Herstellung, Eigenschaften, Toxizität und Wirksamkeitsbewertung des nasalen selbstassemblierten Nanoemulsions-Tumorimpfstoffs in vitro und in vivo

Zusammenfassung

Hier stellen wir detaillierte Methoden zur Herstellung und Evaluierung des nasalen selbstassemblierten Nanoemulsions-Tumorimpfstoffs in vitro und in vivo vor.

Zusammenfassung

Epitoppeptide haben auf dem Gebiet der Tumorimpfstoffe aufgrund ihrer Sicherheit, hohen Spezifität und bequemen Herstellung große Aufmerksamkeit erregt. Insbesondere einige MHC-I-restriktive Epitope können eine effektive zytotoxische T-Lymphozytenaktivität induzieren, um Tumorzellen zu beseitigen. Darüber hinaus ist die nasale Verabreichung aufgrund ihrer Bequemlichkeit und verbesserten Patientencompliance eine effektive und sichere Verabreichungstechnik für Tumorimpfstoffe. Epitoppeptide sind jedoch aufgrund ihrer schlechten Immunogenität und mangelnden Abgabeeffizienz für die nasale Verabreichung ungeeignet. Nanoemulsionen (NEs) sind thermodynamisch stabile Systeme, die mit Antigenen beladen und direkt an die Nasenschleimhautoberfläche abgegeben werden können. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) ist das Kernpentapeptid von Laminin, einem Integrin-bindenden Peptid, das von menschlichen Epithelzellen der Atemwege exprimiert wird. In dieser Arbeit wurde ein intranasaler selbstassemblierter Epitoppeptid-NE-Tumorimpfstoff, der das synthetische Peptid IKVAV-OVA_{257-264 (I-OVA} ) enthielt, durch eine niederenergetische Emulgiermethode hergestellt. Die Kombination von IKVAV und OVA_257-264 kann die Antigenaufnahme durch die Epithelzellen der Nasenschleimhaut verbessern. Hier erstellen wir ein Protokoll zur Untersuchung der physikalisch-chemischen Eigenschaften mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), Rasterkraftmikroskopie (AFM) und dynamischer Lichtstreuung (DLS); Stabilität in Gegenwart von Muzinprotein; Toxizität durch Untersuchung der Zellviabilität von BEAS-2B-Zellen und des Nasen- und Lungengewebes von C57BL/6-Mäusen; zelluläre Aufnahme durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM); Freisetzungsprofile durch Bildgebung von Kleintieren in vivo; und die schützende und therapeutische Wirkung des Impfstoffs unter Verwendung eines E.G7-Tumor-tragenden Modells. Wir gehen davon aus, dass das Protokoll technische und theoretische Hinweise für die zukünftige Entwicklung neuartiger T-Zell-Epitop-Peptid-Mukosa-Impfstoffe liefern wird.

Einleitung

Als eine der wichtigsten Innovationen im Bereich der öffentlichen Gesundheit spielen Impfstoffe eine Schlüsselrolle bei der Bekämpfung der globalen Krankheitslast beim Menschen¹. So werden derzeit mehr als 120 Impfstoffkandidaten gegen COVID-19-Erkrankungen getestet, von denen einige in vielen Ländern zugelassen sind². Jüngste Berichte besagen, dass Krebsimpfstoffe den Fortschritt klinischer Krebsbehandlungen effektiv verbessert haben, da sie das Immunsystem von Krebspatienten dazu bringen, Antigene als körperfremd zu erkennen³. Darüber hinaus können mehrere T-Zell-Epitope, die sich innerhalb oder außerhalb von Tumorzellen befinden, zur Entwicklung von Peptidimpfstoffen verwendet werden, die sich bei der Behandlung von metastasierendem Krebs als vorteilhaft erwiesen haben, da sie nicht die signifikante Toxizität aufweisen, die mit Strahlen- und Chemotherapie verbunden ist ^4,5. Seit Mitte der 1990er Jahre werden präklinische und klinische Studien zur Tumorbehandlung hauptsächlich mit Antigenpeptid-Impfstoffen durchgeführt, aber nur wenige Impfstoffe zeigen eine ausreichende therapeutische Wirkung bei Krebspatienten⁶. Darüber hinaus weisen Krebsimpfstoffe mit Peptidepitopen eine schlechte Immunogenität und eine unzureichende Verabreichungseffizienz auf, was auf den schnellen Abbau extrazellulärer Peptide zurückzuführen sein kann, die schnell von der Verabreichungsstelle diffundieren, was zu einer unzureichenden Antigenaufnahme durch Immunzellen führt⁷. Daher ist es notwendig, diese Hindernisse mit Technologie zur Verabreichung von Impfstoffen zu überwinden.

