离体 尿路上皮细胞中机械活化的CA2+ 瞬变分析

摘要

该协议描述了一种使用荧光Ca^{2 +} 传感器GCaMP5G评估天然尿路上皮细胞中机械激活离子通道功能的方法。

摘要

机械激活离子通道是将机械刺激（如拉伸力或剪切力）转换为电和生化信号的生物换能器。在哺乳动物中，机械激活通道对于检测触觉、听觉、红细胞体积调节、基础血压调节和膀胱充盈感等各种过程中的外部和内部刺激至关重要。虽然机械激活离子通道的功能已在体外环境中使用膜片钳技术进行了广泛研究，但评估它们在天然环境中的功能仍然是一项艰巨的任务，通常是因为这些通道表达位点（例如，传入末端、Merkel 细胞、压力感受器和肾小管）的访问受限或难以应用膜片钳技术（例如 尿路上皮伞细胞的顶端表面）。该协议描述了一种在离体尿路上皮制剂中使用荧光传感器GCaMP5G评估机械诱发的Ca 2 +瞬变的程序，该技术可以很容易地适用于研究其他天然组织制剂中的机械诱发Ca^{2 +}事件。

引言

当尿滤液通过肾单位时，尿道中的上皮细胞受到机械力，尿液被泵出肾盂并通过输尿管储存在膀胱中。人们早就认识到，液体对泌尿道上皮细胞施加的机械力（例如剪切应力和拉伸）调节近端肾小管中蛋白质和远端肾单位中溶质的重吸收¹，²，³，⁴，⁵，⁶，⁷，⁸，⁹，¹⁰，^11，12，13，以及尿液在膀胱中的储存和排尿14，^15，16，17。

机械刺激转化为电和生化信号的过程称为机械转导，由响应细胞结构变形或相关细胞外基质变形的蛋白质介导¹⁸，¹⁹，^20，21。机械激活离子通道的独特之处在于，它们响应膜张力、压力或剪切应力的变化从封闭状态转变为开放渗透状态¹⁸，^19，20，^21，22。此外，Ca 2+瞬变可以通过整合素介导的机械转导或通过激活细胞-细胞连接处的机械响应粘附系统^{23，24，25，26}来启动。离子通道功能通常使用膜片钳技术进行评估，该技术涉及在细胞膜和贴片移液器²⁷之间形成千兆欧密封。然而，位于具有致密细胞外基质（例如肾小管）或被物理屏障（例如糖萼）包围的深层组织层中的细胞很难用玻璃微量移液器进入。同样，嵌入的细胞或作为机械稳定性差的组织组成部分的细胞（例如尿路上皮）不能轻易地用膜片钳技术进行研究。由于许多机械激活的离子通道可渗透到Ca 2+，因此另一种方法是使用Ca²⁺敏感染料或遗传编码钙指示剂（GECIs）如GCaMP）通过荧光显微镜评估其活性。最近在蛋白质工程方面的努力显着增加了GECIs²⁸，²⁹，³⁰的动态范围^，灵敏度和响应，遗传学的进步使其在特定细胞群中表达^，使其非常适合研究机械转导。

尿路上皮是覆盖膀胱内部的分层上皮，起到屏障的作用，防止尿溶质扩散到膀胱间质中，但也起到换能器的作用，感知膀胱充盈并将这些事件传达给下面的神经和肌肉组织¹⁶。先前的研究表明，尿路上皮和下层组织之间的通信需要机械激活的离子通道Piezo1和Piezo2³¹。为了评估尿路上皮细胞中机械诱导的Ca 2+瞬变，开发了一种新技术，该技术使用腺病毒基因转移在尿路上皮细胞中表达Ca²⁺传感器GCaMP5G。该技术采用粘膜片制备，可轻松进入最外层的伞状细胞层和计算机辅助系统，用于用封闭的玻璃微量移液管同时机械刺激单个细胞并记录荧光随时间的变化。

