进行麻醉。
2. 如前所述，使用 20 G 血管导管进行口腔气管插管，如前所述¹⁸。
3. 将血管导管连接到小鼠机械呼吸机的管道上，并以 120 次呼吸/分钟的速度和 0.5 mL 的潮气量用室内空气通气¹⁸.
4. 如前所述，注入 12 μL 655 nm 非靶向量子点（参见 材料表），悬浮在 50 μL PBS 中，如前^{所述 13}。
5. 重新打开颈部切口以暴露心脏移植物。将鼠标放在稳定室中。
6. 使用薄薄的组织粘合剂（见 材料表）固定左心室游离壁的一部分，应用于连接到上腔室板的玻璃盖玻片上。
7. 将腔室置于双光子显微镜物镜下以获取图像和视频，如前^所述13。

结果

该小鼠宫颈异位心脏移植模型已用于我们实验室的1，000多例移植，存活率约为97%。成功率略高于先前在小鼠中使用其他宫颈异位心脏移植技术的报告10，^11，20。这可能归因于放置在供体肺动脉上的更大的20 G袖带，以确保血流充分返回受体（图1B，C）。此外，在目前技术中，血流与袖带放置?...

讨论

利用这种技术，经验丰富的显微外科医生可以在不到40分钟的时间内进行小鼠异位宫颈心脏移植，入门级显微外科医生可以在大约60分钟内进行小鼠异位宫颈心脏移植。虽然宫颈心脏移植已经在许多动物模型中进行了研究，但由于多种明确定义的遗传菌株、遗传改变能力以及包括单克隆抗体在内的多种试剂的可用性，小鼠模型仍然是黄金标准²⁴。这里描述的技术为移植后监测提供?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-0 braided silk ties	Henry Schein Inc	7718729
0.75% Providone iosine scrub	Priority Care Inc	NDC 57319-327-0
10-0 nylon suture	Surgical Specialties Corporation	AK-0106
655-nm nontargeted Q-dots	Invitrogen	Q21021MP
70% Ethanol	Pharmco Products Inc	111000140
8-0 braided silk ties	Henry Schein Inc	1005597
Adson forceps	Fine Science Tools Inc	91127-12
BALB/c and C57BL/6 mice (6-8 weeks)	Jackson Laboratories
Bipolar coagulator	Valleylab Inc	SurgII-20, E6008/E6008B
Carprofen (Rimadyl) injection	Transpharm	35844
Carprofen (Rimadyl) oral chewable tablet	Transpharm	38995/37919
Custom-built 2P microscope running ImageWarp acquisition software	A&B Software
Dumont no. 5 forceps	Fine Science Tools Inc	11251-20
Fine vannas style spring scissors	Fine Science Tools Inc	15000-03
GraphPad Prism 5.0	Sun Microsystems Inc.
Halsey needle holder	Fine Science Tools Inc	91201-13
Halsted-Mosquito clamp curved tip	Fine Science Tools Inc	91309-12
Harvard Apparatus mouse ventilator model 687	Harvard Apparatus	MA1 55-0001
Heparin solution (100 U/mL)	Abraxis Pharmaceutical Products	504031
Imaris	Bitplane
Ketamine (50 mg/kg)	Wyeth	206205-01
Microscope—Leica Wild M651 × 6–40 magnification	Leica Microsystems
Moria extra fine spring scissors	Fine Science Tools Inc	15396-00
Ohio isoflurane vaporizer	Parkland Scientific	V3000i
Qdots	ThermoFisher	1604036
S&T SuperGrip Forceps angled tip	Fine Science Tools Inc	00649-11
S&T SuperGrip Forceps straight tip	Fine Science Tools Inc	00632-11
Sterile normal saline (0.9% (wt/vol) sodium chloride	Hospira Inc	NDC 0409-4888-20
Sterile Q-tips (tapered mini cotton tipped 3-inch applicators)	Puritan Medical Company LLC	823-WC
Surflow 20 gauge 1/4-inch Teflon angiocatheter	Terumo Medical Corporation	SR-OX2032CA
Surflow 24 gauge 3/4-inch Teflon angiocatheter	Terumo Medical Corporation	R-OX2419CA
ThermoCare Small Animal ICU System (recovery settings 3 L/min O2, 80 °C, 40% humidity)	Thermocare Inc
VetBond	Santa Cruz Biotechnology SC361931	NC0846393
Xylazine (10 mg/kg)	Lloyd Laboratories	139-236