Preparação, características, toxicidade e avaliação da eficácia da vacina contra tumores em nanoemulsão automontada nasal in vitro e in vivo

Resumo

Aqui, apresentamos métodos detalhados para a preparação e avaliação da vacina tumoral em nanoemulsão auto-montada nasal in vitro e in vivo.

Resumo

Peptídeos de epítopos têm atraído ampla atenção no campo das vacinas tumorais por causa de sua segurança, alta especificidade e produção conveniente; em particular, alguns epítopos restritos ao MHC I podem induzir atividade citotóxica efetiva de linfócitos T para limpar células tumorais. Além disso, a administração nasal é uma técnica de administração eficaz e segura para vacinas tumorais devido à sua conveniência e melhor adesão do paciente. No entanto, peptídeos de epítopos são inadequados para entrega nasal devido à sua baixa imunogenicidade e falta de eficiência de entrega. Nanoemulsões (NEs) são sistemas termodinamicamente estáveis que podem ser carregados com antígenos e entregues diretamente à superfície da mucosa nasal. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) é o pentapeptídeo central da laminina, um peptídeo ligador de integrina expresso por células epiteliais respiratórias humanas. Neste estudo, uma vacina intranasal auto-montada do peptídeo epítopo NE tumoral contendo o peptídeo sintético IKVAV-OVA_{257-264 (I-OVA} ) foi preparada por um método de emulsificação de baixa energia. A combinação de IKVAV e OVA_257-264 pode aumentar a captação de antígenos pelas células epiteliais da mucosa nasal. Aqui, estabelecemos um protocolo para estudar as características físico-químicas por microscopia eletrônica de transmissão (MET), microscopia de força atômica (AFM) e espalhamento dinâmico de luz (DLS); estabilidade na presença de proteína mucina; toxicidade pelo exame da viabilidade celular das células BEAS-2B e dos tecidos nasal e pulmonar de camundongos C57BL/6; captação celular por microscopia confocal de varredura a laser (MMC); perfis de liberação por imagem de pequenos animais in vivo; e o efeito protetor e terapêutico da vacina usando um modelo portador de tumor E.G7. Antecipamos que o protocolo fornecerá pistas técnicas e teóricas para o desenvolvimento futuro de novas vacinas de mucosa de peptídeos epítopos de células T.

Introdução

Como uma das inovações de saúde pública mais críticas, as vacinas desempenham um papel fundamental no combate à carga global de doenças humanas¹. Por exemplo, atualmente, mais de 120 vacinas candidatas para doenças COVID-19 estão sendo testadas, algumas das quais foram aprovadas em muitos países². Relatos recentes afirmam que as vacinas contra o câncer têm efetivamente melhorado o progresso dos tratamentos clínicos do câncer, pois direcionam o sistema imunológico de pacientes com câncer a reconhecer antígenos como estranhos ao corpo³. Além disso, múltiplos epítopos de células T localizados dentro ou fora de células tumorais podem ser usados para projetar vacinas peptídicas, que têm mostrado vantagens no tratamento de cânceres metastáticos devido à falta de toxicidade significativa associada à radioterapia e quimioterapia ^4,5. Desde meados da década de 1990, ensaios pré-clínicos e clínicos para tratamento tumoral têm sido conduzidos principalmente utilizando vacinas antipeptídicas, mas poucas vacinas exibem efeito terapêutico adequado em pacientes com^câncer6. Além disso, as vacinas contra o câncer com epítopos peptídicos apresentam baixa imunogenicidade e insuficiente eficiência de liberação, o que pode ser devido à rápida degradação de peptídeos extracelulares que se difundem rapidamente do local de administração, o que leva à captação insuficiente de antígenos pelas células imunes⁷. Portanto, é necessário superar esses obstáculos com a tecnologia de entrega de vacinas.

OVA 257-264, o epítopo_257-264 de ligação MHC classe I expresso como uma proteína de fusão, é um epítopo modelo frequentemente usado⁸. Além disso, o OVA_257-264 é crucial para a resposta imune adaptativa contra tumores, que depende da resposta citotóxica de linfócitos T (CTL). É mediada por células T CD8⁺ antígeno-específicas no tumor, que são induzidas pelo peptídeo OVA_257-264 . Caracteriza-se pela insuficiência de granzima B, que é liberada por células T citotóxicas, levando à apoptose das células-alvo⁸. No entanto, a administração livre do peptídeo OVA_257-264 pode induzir pouca atividade da CTL porque a captação desses antígenos ocorre em células inespecíficas em vez de células apresentadoras de antígenos (APCs). A deficiência de estimulação imunológica adequada resulta em atividade da CTL⁵. Portanto, a indução de atividade eficaz da CTL exige avanços consideráveis.

