鼻自组装纳米乳肿瘤疫苗体外和体内的制备、特性、毒性及疗效评价

摘要

在这里，我们提出了鼻自组装纳米乳肿瘤疫苗体 外 和体内制备和评价的详细方法 。

摘要

表位肽因其安全性、高特异性、生产方便等特点在肿瘤疫苗领域受到广泛关注;特别是，一些MHC I限制性表位可以诱导有效的细胞毒性T淋巴细胞活性以清除肿瘤细胞。此外，鼻腔给药是一种有效且安全的肿瘤疫苗递送技术，因为它具有便利性和提高患者依从性。然而，表位肽因其免疫原性差且缺乏递送效率而不适合鼻腔递送。纳米乳液（NEs）是热力学稳定的系统，可以加载抗原并直接递送到鼻粘膜表面。Ile-Lys-Val-Ala-Val（IKVAV）是层粘连蛋白的核心五肽，层粘连蛋白是一种由人呼吸道上皮细胞表达的整合素结合肽。本研究采用低能量乳化法制备了含有合成肽IKVAV-OVA_{257-264（I-OVA} ）的鼻内自组装表位肽NE肿瘤疫苗。IKVAV和OVA_257-264 的组合可以增强鼻粘膜上皮细胞的抗原摄取。在这里，我们建立了一个协议，通过透射电子显微镜（TEM），原子力显微镜（AFM）和动态光散射（DLS）研究物理化学特性;粘蛋白存在下的稳定性;通过检查BEAS-2B细胞的细胞活力以及C57BL / 6小鼠的鼻和肺组织的毒性;通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）摄取细胞;通过 体内小动物成像释放曲线;以及通过使用E.G7荷瘤模型的疫苗的保护和治疗效果。我们预计该协议将为新型T细胞表位肽粘膜疫苗的未来开发提供技术和理论线索。

引言

作为最重要的公共卫生创新之一，疫苗在抗击全球人类疾病负担方面发挥着关键作用¹。例如，目前正在测试120多种COVID-19疾病的候选疫苗，其中一些已在许多国家获得批准²。最近的报告指出，癌症疫苗有效地改善了临床癌症治疗的进展，因为它们指导癌症患者的免疫系统识别出身体外来的抗原³。此外，位于肿瘤细胞内部或外部的多个T细胞表位可用于设计肽疫苗，由于缺乏与放疗和化疗相关的显着毒性，其在治疗转移性癌症方面显示出优势4^，5。自1990年代中期以来，主要使用抗原肽疫苗进行肿瘤治疗的临床前和临床试验，但很少有疫苗对癌症患者表现出足够的治疗效果⁶。此外，具有肽表位的癌症疫苗免疫原性差，递送效率不足，这可能是由于从给药部位迅速扩散的细胞外肽快速降解，导致免疫细胞抗原摄取不足⁷。因此，有必要用疫苗输送技术克服这些障碍。

OVA 257-264是MHC I类结合_257-264表位，表达为融合蛋白，是一种常用的模型表位⁸。此外，OVA_257-264 对针对肿瘤的适应性免疫应答至关重要，这取决于细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应。它由肿瘤中的抗原特异性CD8 + T细胞介导，这些CD8 ⁺ T细胞由OVA_257-264 肽诱导。其特征是颗粒酶B不足，由细胞毒性T细胞释放，导致靶细胞凋亡⁸。然而，游离的OVA_257-264 肽给药可能诱导很少的CTL活性，因为这些抗原的摄取发生在非特异性细胞而不是抗原呈递细胞（APC）中。缺乏适当的免疫刺激导致CTL活性⁵。因此，有效的CTL活性的诱导需要相当大的进步。

由于上皮细胞提供的屏障和粘液的持续分泌，疫苗抗原迅速从鼻粘液中去除9^，10。开发一种可以穿过粘膜组织的高效疫苗载体至关重要，因为抗原呈递细胞位于粘膜上皮9^下方。鼻内注射疫苗理论上诱导粘膜免疫以对抗粘膜感染¹¹。此外，鼻腔给药是一种有效且安全的疫苗给药方法，因为它方便，避免肠道给药，并改善了患者的依从^性7。因此，鼻腔给药是新型肽表位纳米疫苗的良好给药手段。