OVA 257-264, das MHC-Klasse-I-bindende_{257-264-Epitop}, das als Fusionsprotein exprimiert wird, ist ein häufig verwendetes Modellepitop⁸. Darüber hinaus ist OVA_257-264 entscheidend für die adaptive Immunantwort gegen Tumore, die von der zytotoxischen T-Lymphozyten-Antwort (CTL) abhängt. Sie wird durch antigenspezifische CD8⁺ T-Zellen im Tumor vermittelt, die durch das OVA_257-264 Peptid induziert werden. Es ist gekennzeichnet durch unzureichendes Granzym B, das von zytotoxischen T-Zellen freigesetzt wird, was zur Apoptose der Zielzellen führt⁸. Die Verabreichung von freiem OVA_{257-264-Peptid} kann jedoch eine geringe CTL-Aktivität induzieren, da die Aufnahme dieser Antigene in unspezifischen Zellen und nicht in antigenpräsentierenden Zellen (APCs) erfolgt. Das Fehlen einer geeigneten Immunstimulation führt zu einer CTL-Aktivität⁵. Daher erfordert die Induktion einer wirksamen CTL-Aktivität erhebliche Fortschritte.

Aufgrund der Barriere durch Epithelzellen und der kontinuierlichen Schleimsekretion werden Impfantigene schnell aus dem Nasenschleim entfernt ^9,10. Die Entwicklung eines effizienten Impfstoffvektors, der das Schleimhautgewebe passieren kann, ist von entscheidender Bedeutung, da sich die antigenpräsentierenden Zellen unter dem Schleimhautepithel befinden⁹. Die intranasale Injektion von Impfstoffen induziert theoretisch eine Immunität der Schleimhäute zur Bekämpfung von Schleimhautinfektionen¹¹. Darüber hinaus ist die nasale Verabreichung eine effektive und sichere Verabreichungsmethode für Impfstoffe, da sie bequem ist, die Verabreichung des Darms vermeidet und die^{Compliance der Patienten} verbessert 7. Daher ist die nasale Verabreichung ein gutes Mittel zur Verabreichung des neuartigen Peptid-Epitop-Nanoimpfstoffs.

Es wurden mehrere synthetische Biomaterialien entwickelt, um Epitope von Zellgewebe und Zell-Zell-Interaktionen zu kombinieren. Bestimmte bioaktive Proteine, wie z. B. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV), wurden als Teil der Struktur des Hydrogels eingeführt, um Bioaktivität zu verleihen¹². Dieses Peptid trägt wahrscheinlich zur Zellanhaftung, -migration und -ausbildung^{bei 13} und bindet Integrine α 3β1 und α_6β1, um mit verschiedenen Krebszelltypen zu interagieren. IKVAV ist ein Zelladhäsionspeptid, das sich von der Laminin-Basalmembranprotein-α-1-Kette ableitet, die ursprünglich zur Modellierung der neuronalen Mikroumgebung und zur neuronalen Differenzierung verwendet wurde¹⁴. Daher ist es wichtig, ein effizientes Verabreichungsvehikel für diesen neuartigen Impfstoff zu finden, um Krankheiten zu kontrollieren.