Devido à barreira proporcionada pelas células epiteliais e à secreção contínua de muco, antígenos vacinais são rapidamente removidos da mucosa^nasal9,10. O desenvolvimento de um vetor vacinal eficiente que possa atravessar o tecido mucoso é crucial, pois as células apresentadoras de antígenos estão situadas sob o epitélio^mucoso9. A injeção intranasal de vacinas teoricamente induz imunidade da mucosa para combater a infecção da mucosa¹¹. Além disso, a administração nasal é um método eficaz e seguro de administração de vacinas, devido à sua conveniência, à evitação da administração intestinal e à melhor adesão do paciente⁷. Portanto, a liberação nasal é um bom meio de administração para a nova nanovacina de epítopos peptídicos.

Vários biomateriais sintéticos foram desenvolvidos para combinar epítopos de interações célula-tecido e célula-célula. Certas proteínas bioativas, como Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV), foram introduzidas como parte da estrutura do hidrogel para conferir bioatividade¹². Este peptídeo provavelmente contribui para a ligação celular, migração, e crescimento¹³ e liga integrinas α 3β1 e α_6β1 para interagir com diferentes tipos de células cancerosas. O IKVAV é um peptídeo de adesão celular derivado da cadeia 1 da proteína da membrana basal da laminina α_que foi originalmente utilizado para modelar o microambiente neural e causar a diferenciação neuronal¹⁴. Portanto, encontrar um veículo de entrega eficiente para esta nova vacina é importante para o controle da doença.

Sistemas de emulsão recentemente relatados, como W805EC e MF59, também têm sido compostos para a liberação na cavidade nasal de vacina inativada contra influenza ou antígeno de superfície recombinante da hepatite B e ilustrados para desencadear imunidade tanto da mucosa quanto da^sistêmica15. As nanoemulsões (NEs) têm as vantagens de fácil administração e conveniente co-formação com adjuvantes efetivos em comparação com sistemas de liberação de mucosa particulada¹⁶. Tem sido relatado que as vacinas em nanoemulsão alteram o fenótipo alérgico de forma sustentada, diferente da dessensibilização tradicional, o que resulta em efeitos supressivos de longo prazo¹⁷. Outros relataram que nanoemulsões combinadas com antígenos imunodominantes específicos para o M. tuberculosis poderiam induzir respostas celulares potentes da mucosa e conferir proteção significativa¹⁸. Portanto, uma nova nanovacina auto-montada intranasal com o peptídeo sintético IKVAV-OVA 257-264 (I-OVA, o peptídeo que consiste em IKVAV ligado ao OVA_257-264) foi projetada. É importante avaliar esta nova nanovacina sistematicamente.

O objetivo deste protocolo é avaliar sistematicamente as características físico-químicas, toxicidade e estabilidade da nanovacina, detectar se a captação do antígeno e os efeitos protetores e terapêuticos são potencializados por meios técnicos e elaborar os principais conteúdos experimentais. Neste estudo, estabelecemos uma série de protocolos para estudar as características físico-químicas e a estabilidade, determinar a magnitude da toxicidade do I-OVA NE para células BEAS-2B por CCK-8, e observar a capacidade de apresentação de antígenos de células BEAS-2B para a vacina usando microscopia confocal, avaliar os perfis de liberação desta nova nanovacina in vivo e in vitro, e detectar o efeito protetor e terapêutico desta vacina usando um modelo de camundongo portador de tumor E.G7-OVA.

Protocolo

Os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com o Laboratory Animal – Guideline for ethical review of animal welfare (GB/T 35892-2018) e foram aprovados pelo Comitê de Ética e Bem-Estar Animal de Laboratório da Terceira Universidade Médica Militar. Os camundongos foram eutanasiados por injeção intraperitoneal de 100 mg/kg de pentobarbital sódico a 1%.