已经设计了几种合成生物材料来结合细胞 - 组织和细胞 - 细胞相互作用的表位。某些生物活性蛋白质，如Ile-Lys-Val-Ala-Val（IKVAV），已被引入作为水凝胶结构的一部分，以赋予生物活性¹²。这种肽可能有助于细胞附着、迁移和生长¹³ ，并结合整合素α_3β1 和_{α 6β1} 与不同的癌细胞类型相互作用。IKVAV是一种细胞粘附肽，来源于层粘连蛋白基底膜蛋白_{α 1} 链，最初用于模拟神经微环境并引起神经元分化¹⁴。因此，为这种新型疫苗找到有效的输送载体对于疾病控制非常重要。

最近报道的乳液系统，如W805EC和MF59，也已用于灭活流感疫苗或重组乙型肝炎表面抗原的鼻腔递送，并说明可触发粘膜和全身免疫¹⁵。与颗粒粘膜递送系统相比，纳米乳液（NEs）具有易于给药和与有效佐剂共形成方便的优点¹⁶。据报道，纳米乳剂疫苗以不同于传统脱敏的持续方式改变过敏表型，从而导致长期抑制作用¹⁷。其他人报告说，纳米乳剂与Mtb特异性免疫显性抗原相结合可以诱导有效的粘膜细胞反应并赋予显着的保护¹⁸。因此，设计了一种以合成肽IKVAV-OVA 257-264（I-OVA，由与OVA_257-264结合的IKVAV组成的肽）的新型鼻内自组装纳米疫苗。系统地评估这种新型纳米疫苗非常重要。

该方案的目的是系统地评估纳米疫苗的理化特性、毒性和稳定性，检测抗原摄取以及是否利用技术手段增强保护和治疗效果，并阐述主要实验内容。在这项研究中，我们建立了一系列方案来研究其理化特性和稳定性，确定CCK-8对BEAS-2B细胞的I-OVA NE的毒性大小，并使用共聚焦显微镜观察BEAS-2B细胞对疫苗的抗原呈递能力，评估这种新型纳米疫苗在体内和体外的释放曲线。，并使用E.G7-OVA荷瘤小鼠模型检测该疫苗的保护和治疗效果。

研究方案

动物实验按照《实验动物—动物福利伦理评审导则》（GB/T 35892-2018）进行，并经第三军医大学实验动物福利与伦理委员会批准。通过腹膜内注射100mg / kg的1%戊巴比妥钠对小鼠实施安乐死。

1. I-OVA NE的准备

1. 将1mg单磷酸脂质A（MPLA）与100μLDMSO混合，涡旋5分钟，并在室温（RT）下静置4小时以完全溶解。
2. 定量加入吐温80和I-OVA并混合。
   注:吐温80和I-OVA以25∶1¹⁹的质量比混合。
3. 将角鲨烯加入步骤1.2（7:3，混合:角鲨烯）中制备的混合物中。
4. 向步骤 1.3 中制备的混合物中加入 100 μL MPLA 溶液 （10 mg/mL）。
5. 使用低能量乳化方法制备纳米乳化疫苗¹⁹:将混合溶液以约总体积的70%加入水滴中，轻轻搅拌以获得透明且易于流动的混合物。
   注意:BNE对照（空白乳液）用相同的方法制备，用I-OVA代替水。

2. 理化表征和稳定性

注意:按照步骤2.1-2.3评估I-OVA NE疫苗的液滴大小分布，zeta电位和其他理化数据;按照步骤2.4-2.7对I-OVA NE疫苗进行形态学表征;并按照步骤2.8-2.9检查I-OVA NE疫苗的3D结构。

1. 将50毫克粘蛋白与100毫升注射用水混合，制备0.05%粘蛋白溶液。
2. 用 0.05 mg/mL 粘蛋白或去离子水稀释 4 mg/mL I-OVA NE 200 倍。
3. 使用纳米分析仪¹⁹观察25°C下的粒径，zeta电位，多分散指数（PDI）和电泳迁移率。
4. 用 2 mL 去离子水稀释 10 μL I-OVA NE 200 倍。
5. 将 5 μL 预稀释的 I-ova NE 疫苗（步骤 2.4）放在碳涂层铜网格上，并用 10 μL 1% 磷钨酸覆盖 3 分钟。
6. 用滤纸去除多余的磷钨酸。
7. 使用透射电镜获取图像。将稀释 50 倍的 10 μL 样品置于 100 目碳铜网格上，使其在室温 （RT） 下静置 5 分钟，然后加入 10 μL 磷钨酸 （1%，pH 7.4）。通过TEM在120 kV的电压下检查所有样品。
8. 使用高分辨率原子力显微镜表征I-OVA NE的分子形态。在以下条件下获得I-OVA NE的彩色图像:用于钨探针（力常数:0.06 N·^m-1）;扫描范围:450 nm x 450 nm;点击模式:成像模式;扫描方法:室温逐点扫描。