Kürzlich beschriebene Emulsionssysteme wie W805EC und MF59 wurden ebenfalls für die Verabreichung von inaktiviertem Influenza-Impfstoff oder rekombinantem Hepatitis-B-Oberflächenantigen in die Nasenhöhle hergestellt und es wurde gezeigt, dass sie sowohl eine mukosale als auch eine systemische Immunität auslösen¹⁵. Nanoemulsionen (NEs) haben im Vergleich zu partikulären Schleimhautverabreichungssystemen die Vorteile einer einfachen Verabreichung und einer bequemen Co-Bildung mit wirksamen Adjuvantien¹⁶. Es wurde berichtet, dass Nanoemulsionsimpfstoffe den allergischen Phänotyp nachhaltig verändern, anders als bei der herkömmlichen Desensibilisierung, was zu langfristigen unterdrückenden Wirkungen führt¹⁷. Andere berichteten, dass Nanoemulsionen in Kombination mit Mtb-spezifischen immundominanten Antigenen starke Schleimhautzellantworten induzieren und einen signifikanten Schutz verleihen könnten¹⁸. Daher wurde ein neuartiger intranasaler selbstassemblierter Nanoimpfstoff mit dem synthetischen Peptid IKVAV-OVA 257-264 (I-OVA, das Peptid bestehend aus IKVAV gebunden an OVA_257-264) entwickelt. Es ist wichtig, diesen neuartigen Nanoimpfstoff systematisch zu bewerten.

Ziel dieses Protokolls ist es, die physikalisch-chemischen Eigenschaften, die Toxizität und die Stabilität des Nanoimpfstoffs systematisch zu bewerten, festzustellen, ob die Antigenaufnahme und die schützende und therapeutische Wirkung mit technischen Mitteln verbessert werden, und die wichtigsten experimentellen Inhalte zu erläutern. In dieser Studie haben wir eine Reihe von Protokollen erstellt, um die physikalisch-chemischen Eigenschaften und die Stabilität zu untersuchen, das Ausmaß der Toxizität der I-OVA NE zu BEAS-2B-Zellen durch CCK-8 zu bestimmen und die Antigen-präsentierende Fähigkeit von BEAS-2B-Zellen zum Impfstoff mittels konfokaler Mikroskopie zu beobachten, die Freisetzungsprofile dieses neuartigen Nanoimpfstoffs in vivo und in vitro zu bewertenund die schützende und therapeutische Wirkung dieses Impfstoffs anhand eines E.G7-OVA-Tumor-tragenden Mausmodells nachzuweisen.

Protokoll

Die Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit der Laboratory Animal – Guideline for ethical review of animal welfare (GB/T 35892-2018) durchgeführt und von der Laboratory Animal Welfare and Ethics Commission der Dritten Militärmedizinischen Universität genehmigt. Die Mäuse wurden durch eine intraperitoneale Injektion von 100 mg/kg 1% Natrium-Pentobarbital euthanasiert.

1. Vorbereitung der I-OVA NE

1. Mischen Sie 1 mg Monophosphoryllipid A (MPLA) mit 100 μl DMSO, wirbeln Sie 5 Minuten lang und lassen Sie es 4 Stunden bei Raumtemperatur (RT) stehen, um sich vollständig aufzulösen.
2. Fügen Sie Tween 80 und I-OVA quantitativ hinzu und mischen Sie.
   HINWEIS: Tween 80 und I-OVA wurden in einem Massenverhältnis von 25:1¹⁹ gemischt.
3. Fügen Sie Squalen zu der in Schritt 1.2 zubereiteten Mischung hinzu (7:3, Smix: Squalen).
4. Fügen Sie 100 μl MPLA-Lösung (10 mg/ml) zu der in Schritt 1.3 hergestellten Mischung hinzu.
5. Bereiten Sie den Nanoemulsionsimpfstoff mit energiesparenden Emulgiermethoden¹⁹ vor: Geben Sie die gemischte Lösung bei ca. 70 % des Gesamtvolumens zu Wassertröpfchen und rühren Sie vorsichtig um, um eine transparente und leicht fließende Mischung zu erhalten.
   HINWEIS: Die BNE-Kontrolle (Blindemulsion) wurde nach der gleichen Methode hergestellt, wobei Wasser durch I-OVA ersetzt wurde.