1. Preparação do I-OVA NE

1. Misture 1 mg de lipídio monofosforílico A (MPLA) com 100 μL de DMSO, vórtice por 5 min, e deixe repousar por 4 h à temperatura ambiente (TR) para dissolver completamente.
2. Adicione Tween 80 e I-OVA quantitativamente e misture.
   NOTA: Tween 80 e I-OVA foram misturados a uma razão de massa de 25:1¹⁹.
3. Adicionar esqualeno à mistura preparada no passo 1.2 (7:3, Smix: esqualeno).
4. Adicionar 100 μL de solução de MPLA (10 mg/ml) à mistura preparada na etapa 1.3.
5. Preparar a vacina de nanoemulsão usando métodos de emulsificação de baixa energia¹⁹: adicionar a solução misturada a gotículas de água a aproximadamente 70% do volume total e agitar suavemente para obter uma mistura transparente e de fácil fluidez.
   OBS: O controle BNE (emulsão em branco) foi preparado pelo mesmo método, substituindo a água por I-OVA.

2. Caracterização físico-química e estabilidade

NOTA: Avaliar a distribuição do tamanho das gotículas, o potencial zeta e outros dados físico-químicos da vacina I-OVA NE seguindo os passos 2.1-2.3; realizar a caracterização morfológica da vacina I-OVA NE seguindo os passos 2.4-2.7; e examinar a estrutura 3D da vacina I-OVA NE seguindo os passos 2.8-2.9.

1. Misturar 50 mg de proteína de mucina com 100 mL de água para injeção para preparar uma solução de mucina a 0,05%.
2. Diluir 4 mg/mL I-OVA NE 200 vezes com 0,05 mg/mL de proteína mucina ou água deionizada.
3. Observe o tamanho das partículas, o potencial zeta, o índice de polidispersidade (PDI) e a mobilidade eletroforética a 25 °C usando um nanoanalisador¹⁹.
4. Diluir 10 μL de I-OVA NE 200 vezes com 2 mL de água deionizada.
5. Colocar 5 μL da vacina I-OVA NE pré-diluída (passo 2.4) numa grelha de cobre revestida com carbono e cobri-la com 10 μL de ácido fosfotúngstico a 1% durante 3 minutos.
6. Retire o excesso de ácido fosfotúngstico com papel de filtro.
7. Obtenha imagens usando MET. Colocar uma amostra de 10 μL diluída 50 vezes sobre uma grelha de cobre de carbono de 100 malhas e deixá-la repousar à temperatura ambiente (RT) durante 5 minutos antes de adicionar 10 μL de ácido fosfotúngstico (1%, pH 7,4). Examinar todas as amostras por ETM a uma tensão de 120 kV.
8. Caracterizar a morfologia molecular do I-OVA NEutilizando um microscópio de força atômica de alta resolução. Obter as imagens coloridas de I-OVA NE nas seguintes condições: para sondas de tungstênio (constante de força: 0,06 N·^m-1); Faixa de varredura: 450 nm x 450 nm; Modo de toque: Modo de imagem; e método de varredura: varredura ponto a ponto em RT.

3. Ensaios de toxicidade in vitro e in vivo

NOTA: A toxicidade in vitro da vacina I-OVA NE foi avaliada seguindo as etapas 3.1-3.9, e a toxicidade in vivo da vacina I-OVA NE foi avaliada seguindo as etapas 3.10-3.13.