3. 体外 和 体内 毒性测定

注意:按照步骤3.1-3.9评估I-OVA NE疫苗的 体外 毒性，按照步骤3.10-3.13评估I-OVA NE疫苗的 体内 毒性。

1. 按照步骤3.1.1-3.1.4恢复人BEAS-2B上皮细胞，并在37°C的完整生长培养基中在5%CO₂ 培养箱中培养它们。
   注意:要制备完整的生长培养基，将胎牛血清（FBS）和青霉素/链霉素分别以10%和1%的终浓度添加到RPMI-1640培养基中。
   1. 打开水浴并将温度调节到37°C。 取出在液氮中冷冻的细胞小瓶，并在37°C水浴中快速解冻。
   2. 解冻后，快速将细胞移液到15 mL无菌离心管中，加入2 mL完全生长培养基，并以129 x g 离心5分钟。
   3. 除去上清液，加入2mL完全生长培养基以重悬细胞，并以129×g离心5分钟。
   4. 除去上清液，加入6mL完全生长培养基以重悬细胞，并将细胞转移到T25培养瓶中，以37°C在5%CO₂ 培养箱中培养细胞。
2. 当细胞密度达到80%-90%时，弃去培养基并用2mL PBS洗涤细胞两次。加入 1 mL 的 0.25% 胰蛋白酶以消化细胞 1-2 分钟。当观察到细胞四舍五入时，立即加入4mL的完整生长培养基以中和胰蛋白酶。
3. 将样品混合并吸出到15 mL无菌离心管中，并以129 x g 离心5分钟。
4. 除去上清液并将细胞重悬于1mL的RPMI-1640完全培养基中。使用 20 μL 进行细胞计数，并将细胞稀释至 1 x 10⁵ 个细胞/mL。
5. 将BEAS-2B细胞以1 x 10^4个细胞 /孔的密度接种在100μL RPMI-1640完全培养基中的96孔板中，并将板在37°C下在5%CO₂ 培养箱中预孵育24小时。
6. 弃去上清液，加入 100 μL I-OVA NE、100 μL I-OVA+BNE（物理混合）和 100 μL I-OVA 用各种终浓度（0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL、8 mg/mL）预稀释的 I-OVA 作为对照。在37°C孵育24小时。
   注意:向阴性对照组添加 100 μL 完全生长培养基，向阳性对照组添加 100 μL 细胞悬液 （1 x 10⁵/mL）。
7. 取出培养基，向板的每个孔中加入 90 μL 完全生长培养基和 10 μL CCK-8 溶液。
8. 将板在37°C下在5%CO 2培养箱中孵育₂ 小时。
9. 使用酶标记的酶标仪在450nm处测量每个孔的吸光度。
10. 计算BEAS-2B细胞的存活率，如以下公式所示:
    （OD450 _样品− OD450 _阴性对照/OD450 _阳性对照− OD450 _阴性对照） × 100%
11. 将6周龄的C57BL / 6小鼠随机分为五组（每组n = 5），并用4%异氟醚麻醉它们以进行诱导。用2%异氟醚维持麻醉。在小鼠眼睛上使用硫酸新霉素软膏以防止干燥。
12. 使用 10 μL 移液器吸头用 10 μL/鼻孔的 I-OVA、I-OVA + BNE 和 IOVA NE 以 4 MG/ML 的速度对小鼠进行鼻腔免疫，持续 3 天。使用BNE和PBS作为实验对照。
    注意:提供热支持，直到动物从麻醉中恢复。
13. 在第4天通过腹膜内注射100mg / kg 1%戊巴比妥钠对所有小鼠实施安乐死。
14. 用剪刀切割约3毫米厚的鼻组织样本，并去除肺组织。
15. 将鼻组织和整个肺组织固定在4%多聚甲醛中24小时。通过连续醇和二甲苯梯度使组织脱水，然后包埋在石蜡中。在石蜡切片机上以4μm的厚度将完成的蜡块切片。
16. 用苏木精和伊红（H&E）染色切片。然后，在显微镜（100x和200x^）下观察粘膜毒性，包括充血，水肿，中性粒细胞浸润以及鼻粘膜和肺组织中的结构损伤7。