2. Physikalisch-chemische Charakterisierung und Stabilität

HINWEIS: Beurteilen Sie die Tröpfchengrößenverteilung, das Zetapotenzial und andere physikalisch-chemische Daten des I-OVA NE-Impfstoffs gemäß den Schritten 2.1-2.3; Durchführung der morphologischen Charakterisierung des I-OVA NE-Impfstoffs gemäß den Schritten 2.4-2.7; und untersuchen Sie die 3D-Struktur des I-OVA NE-Impfstoffs nach den Schritten 2.8-2.9.

1. Mischen Sie 50 mg Muzinprotein mit 100 ml Wasser für Injektionszwecke, um eine 0,05%ige Muzinlösung herzustellen.
2. 4 mg/ml I-OVA NE 200-fach mit 0,05 mg/ml Muzinprotein oder deionisiertem Wasser verdünnen.
3. Beobachten Sie die Partikelgrößen, das Zetapotential, den Polydispersitätsindex (PDI) und die elektrophoretische Mobilität bei 25 °C mit einem Nanoanalysator¹⁹.
4. 10 μl I-OVA NE 200-fach mit 2 ml deionisiertem Wasser verdünnen.
5. Geben Sie 5 μl vorverdünnten I-OVA NE-Impfstoff (Schritt 2.4) auf ein kohlenstoffbeschichtetes Kupfergitter und bedecken Sie es 3 Minuten lang mit 10 μl 1%iger Phosphowolframsäure.
6. Entfernen Sie die überschüssige Phosphowolframsäure mit Filterpapier.
7. Abrufen von Bildern mit TEM. Legen Sie eine 50-fach verdünnte 10-μl-Probe auf ein 100-mesh-Kohlenstoffkupfergitter und lassen Sie sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) stehen, bevor Sie 10 μl Phosphowolframsäure (1%, pH 7,4) hinzufügen. Untersuchen Sie alle Proben mit TEM bei einer Spannung von 120 kV.
8. Charakterisieren Sie die molekulare Morphologie der I-OVA NE mit einem hochauflösenden Rasterkraftmikroskop. Die Farbbilder von I-OVA NE sind unter folgenden Bedingungen zu erhalten: für Wolframsonden (Kraftkonstante: 0,06 N·^m-1); Scanbereich: 450 nm x 450 nm; Tapping-Modus: Imaging-Modus; und Scanmethode: Punkt-für-Punkt-Scannen bei RT.

3. In-vitro- und In-vivo-Toxizitätstests

ANMERKUNG: Die In-vitro-Toxizität des I-OVA NE-Impfstoffs wurde nach den Schritten 3.1 bis 3.9 und die In-vivo-Toxizität des I-OVA NE-Impfstoffs nach den Schritten 3.10 bis 3.13 bewertet.