1. Reviver células epiteliais humanas BEAS-2B seguindo os passos 3.1.1-3.1.4 e cultivá-las em meio de crescimento completo a 37 °C em uma incubadora de 5% de CO₂ .
   NOTA: Para preparar o meio de crescimento completo, adicionar soro fetal bovino (SFB) e penicilina/estreptomicina ao meio RPMI-1640 nas concentrações finais de 10% e 1%, respectivamente.
   1. Ligue o banho-maria e ajuste a temperatura para 37 °C. Retire os frascos para injetáveis de células congelados em azoto líquido e descongele rapidamente num banho-maria a 37 °C.
   2. Após o descongelamento, pipetar rapidamente as células para um tubo de centrífuga estéril de 15 mL, adicionar 2 mL do meio de crescimento completo e centrifugar a 129 x g por 5 min.
   3. Retire o sobrenadante, adicione 2 mL do meio de crescimento completo para ressuspender as células e centrifugar a 129 x g por 5 min.
   4. Remover o sobrenadante, adicionar 6 mL de meio de crescimento completo para ressuspender as células e transferir as células para um frasco de cultura T25 para cultura das células a 37 °C em uma incubadora de CO₂ a 5%.
2. Quando a densidade celular atingir 80%-90%, descartar o meio de cultura e lavar as células duas vezes com 2 mL de PBS. Adicionar 1 mL de tripsina a 0,25% para digerir as células por 1-2 min. Quando o arredondamento das células for observado, adicione imediatamente 4 mL do meio de crescimento completo para neutralizar a tripsina.
3. Misturar e aspirar as amostras num tubo de centrífuga estéril de 15 ml e centrifugar a 129 x g durante 5 minutos.
4. Retirar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de meio RPMI-1640 completo. Use 20 μL para contagem celular e dilua as células para 1 x 10⁵ células/mL.
5. Plaquear as células BEAS-2B a uma densidade de 1 x 10⁴ células/poço em placas de 96 poços em meio completo RPMI-1640 de 100 μL e pré-incubar as placas por 24 h a 37 °C em uma incubadora de 5% CO₂ .
6. Eliminar o sobrenadante e adicionar 100 μL de I-OVA NE, 100 μL de I-OVA+BNE (fisicamente misturado) e 100 μL de I-OVA pré-diluído com um meio de crescimento completo em várias concentrações finais (0,5 mg/mL, 1 mg/mL, 2 mg/mL, 4 mg/mL, 8 mg/mL), com BNE como controle. Incubar durante 24 h a 37 °C.
   NOTA: Adicionar 100 μL de meio de crescimento completo aos grupos controle negativo e 100 μL de suspensão celular (1 x 10⁵/mL) aos grupos controle positivo.
7. Retire o meio e adicione 90 μL de meio de crescimento completo e 10 μL de solução de CCK-8 a cada poço da placa.
8. Incubar a placa durante 2 h a 37 °C numa incubadora a 5% de CO₂ .
9. Medir a absorbância de cada poço a 450 nm usando um leitor de placas marcado com enzima.
10. Calcular a razão de sobrevivência das células BEAS-2B conforme indicado na seguinte equação:
    (_Amostra OD450− OD450 controle negativo/_{OD450 controle positivo}− OD450 _{controle negativo}) × 100%
11. Dividir aleatoriamente camundongos C57BL/6 com 6 semanas de idade em cinco grupos (n = 5 em cada grupo) e anestesiar-os com isoflurano a 4% para indução. Manter anestesia com isoflurano a 2%. Use pomada de sulfato de neomicina nos olhos dos ratos para evitar o ressecamento.
12. Use pontas de pipeta de 10 μL para realizar a imunização nasal dos camundongos com 10 μL/narina de I-OVA, I-OVA+BNE e IOVA NE a 4 mg/mL durante todos os 3 dias. Utilizar BNE e PBS como controle experimental.
    OBS: Fornecer suporte térmico até que o animal se recupere da anestesia.
13. Eutanásia de todos os camundongos por uma injeção intraperitoneal de 100 mg/kg de pentobarbital sódico a 1% no dia 4.
14. Cortar amostras de aproximadamente 3 mm de espessura de tecidos nasais com tesoura e remover os tecidos pulmonares.
15. Fixar os tecidos nasais e todo o tecido pulmonar em paraformaldeído a 4% por 24 horas. Desidratar os tecidos através de um gradiente seriado de álcool e xileno e, em seguida, incorporar em parafina. Corte os blocos de cera acabados em um fatiador de parafina a uma espessura de 4 μm.
16. Coloração dos cortes com hematoxilina e eosina (H&E). Em seguida, observar a toxicidade da mucosa, incluindo hiperemia, edema, infiltração neutrofílica e dano estrutural na mucosa nasal e tecido pulmonar, ao microscópio (100x e 200x)⁷.