4. 体外 细胞摄取

1. 将密度为5 x 10⁵ 个细胞/孔的BEAS-2B细胞接种在12孔板中，盖玻片在2mL的完整生长培养基中，并将板在37°C下在5%CO₂ 培养箱中预孵育过夜。
2. 将 100 μL FITC标记的I-OVA NE（纯度:98.3%，由公司生产，4 mg/mL）或I-OVA（4 mg/mL）加入900μL细胞悬液中，并在37°C下放置90分钟。
   注意:按照步骤 4.1 中所述制备 FITC 标记的 I-OVA NE。向对照组加入 1 mL 完全生长培养基。
3. 处理后用0.1M PBS（1mL /孔）在37°C洗涤30分钟。
4. 用4%多聚甲醛在黑暗中固定这些样品20分钟。固定后，除去多聚甲醛并在37°C下用0.1M PBS（1mL /孔）洗涤30分钟。
5. 用DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚）在黑暗中以10μg/ mL的终浓度预孵育样品10分钟，然后在处理后用0.1M PBS（1mL /孔）在37°C下洗涤5次30分钟。
6. 使用以下参数设置通过 CLSM 获取蜂窝摄取:帧尺寸:512 像素 x 512 像素，扫描速度:8;行步长:1;平均: 2.

5. 体内 释放

1. 用4%异氟烷气体麻醉裸鼠，并将麻醉维持在2%异氟烷。在每个鼻孔中以 4 mg/mL 的 10 μL PE 标记的 I-OVA 或 4 mg/mL 的 PE 标记的 I-OVA NE 鼻内免疫裸鼠。
2. 在0小时，0.5小时，1.5小时，3，6小时，9小时，12小时和24小时，通过IVIS系统捕获麻醉下的所有小鼠。
3. 在鼻内给药前立即进行背景扫描以提供阈值（最小= 1.06 x 10⁶）以调整在所有时间点收集的图像。
4. 点击 活体影像 软件启动序列，点击 初始化 初始化IVIS系统
5. 初始化时，IVIS采集控制面板中的温度状态指示灯为红色。当温度状态指示灯变为绿色时，可以进行成像。
6. 单击" 成像向导 "，然后在出现的对话框中选择 "荧光 "。
7. 调整以下参数: 曝光时间:自动秒， 像素合并:8， 光圈:2， 视野:D。
8. 选择 620 nm 激发滤光片和 670 nm 发射滤光片。单击" 获取序列 "以获取图像。
9. 使用活体图像软件处理所有小鼠的实时图像和辐射数据。
   1. 获取图片后，单击"工具选项板"中的"ROI 工具"，选择"圆"，然后制作一个 ROI 圆圈。
   2. 单击 "测量投资回报率 "以获取投资回报率区域的定量值。