1. Humane BEAS-2B-Epithelzellen werden nach den Schritten 3.1.1-3.1.4 wiederbelebt und in einem vollständigen Wachstumsmedium bei 37 °C in einem 5% CO₂ -Inkubator kultiviert.
   Anmerkungen: Um das vollständige Nährmedium herzustellen, fügen Sie dem RPMI-1640-Medium fötales Kälberserum (FBS) und Penicillin/Streptomycin in Endkonzentrationen von 10 % bzw. 1 % hinzu.
   1. Schalten Sie das Wasserbad ein und stellen Sie die Temperatur auf 37 °C ein. Entfernen Sie die in flüssigem Stickstoff eingefrorenen Zellfläschchen und tauen Sie sie schnell in einem 37 °C warmen Wasserbad auf.
   2. Nach dem Auftauen werden die Zellen schnell in ein steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen pipettiert, 2 ml des gesamten Wachstumsmediums hinzugefügt und 5 Minuten lang bei 129 x g zentrifugiert.
   3. Entfernen Sie den Überstand, fügen Sie 2 ml des gesamten Wachstumsmediums hinzu, um die Zellen zu resuspendieren, und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 129 x g.
   4. Entfernen Sie den Überstand, fügen Sie 6 ml des vollständigen Wachstumsmediums hinzu, um die Zellen zu resuspendieren, und überführen Sie die Zellen in einen T25-Kulturkolben, um die Zellen bei 37 °C in einem 5% CO₂ -Inkubator zu kultivieren.
2. Wenn die Zelldichte 80%-90% erreicht, verwerfen Sie das Nährmedium und waschen Sie die Zellen zweimal mit 2 ml PBS. Fügen Sie 1 ml 0,25%iges Trypsin hinzu, um die Zellen 1-2 Minuten lang zu verdauen. Wenn eine Rundung der Zellen beobachtet wird, fügen Sie sofort 4 ml des gesamten Wachstumsmediums hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren.
3. Mischen und saugen Sie die Proben in ein steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 129 x g .
4. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml RPMI-1640 Komplettmedium. Verwenden Sie 20 μl für die Zellzählung und verdünnen Sie die Zellen auf 1 x 10⁵ Zellen/ml.
5. Die BEAS-2B-Zellen werden mit einer Dichte von 1 x 10⁴ Zellen/Well in 96-Well-Platten in 100 μl RPMI-1640 Komplettmedium geplättet und die Platten für 24 h bei 37 °C in einem 5% CO₂ -Inkubator vorinkubiert.
6. Verwerfen Sie den Überstand und fügen Sie 100 μl I-OVA NE, 100 μl I-OVA+BNE (physikalisch gemischt) und 100 μl I-OVA vorverdünnt mit einem vollständigen Wachstumsmedium in verschiedenen Endkonzentrationen (0,5 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml, 4 mg/ml, 8 mg/ml) mit BNE als Kontrolle hinzu. 24 h bei 37 °C inkubieren.
   HINWEIS: Fügen Sie den Negativkontrollgruppen 100 μl vollständiges Wachstumsmedium und den Positivkontrollgruppen 100 μl Zellsuspension (1 x 10⁵/ml) hinzu.
7. Entfernen Sie das Medium und geben Sie 90 μl vollständiges Wachstumsmedium und 10 μl CCK-8-Lösung in jede Vertiefung der Platte.
8. Inkubieren Sie die Platte für 2 h bei 37 °C in einem 5% CO_{2 -} Inkubator.
9. Messen Sie die Absorption jeder Vertiefung bei 450 nm mit einem enzymmarkierten Plattenleser.
10. Berechnen Sie das Überlebensverhältnis von BEAS-2B-Zellen wie in der folgenden Gleichung angegeben:
    (OD450-Probe − OD450 Negativkontrolle/OD450 Positivkontrolle − OD450 _{Negativkontrolle}) × 100 %
11. 6 Wochen alte C57BL/6-Mäuse werden nach dem Zufallsprinzip in fünf Gruppen (n = 5 in jeder Gruppe) aufgeteilt und zur Induktion mit 4 % Isofluran betäubt. Pflegen Sie die Anästhesie mit 2% Isofluran. Verwenden Sie Neomycinsulfat-Salbe auf den Augen der Mäuse, um Trockenheit vorzubeugen.
12. Verwenden Sie 10-μl-Pipettenspitzen, um die nasale Immunisierung der Mäuse mit 10 μl/Nasenloch I-OVA, I-OVA+BNE und IOVA NE in einer Dosierung von 4 mg/ml für alle 3 Tage durchzuführen. Verwenden Sie BNE und PBS als experimentelle Kontrolle.
    Anmerkungen: Bieten Sie thermische Unterstützung, bis sich das Tier von der Narkose erholt hat.
13. Euthanasieren Sie alle Mäuse durch eine intraperitoneale Injektion von 100 mg/kg 1% Natrium-Pentobarbital an Tag 4.
14. Schneiden Sie mit einer Schere ca. 3 mm dicke Proben des Nasengewebes ab und entfernen Sie das Lungengewebe.
15. Fixieren Sie das Nasengewebe und das gesamte Lungengewebe 24 h lang in 4%igem Paraformaldehyd. Dehydrieren Sie das Gewebe durch einen seriellen Alkohol- und Xylolgradienten und betten Sie es dann in Paraffin ein. Die fertigen Wachsblöcke auf einem Paraffinschneider mit einer Dicke von 4 μm in Scheiben schneiden.
16. Färben Sie die Schnitte mit Hämatoxylin und Eosin (H&E). Beobachten Sie dann die Schleimhauttoxizität, einschließlich Hyperämie, Ödemen, Infiltration neutrophiler Granulozyten und struktureller Schäden in der Nasenschleimhaut und im Lungengewebe, unter dem Mikroskop (100x und 200x)⁷.