4. Captação celular in vitro

1. Células BEAS-2B de placa a uma densidade de 5 x 10 5 células/poço em placas de 12 poços com lamínulas em 2 mL do meio de crescimento completo e pré-incubar as placas durante a noite a 37 °C em uma incubadora de⁵ % CO₂ .
2. Adicionar 100 μL de I-OVA NE (pureza: 98,3%, produzido pela empresa, 4 mg/mL) ou I-OVA (4 mg/mL) marcado com FITC a 900 μL de suspensão celular e colocar a 37 °C por 90 min.
   NOTA: Prepare o I-OVA NE rotulado com FITC, conforme descrito na etapa 4.1. Adicionar 1 mL de meio de cultura completo aos grupos controle.
3. Lavar três vezes com PBS 0,1 M (1 mL/poço) por 30 min a 37 °C após o tratamento.
4. Fixar essas amostras com paraformaldeído a 4% por 20 min no escuro. Após a fixação, retirar o paraformaldeído e lavar 3 vezes com PBS 0,1 M (1 mL/poço) por 30 min a 37 °C.
5. Pré-incubar as amostras com DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) na concentração final de 10 μg/mL por 10 min no escuro e, em seguida, lavar 5 vezes com PBS 0,1 M (1 mL/poço) por 30 min a 37 °C após o tratamento.
6. Obtenha a captação celular pelo CLSM com as seguintes configurações de parâmetro: Tamanho do quadro: 512 px x 512 px, Velocidade de varredura: 8; Passo da linha: 1; Média: 2.

5. Liberação in vivo

1. Anestesiar camundongos nus com gás isoflurano a 4% e manter a anestesia com isoflurano a 2%. Imunizar camundongos nus por via intranasal com 10 μL de I-OVA marcada com PE a 4 mg/mL ou I-OVA NE marcado com PE a 4 mg/mL em cada narina.
2. Às 0 h, 0,5 h, 1,5 h, 3, 6 h, 9 h, 12 h e 24 h, capture todos os camundongos sob anestesia pelo sistema IVIS.
3. Realizar uma varredura de fundo imediatamente antes da administração intranasal para fornecer um valor limite (Min = 1,06 x 10⁶) para ajustar as imagens coletadas em todos os momentos.
4. Clique no software Living Image para iniciar a sequência e clique em Inicializar para inicializar o sistema IVIS
5. Quando inicializada, a luz de status de temperatura no painel de controle de aquisição IVIS é vermelha. Quando a luz de status de temperatura muda para verde, a imagem pode ser executada.
6. Clique em Assistente de Criação de Imagens e escolha Fluorescência na caixa de diálogo exibida.
7. Ajuste os seguintes parâmetros: Tempo de exposição: auto sec, Binning: 8, F/Stop: 2, Campo de visão: D.
8. Selecione o filtro de excitação de 620 nm e o filtro de emissão de 670 nm. Clique em Adquirir Sequência para adquirir a imagem.
9. Processe as imagens ao vivo de todos os ratos e os dados de radiância com o software Living Image.
   1. Depois de adquirir a imagem, clique em Ferramentas de ROI na Paleta de ferramentas, selecione Círculo e faça um círculo de ROI .
   2. Clique em Medir ROIs para obter um valor quantitativo para a área de ROI.

6. Eficácia antitumoral in vivo

1. Atualizar e cultivar as células E.G7-OVA do linfoma de camundongo EL4 com um meio de crescimento completo seguindo as etapas 2.1.1-2.1.4.
   NOTA: Para preparar o meio de crescimento celular E.G7-OVA, misturar o meio RPMI 1640 com 2 mM de L-glutamina ajustado para conter 1,5 g/L de bicarbonato de sódio, 4,5 g/L de glicose, 10 mM de HEPES e 1,0 mM de piruvato de sódio e suplementado com 0,05 mM de 2-mercaptoetanol e 0,4 mg/mL de G418, 90%, e soro fetal bovino, 10%.
2. Subcultivar as células na proporção de 1:2 quando as células atingirem densidade entre 1 x 10⁶ células/mL e 1 x 10⁷ células/mL.
3. Avaliar o efeito protetor preventivo em camundongos, conforme descrito nas etapas 6.3.1-6.3.4..
   1. Divida aleatoriamente camundongos C57BL/6 com 6 semanas de idade em cinco grupos (n = 8 em cada grupo). Anestesiar camundongos nus com gás isoflurano a 4% e manter a anestesia com isoflurano a 2%. Raspe parcialmente o cabelo das costas e pomada de sulfato de neomicina nos olhos dos ratos para evitar o ressecamento.
   2. Imunizar intranasalmente os camundongos com 10 μL de 1 mg/mL I-OVA, BNE+I-OVA ou I-OVA NE em cada narina, BNE (diluído quatro vezes com PBS) ou um controle PBS 3 vezes com um intervalo de 7 dias entre cada imunização.
   3. Inocular todos os camundongos hipodermicamente no dorso direito com 5 x 10⁵ células E. G7-OVA no 7º dia após a imunização final.
   4. Aos 0, 6, 9, 12, 15 e 18 dias após a imunização final, monitore os volumes do tumor medindo dois eixos do tumor usando paquímetros digitais e registre a sobrevida de 30 dias (após a imunização final) dos camundongos.
4. Avaliar o efeito protetor terapêutico em camundongos após a inoculação de células E.G7-OVA, conforme descrito nas etapas 6.4.1-6.4.3. Para o agrupamento e o manuseamento de ratinhos, consulte o passo 6.3.1.
   1. No dia 0, injetar os camundongos C57BL/6 por via subcutânea no dorso direito com células E.G7-OVA (5 x 10⁵ células/camundongo).
   2. Aos 0, 7 e 14 dias após a injeção, imunizar todos os camundongos imunizados por via intranasal com 10 μL de I-OVA, BNE+I-OVA, I-OVA NE (todos em concentrações de 1 mg/mL), BNE ou PBS três vezes em cada narina.
   3. Aos 0, 6, 9, 12, 15 e 18 dias após a injeção, monitorar o volume tumoral e registrar a sobrevida de 30 dias dos camundongos.
      OBS: Se o volume tumoral exceder 3.000^mm3, os camundongos deverão ser eutanasiados por razões humanas, e esses camundongos serão considerados mortos na curva de sobrevivência. O volume tumoral é calculado por uma fórmula elipsoidal modificada, conforme indicado na seguinte equação:
      Volume = π/6 x L x W²
      onde L representa o comprimento do tumor e W representa a largura do tumor (unidade de comprimento: mm, unidade de volume: mm³).

