鼻自组装纳米乳肿瘤疫苗体外和体内的制备、特性、毒性及疗效评价

摘要

在这里，我们提出了鼻自组装纳米乳肿瘤疫苗体 外 和体内制备和评价的详细方法 。

摘要

表位肽因其安全性、高特异性、生产方便等特点在肿瘤疫苗领域受到广泛关注;特别是，一些MHC I限制性表位可以诱导有效的细胞毒性T淋巴细胞活性以清除肿瘤细胞。此外，鼻腔给药是一种有效且安全的肿瘤疫苗递送技术，因为它具有便利性和提高患者依从性。然而，表位肽因其免疫原性差且缺乏递送效率而不适合鼻腔递送。纳米乳液（NEs）是热力学稳定的系统，可以加载抗原并直接递送到鼻粘膜表面。Ile-Lys-Val-Ala-Val（IKVAV）是层粘连蛋白的核心五肽，层粘连蛋白是一种由人呼吸道上皮细胞表达的整合素结合肽。本研究采用低能量乳化法制备了含有合成肽IKVAV-OVA_{257-264（I-OVA} ）的鼻内自组装表位肽NE肿瘤疫苗。IKVAV和OVA_257-264 的组合可以增强鼻粘膜上皮细胞的抗原摄取。在这里，我们建立了一个协议，通过透射电子显微镜（TEM），原子力显微镜（AFM）和动态光散射（DLS）研究物理化学特性;粘蛋白存在下的稳定性;通过检查BEAS-2B细胞的细胞活力以及C57BL / 6小鼠的鼻和肺组织的毒性;通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）摄取细胞;通过 体内小动物成像释放曲线;以及通过使用E.G7荷瘤模型的疫苗的保护和治疗效果。我们预计该协议将为新型T细胞表位肽粘膜疫苗的未来开发提供技术和理论线索。

引言

作为最重要的公共卫生创新之一，疫苗在抗击全球人类疾病负担方面发挥着关键作用¹。例如，目前正在测试120多种COVID-19疾病的候选疫苗，其中一些已在许多国家获得批准²。最近的报告指出，癌症疫苗有效地改善了临床癌症治疗的进展，因为它们指导癌症患者的免疫系统识别出身体外来的抗原³。此外，位于肿瘤细胞内部或外部的多个T细胞表位可用于设计肽疫苗，由于缺乏与放疗和化疗相关的显着毒性，其在治疗转移性癌症方面显示出优势4^，5。自1990年代中期以来，主要使用抗原肽疫苗进行肿瘤治疗的临床前和临床试验，但很少有疫苗对癌症患者表现出足够的治疗效果⁶。此外，具有肽表位的癌症疫苗免疫原性差，递送效率不足，这可能是由于从给药部位迅速扩散的细胞外肽快速降解，导致免疫细胞抗原摄取不足⁷。因此，有必要用疫苗输送技术克服这些障碍。

OVA 257-264是MHC I类结合_257-264表位，表达为融合蛋白，是一种常用的模型表位⁸。此外，OVA_257-264 对针对肿....

研究方案

动物实验按照《实验动物—动物福利伦理评审导则》（GB/T 35892-2018）进行，并经第三军医大学实验动物福利与伦理委员会批准。通过腹膜内注射100mg / kg的1%戊巴比妥钠对小鼠实施安乐死。

1. I-OVA NE的准备

1. 将1mg单磷酸脂质A（MPLA）与100μLDMSO混合，涡旋5分钟，并在室温（RT）下静置4小时以完全溶解。
2. 定量加入吐温80和I-OVA并混合。
   注：吐温80和I-OVA以25∶1¹⁹的质量比混合。
3. 将角鲨烯加入步骤1.2（7：3，混合：角鲨烯）中制备的混合物中。
4. 向步骤 1.3 中制备的混合物中加入 100 μL MPLA 溶液 （10 mg/mL）。
5. 使用低能量乳化方法制备纳米乳化疫苗¹⁹：将混合溶液以约总体积的70%加入水滴中，轻轻搅拌以获得透明且易于流动的混合物。
   注意：BNE对照（空白乳液）用相同的方法制备，用I-OVA代替水。

2. 理化表征和稳定性

注意：按照步骤2.1-2.3评估I-OVA NE疫苗的液滴大小分布，zeta电位和其他理化数据....

结果

根据该方案，我们完成了鼻肿瘤纳米疫苗递送的制备和体外和体内实验评估。TEM、AFM 和 DLS 是评估纳米疫苗表面 zeta 电位和粒径的基本特性的有效手段（图 1）。BEAS-2B上皮细胞是鼻腔疫苗体外毒性测试的有用筛选模型（图2A）。用H&E染色的显微照片表明I-OVA NE没有明显的粘膜毒性，包括组织损伤，出血或炎症细胞浸润（

讨论

用免疫细胞膜功能化的纳米疫苗在疾病靶向治疗中具有很大的优势，并且通过独特的肿瘤嗜性、特异性靶点的识别、延长的循环、增强的细胞间相互作用和低全身毒性等特性将副作用降至最低。它们还可以轻松地与其他治疗模块集成，以合作治疗癌症^16，20。通过控制物理和化学性质（如测量、形状和电荷）可以获得所需的属性。因此，纳米疫苗在广泛?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plates	Corning Incorporated, USA	CLS3922
Bio-Rad 6.0 microplate reader	Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA	Bio-Rad 6.0
CCK-8 kits	Dojindo, Japan	CK04
Centrifuge 5810 R	Eppendorf, Germany	5811000398
DAPI	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	D9542
fetal bovine serum (FBS)	Hyclone (Life Technology, USA)	SH30088.03
FITC-labeled I-OVA	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	NA
HF 90/240 Incubator	Heal Force, Switzerland	NA
HPLC	Shanghai Botai Biotechology Co., Ltd.	E2695
Inverted Microscope	Nikon,Japan	DSZ5000X
IPC-208	Chong Qing University, China	NA
IVIS system	Caliper Life Science Limited Company	NA
JEM-1230 TEM	JEOL Limited Company of Japan	1230 TEM
Malvern NANO ZS	Malvern Instruments Ltd., UK	NA
MPLA	Invivogen Lit. Co.	tlrl-mpla
Neomycin Sulfate Ointment	Shanghai CP General Pharmaceutical Co. , Ltd.	H31022262
OVA257–264	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	NA
RPMI 1640 medium	Hyclone (Life Technology, USA)	SH30809.01
Synthetic peptide (I-OVA) conjugation of IKVAV-PA	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	NA
Zeiss LSM800 laser scanning confocal fluorescence microscope	Zeiss, Germany	Zeiss LSM800