6. 体内 抗肿瘤功效

1. 按照步骤2.1.1-2.1.4，用完整的生长培养基更新和培养来自EL4的小鼠淋巴瘤E.G7-OVA细胞。
   注意:要制备E.G7-OVA细胞完全生长培养基，请将RPMI 1640培养基与2 mM L-谷氨酰胺混合，调整为含有1.5 g / L碳酸氢钠，4.5 g / L葡萄糖，10 mM HEPES和1.0 mM丙酮酸钠，并补充0.05 mM 2-巯基乙醇和0.4mg / mL G418，90%和胎牛血清，10%。
2. 当细胞密度达到 1 x 10⁶ 个细胞/mL 和 1 x 10⁷ 个细胞/mL 之间的密度时，以 1:2 的比例传代细胞。
3. 如步骤6.3.1-6.3.4.所述，评估对小鼠的预防保护作用。
   1. 将6周龄的C57BL / 6小鼠随机分为五组（每组n = 8）。用4%异氟烷气体麻醉裸鼠，并用2%异氟醚维持麻醉。部分剃掉小鼠眼睛上的后毛和硫酸新霉素软膏以防止干燥。
   2. 鼻内用10μL的1mg / mL I-OVA，BNE + I-OVA或I-OVA NE在每个鼻孔中，BNE（用PBS稀释四次）或PBS对照3次，每次免疫间隔7天。
   3. 在最后一次免疫后第7天用5 x 10⁵ E. G7-OVA细胞将所有小鼠皮下接种到右背部。
   4. 在最终免疫后0、6、9、12、15和18天，通过使用数字卡尺测量肿瘤的两个轴来监测肿瘤体积，并记录小鼠的30天（最终免疫后）存活。
4. 如步骤6.4.1-6.4.3所述，评估接种E.G7-OVA细胞后对小鼠的治疗保护作用。关于小鼠的分组和处理，请参阅步骤6.3.1。
   1. 在第0天，用E.G7-OVA细胞（5 x 10⁵ 细胞/小鼠）将C57BL / 6小鼠皮下注射到右背部。
   2. 在注射后 0、7 和 14 天，用 10 μL I-OVA、BNE+I-ova、I-OVA NE（浓度均为 1 mg/mL）、BNE 或 PBS 在每个鼻孔中接种 10 μL I-OVA、BNE 或 PBS 的所有鼻内免疫小鼠三次。
   3. 在注射后0，6，9，12，15和18天，监测肿瘤体积并记录小鼠的30天生存期。
      注意:如果肿瘤体积超过3，000mm³，则应出于人道原因对小鼠实施安乐死，并且这些小鼠在存活曲线中将被视为死亡。肿瘤体积通过修改的椭球体公式计算，如以下等式所示:
      体积 = π/6 x 长 x 宽²
      其中L代表肿瘤长度，W代表肿瘤宽度（长度单位:mm，体积单位:mm³）。

7. 统计分析

1. 使用适当的统计软件分析不同组之间的数据差异，包括单因子方差分析、Tukey 多重比较或学生 t 检验。使用 Kaplan-Meier 方法估计生存结果，并将各组与对数排名统计量进行比较。将所有结果表示为平均值±SD。P 值 P < 0.05、P < 0.01 和 P < 0.001 的显著性分别在图上用 *、** 和 *** 表示。

结果

根据该方案，我们完成了鼻肿瘤纳米疫苗递送的制备和体外和体内实验评估。TEM、AFM 和 DLS 是评估纳米疫苗表面 zeta 电位和粒径的基本特性的有效手段（图 1）。BEAS-2B上皮细胞是鼻腔疫苗体外毒性测试的有用筛选模型（图2A）。用H&E染色的显微照片表明I-OVA NE没有明显的粘膜毒性，包括组织损伤，出血或炎症细胞浸润（

讨论

用免疫细胞膜功能化的纳米疫苗在疾病靶向治疗中具有很大的优势，并且通过独特的肿瘤嗜性、特异性靶点的识别、延长的循环、增强的细胞间相互作用和低全身毒性等特性将副作用降至最低。它们还可以轻松地与其他治疗模块集成，以合作治疗癌症^16，20。通过控制物理和化学性质（如测量、形状和电荷）可以获得所需的属性。因此，纳米疫苗在广泛?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plates	Corning Incorporated, USA	CLS3922
Bio-Rad 6.0 microplate reader	Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA	Bio-Rad 6.0
CCK-8 kits	Dojindo, Japan	CK04
Centrifuge 5810 R	Eppendorf, Germany	5811000398
DAPI	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	D9542
fetal bovine serum (FBS)	Hyclone (Life Technology, USA)	SH30088.03
FITC-labeled I-OVA	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	NA
HF 90/240 Incubator	Heal Force, Switzerland	NA
HPLC	Shanghai Botai Biotechology Co., Ltd.	E2695
Inverted Microscope	Nikon,Japan	DSZ5000X
IPC-208	Chong Qing University, China	NA
IVIS system	Caliper Life Science Limited Company	NA
JEM-1230 TEM	JEOL Limited Company of Japan	1230 TEM
Malvern NANO ZS	Malvern Instruments Ltd., UK	NA
MPLA	Invivogen Lit. Co.	tlrl-mpla
Neomycin Sulfate Ointment	Shanghai CP General Pharmaceutical Co. , Ltd.	H31022262
OVA257–264	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	NA
RPMI 1640 medium	Hyclone (Life Technology, USA)	SH30809.01
Synthetic peptide (I-OVA) conjugation of IKVAV-PA	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	NA
Zeiss LSM800 laser scanning confocal fluorescence microscope	Zeiss, Germany	Zeiss LSM800