7. Análise estatística

1. Analise as diferenças nos dados entre os diferentes grupos usando um software estatístico apropriado com ANOVA unidirecional, comparações múltiplas de Tukey ou teste t de Student. Use o método de Kaplan-Meier para estimar os resultados de sobrevida e comparar os grupos com a estatística log-rank. Expresse todos os resultados como média ± DP. A significância dos valores de P < 0,05, P < 0,01 e P < 0,001 é representada usando *, **, e ***, respectivamente, nos gráficos.

Resultados

De acordo com o protocolo, concluímos o preparo e a avaliação experimental in vitro e in vivo da liberação da nanovacina tumoral nasal. MET, AFM e DLS são meios eficazes para a avaliação das características básicas do potencial zeta superficial e do tamanho de partícula da nanovacina (Figura 1). As células epiteliais BEAS-2B são um modelo de triagem útil para o teste de toxicidade in vitro de vacinas nasais (Figura 2A). A...

Discussão

Nanovacinas funcionalizadas com membranas de imunoócitos têm grandes vantagens na terapia doença-alvo, e os efeitos colaterais são minimizados por propriedades como tropismo tumoral único, identificação de alvos específicos, circulação prolongada, interações intercelulares aumentadas e baixa toxicidade sistêmica. Também podem ser facilmente integrados com outros módulos de tratamento para tratar os cânceres de forma cooperativa^16,20. Atributos des...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plates	Corning Incorporated, USA	CLS3922
Bio-Rad 6.0 microplate reader	Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA	Bio-Rad 6.0
CCK-8 kits	Dojindo, Japan	CK04
Centrifuge 5810 R	Eppendorf, Germany	5811000398
DAPI	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	D9542
fetal bovine serum (FBS)	Hyclone (Life Technology, USA)	SH30088.03
FITC-labeled I-OVA	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	NA
HF 90/240 Incubator	Heal Force, Switzerland	NA
HPLC	Shanghai Botai Biotechology Co., Ltd.	E2695
Inverted Microscope	Nikon,Japan	DSZ5000X
IPC-208	Chong Qing University, China	NA
IVIS system	Caliper Life Science Limited Company	NA
JEM-1230 TEM	JEOL Limited Company of Japan	1230 TEM
Malvern NANO ZS	Malvern Instruments Ltd., UK	NA
MPLA	Invivogen Lit. Co.	tlrl-mpla
Neomycin Sulfate Ointment	Shanghai CP General Pharmaceutical Co. , Ltd.	H31022262
OVA257–264	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	NA
RPMI 1640 medium	Hyclone (Life Technology, USA)	SH30809.01
Synthetic peptide (I-OVA) conjugation of IKVAV-PA	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	NA
Zeiss LSM800 laser scanning confocal fluorescence microscope	Zeiss, Germany	Zeiss LSM800