4. In-vitro-Zellaufnahme

1. BEAS-2B-Zellen mit einer Dichte von 5 x 10 5 Zellen/Well in 12-Well-Platten mit Deckgläsern in 2 mL des kompletten Nährmediums einfüllen und die Platten über Nacht bei 37 °C in einem⁵ % CO₂ -Inkubator vorinkubieren.
2. 100 μl FITC-markierte I-OVA NE (Reinheit: 98,3 %, vom Unternehmen hergestellt, 4 mg/ml) oder I-OVA (4 mg/ml) zu 900 μl Zellsuspension geben und 90 min bei 37 °C platzieren.
   HINWEIS: Bereiten Sie die FITC-gekennzeichnete I-OVA NE wie in Schritt 4.1 beschrieben vor. Fügen Sie den Kontrollgruppen 1 ml des vollständigen Wachstumsmediums hinzu.
3. Nach der Behandlung dreimal mit 0,1 M PBS (1 ml/Well) für 30 min bei 37 °C waschen.
4. Fixieren Sie diese Proben mit 4%igem Paraformaldehyd für 20 Minuten im Dunkeln. Nach der Fixierung wird das Paraformaldehyd entfernt und 3 mal mit 0,1 M PBS (1 ml/Well) für 30 min bei 37 °C gewaschen.
5. Die Proben werden mit DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindol) in einer Endkonzentration von 10 μg/ml für 10 min im Dunkeln vorinkubiert und dann nach der Behandlung 5 mal mit 0,1 M PBS (1 mL/Well) für 30 min bei 37 °C gewaschen.
6. Ermitteln Sie die zelluläre Aufnahme durch CLSM mit den folgenden Parametereinstellungen: Bildgröße: 512 px x 512 px, Scangeschwindigkeit: 8; Zeilenschritt: 1; Mittelwert: 2.

5. In-vivo-Freisetzung

1. Betäuben Sie nackte Mäuse mit 4 % Isoflurangas und halten Sie die Anästhesie bei 2 % Isofluran aufrecht. Immunisieren Sie Nacktmäuse intranasal mit 10 μl PE-markierten I-OVA in 4 mg/ml oder PE-markierten I-OVA NE in 4 mg/ml in jedem Nasenloch.
2. Bei 0 h, 0,5 h, 1,5 h, 3, 6 h, 9 h, 12 h und 24 h werden alle Mäuse unter Narkose vom IVIS-System erfasst.
3. Führen Sie unmittelbar vor der intranasalen Verabreichung einen Hintergrundscan durch, um einen Schwellenwert (Min = 1,06 x 10⁶) zu ermitteln, um die zu allen Zeitpunkten aufgenommenen Bilder anzupassen.
4. Klicken Sie auf die Living Image-Software, um die Sequenz zu starten, und klicken Sie auf Initialisieren, um das IVIS-System zu initialisieren
5. Bei der Initialisierung leuchtet die Temperaturstatusanzeige in der IVIS-Erfassungszentrale rot. Wenn die Temperaturstatusanzeige auf grün wechselt, kann eine Bildgebung durchgeführt werden.
6. Klicken Sie auf Imaging-Assistent , und wählen Sie dann im angezeigten Dialogfeld Fluoreszenz aus.
7. Passen Sie die folgenden Parameter an: Belichtungszeit: Automatik, Binning: 8, Blende: 2, Sichtfeld: D.
8. Wählen Sie den 620-nm-Anregungsfilter und den 670-nm-Emissionsfilter. Klicken Sie auf Sequenz erfassen, um das Bild zu erfassen .
9. Verarbeiten Sie die Live-Bilder aller Mäuse und die Strahldichtedaten mit der Living Image-Software.
   1. Nachdem Sie das Bild aufgenommen haben, klicken Sie in der Werkzeugpalette auf ROI-Werkzeuge, wählen Sie Kreis und erstellen Sie einen ROI-Kreis .
   2. Klicken Sie auf ROIs messen , um einen quantitativen Wert für den ROI-Bereich zu erhalten.

6. In-vivo-Antitumor-Wirksamkeit

1. Die E.G7-OVA-Zellen des Maus-Lymphoms aus EL4 werden mit einem vollständigen Nährmedium nach den Schritten 2.1.1-2.1.4 aufgefrischt und kultiviert.
   Anmerkungen: Zur Herstellung eines vollständigen Wachstumsmediums für E.G7-OVA-Zellen wird das Medium RPMI 1640 mit 2 mM L-Glutamin gemischt, das so eingestellt ist, dass es 1,5 g/l Natriumbicarbonat, 4,5 g/l Glukose, 10 mM HEPES und 1,0 mM Natriumpyruvat enthält und mit 0,05 mM 2-Mercaptoethanol und 0,4 mg/ml G418, 90%, und fötalem Kälberserum, 10%, ergänzt wird.
2. Subkultivieren Sie die Zellen im Verhältnis 1:2, wenn die Zellen eine Dichte zwischen 1 x 10⁶ Zellen/ml und 1 x 10⁷ Zellen/ml erreichen.
3. Bewerten Sie die vorbeugende Schutzwirkung bei Mäusen wie in den Schritten 6.3.1-6.3.4 beschrieben.
   1. Teilen Sie 6 Wochen alte C57BL/6-Mäuse nach dem Zufallsprinzip in fünf Gruppen ein (n = 8 in jeder Gruppe). Betäuben Sie nackte Mäuse mit 4 % Isoflurangas und halten Sie die Anästhesie mit 2 % Isofluran aufrecht. Rasieren Sie die hinteren Haare und die Neomycinsulfat-Salbe auf den Augen der Mäuse teilweise, um Trockenheit zu vermeiden.
   2. Intranasal immunisieren Sie die Mäuse mit 10 μl 1 mg/ml i-ova, BNE+I-OVA oder I-OVA NE in jedem Nasenloch, BNE (viermal mit PBS verdünnt) oder einer PBS-Kontrolle 3-mal mit einem 7-tägigen Abstand zwischen den einzelnen Immunisierungen.
   3. Impfen Sie alle Mäuse am 7. Tag nach der Endimmunisierung hypodermisch in den rechten Rücken mit 5 x 10⁵ E. G7-OVA-Zellen.
   4. Überwachen Sie 0, 6, 9, 12, 15 und 18 Tage nach der endgültigen Immunisierung das Tumorvolumen, indem Sie zwei Achsen des Tumors mit digitalen Messschiebern messen, und zeichnen Sie das 30-Tage-Überleben (nach der endgültigen Immunisierung) der Mäuse auf.
4. Die therapeutische Schutzwirkung auf Mäuse nach der Inokulation von E.G7-OVA-Zellen ist wie in den Schritten 6.4.1-6.4.3 beschrieben zu bewerten. Für die Gruppierung und den Umgang mit Mäusen siehe Schritt 6.3.1.
   1. An Tag 0 injizieren Sie die C57BL/6-Mäuse subkutan in den rechten Rücken mit E.G7-OVA-Zellen (5 x 10⁵ Zellen/Maus).
   2. Immunisieren Sie 0, 7 und 14 Tage nach der Injektion alle Mäuse, die intranasal immunisiert wurden, dreimal mit 10 μl I-OVA, BNE+I-OVA, I-OVA NE (alle in Konzentrationen von 1 mg/ml), BNE oder PBS in jedes Nasenloch.
   3. Überwachen Sie 0, 6, 9, 12, 15 und 18 Tage nach der Injektion das Tumorvolumen und zeichnen Sie das 30-Tage-Überleben der Mäuse auf.
      HINWEIS: Wenn das Tumorvolumen 3.000^mm3 überschreitet, sollten die Mäuse aus humanen Gründen eingeschläfert werden, und diese Mäuse gelten in der Überlebenskurve als tot. Das Tumorvolumen wird durch eine modifizierte ellipsoidische Formel berechnet, wie in der folgenden Gleichung angegeben:
      Volumen = π/6 x L x B²
      wobei L für die Tumorlänge und W für die Tumorbreite steht (Längeneinheit: mm, Volumeneinheit:^{mm 3}).

7. Statistische Analyse

1. Analysieren Sie die Unterschiede in den Daten zwischen den verschiedenen Gruppen mit geeigneter statistischer Software mit einfaktorieller ANOVA, Tukey-Mehrfachvergleichen oder einem Student-t-Test. Verwenden Sie die Kaplan-Meier-Methode, um die Überlebensergebnisse zu schätzen und die Gruppen mit Log-Rank-Statistiken zu vergleichen. Drücken Sie alle Ergebnisse als Mittelwert ± SD aus. Die Signifikanz der P-Werte P < 0,05, P < 0,01 und P < 0,001 wird in den Diagrammen mit *, ** bzw. *** dargestellt.

Ergebnisse

Gemäß dem Protokoll haben wir die Vorbereitung und die experimentelle In-vitro- und In-vivo-Bewertung der Verabreichung des Nanoimpfstoffs für Nasentumore abgeschlossen. TEM, AFM und DLS sind effektive Mittel zur Beurteilung der grundlegenden Eigenschaften des Zetapotenzials an der Oberfläche und der Partikelgröße des Nanoimpfstoffs (Abbildung 1). BEAS-2B-Epithelzellen sind ein nützliches Screening-Modell für die In-vitro-Toxizitätsprüfung von nasalen Impfstoffen ...

Diskussion

Nanoimpfstoffe, die mit Immunozytenmembranen funktionalisiert sind, haben große Vorteile in der krankheitsspezifischen Therapie, und die Nebenwirkungen werden durch Eigenschaften wie einzigartigen Tumortropismus, die Identifizierung spezifischer Ziele, eine verlängerte Durchblutung, verstärkte interzelluläre Interaktionen und eine geringe systemische Toxizität minimiert. Sie lassen sich auch leicht in andere Behandlungsmodule integrieren, um Krebserkrankungen kooperativ zu behandeln^16,20...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plates	Corning Incorporated, USA	CLS3922
Bio-Rad 6.0 microplate reader	Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA	Bio-Rad 6.0
CCK-8 kits	Dojindo, Japan	CK04
Centrifuge 5810 R	Eppendorf, Germany	5811000398
DAPI	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	D9542
fetal bovine serum (FBS)	Hyclone (Life Technology, USA)	SH30088.03
FITC-labeled I-OVA	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	NA
HF 90/240 Incubator	Heal Force, Switzerland	NA
HPLC	Shanghai Botai Biotechology Co., Ltd.	E2695
Inverted Microscope	Nikon,Japan	DSZ5000X
IPC-208	Chong Qing University, China	NA
IVIS system	Caliper Life Science Limited Company	NA
JEM-1230 TEM	JEOL Limited Company of Japan	1230 TEM
Malvern NANO ZS	Malvern Instruments Ltd., UK	NA
MPLA	Invivogen Lit. Co.	tlrl-mpla
Neomycin Sulfate Ointment	Shanghai CP General Pharmaceutical Co. , Ltd.	H31022262
OVA257–264	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	NA
RPMI 1640 medium	Hyclone (Life Technology, USA)	SH30809.01
Synthetic peptide (I-OVA) conjugation of IKVAV-PA	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	NA
Zeiss LSM800 laser scanning confocal fluorescence microscope	Zeiss, Germany	Zeiss LSM800