研究方案

动物的护理和处理是根据匹兹堡大学机构动物护理和使用委员会进行的。雌性，2-4个月大的C57Bl / 6J小鼠用于本研究。小鼠是商业获得的（见 材料表）。

1. 设备组装与设置

1. 使用配备高分辨率相机和稳定光源的正置显微镜进行Ca²⁺ 成像（参见 材料表）。
   1. 使用显微镜兼容软件采集图像，该软件允许通过USB数字I / O设备 直接 控制相机，光源和压电陶瓷促动器（参见 材料表）。
      注: 图1 为设置示意图。GCaMP5G的峰值激发波长为470 nm，峰值发射波长为497 nm²⁸。使用适用于GCaMP5G成像的滤光片立方体。
2. 为了刺激膀胱粘膜制剂中的单个尿路上皮细胞（见步骤2），请使用由单通道开环压电控制器控制的压电致动器（见 材料表）。将压电致动器安装在显微操纵器中。
   1. 将玻璃微量移液器安装在固定在压电致动器的移液器支架中（图1）。通过由电生理学数据采集和分析程序控制的模拟/数字转换器远程操作压电控制器（参见 材料表）。
      注意:由成像软件启动的晶体管-晶体管逻辑 （TTL） 信号形式的外部触发器用于触发移动压电致动器的电生理学数据采集和分析软件中的刺激协议（图 1）。
3. 确保成像软件（参见 材料表）与数字I/O设备接口。在 USB 数字 I/O 设备中配置数字输出通道，将 TTL 信号传送到模拟/数字转换器，模拟/数字转换器将在电生理学软件中启动移动压电致动器的协议。
   1. 使用电缆将模拟/数字转换器中的启动 BNC 端口连接到接地 （GND） 和 USB 数字 I/O 设备中的螺丝端子。
4. 在成像软件中设置记录协议。
   注意:以下步骤介绍如何生成将发送TTL信号并以指定时间间隔开始收集图像的协议。
   1. 在成像软件中设置采集方案，方法是单击实验 管理器 并选择 新建实验。将打开一个新窗口。
   2. 选择图标 延时循环 并将其拖动到新打开的窗口中;将周期数设置为 2 ，将间隔设置为设置中允许的最快设置。
   3. 从 透射快门/手动快门 图标 中， 选择 NI USB-6501 图标 并将其拖 到 延时 循环 窗口， 然后将 NI USB-6501 设置为 关闭。将 附加 的 NI USB-6501 从 透射快门/手动快门 拖 到 延时 循环 窗口 中， 并 将其 设为 打开。要连接两个NI USB-6501图标，请拖动NI USB-6501关闭图标侧面的箭头并拉动，直到其触摸NI USB-6501打开图标。将出现连接两个图标的线。
   4. 将另一个 延时摄影循环 拖到 实验管理器 窗口中，然后通过拉动箭头将其连接到第一个时间循环。设置录制参数。将新 延时摄影循环 的周期数设置为 2400。
   5. 从 图像采集 图标中，将 GFP滤镜 拖到最近打开的 延时摄影循环 中，并将曝光时间设置为 100毫秒。
   6. 将相机图像类型设置为 8 位，将分辨率设置为 576 x 576 （合并 4 x 4），将像素时钟设置为 480 MHz，将热像素校正设置为 标准。
      注意:可以根据荧光传感器的表达水平、相机灵敏度和设置配置调整参数。
5. 在电生理学软件中设置实验室工作台（参见 材料表）。
   注意: 这将定义模拟/数字转换器的输出信号（以 mV 为单位）。
   1. 转到电生理学软件中的"配置"菜单，然后选择"实验室工作台"。在生成的输出信号窗口中，选择模拟输出#1，按添加信号，并将其命名（例如，"压电"）。将信号单位设置为 mV，将比例因子 （mV/V） 设置为 1。
6. 按照以下步骤在电生理学软件中生成刺激方案。
   1. 要在电生理学软件中生成新的刺激方案，请转到菜单项 获取 并选择 新方案。
   2. 将 模式/速率 设置为 情节刺激，将 运行/试用设置为 1，将扫描 /运行 设置为 1， 将扫描持续时间 设置为 150。
   3. 在输出菜单中，选择通道#1压电作为模拟输出。
   4. 在"触发器"菜单中，将 触发器 设置为" 数字化仪启动输入 "和 "内部计时器"。
   5. 在"波形"菜单中，选择通道 #1 和"带纪元的模拟波形"。将步骤 A 设置为步骤，将第一级设置为 0，将增量级别设置为 0，将第一个持续时间设置为 10000，将增量持续时间设置为 0。
   6. 将步骤 B 设置为步骤，将第一个级别设置为 10，将增量级别设置为 0，将第一个持续时间设置为 1000，将增量持续时间设置为 0。 将步骤 C 设置为步骤，将第一级设置为 0，将增量级别设置为 0，将第一个持续时间设置为 130000，将增量持续时间设置为 0。
   7. 保存协议并将其命名为 刺激协议。
7. 使用 BNC 电缆将模拟/数字转换器中的 模拟输出 #1 连接到单通道开环压电控制器前面的 EXT 输入 （参见 材料表）。
8. 按照以下步骤制造玻璃微量移液器，用于从毛细管玻璃管机械刺激伞状细胞。
   1. 将毛细管玻璃放入拉拔器中（见 材料表），并用毛细管固定旋钮进行调整。
   2. 将加热器单元置于其全高。将拉拔器的第一个拉动端接位置滑块调整为 5。
   3. 将第一个加热器旋钮设置为 76.7，将第二个旋钮设置为 52.7。
   4. 按开始按钮分两步拉动玻璃毛细管。
   5. 用微锻件（参见 材料表）关闭微量移液器的尖端，加热器调节旋钮设置为60。
      注意:对于本协议，用于戳单个细胞的微量移液器吸头的最终直径为~1-3μm。
9. 验证刺激微量移液器是否移动刺激方案中指定的距离。
   注意:以下步骤是为了确保在电生理学软件中启动刺激方案后12.5秒，产生持续时间为1秒的电压脉冲，使压电致动器移动20μm。
   1. 在支架中安装微量移液器并将其连接到压电致动器。
   2. 将压电致动器和连接的微量移液器平行于显微镜载物台的中心并在视野范围内放置。
   3. 聚焦在移液器的尖端，并用胶带固定压电安装杆（参见 材料表）。在明场照明下，调整相机参数以获得移液器吸头的清晰图像。
   4. 在电生理学软件中打开 刺激协议 并将其设置为播放。
      注意:在收到从成像软件发送的TTL信号之前，电生理学方案不会启动。
   5. 从成像软件的 实验管理器 中，按 开始 启动数据采集。
      注意:这将触发电生理学软件中的协议，该软件将驱动压电致动器。成像软件中的协议将生成一个包含实验图像的文件。
10. 按照以下步骤验证移液器行驶的距离。
    1. 要测量移液器在刺激方案期间行进的距离，请在成像软件中选择计数 和测量 项目。
    2. 从 " 测量"菜单中，选择 "测量和投资回报率 "选项，电影窗口下方将出现一个新窗口。
    3. 从" 度量 "菜单中，选择 "任意线"。
    4. 在影片窗口中，从移液器尖端开始绘制一条任意线。请注意，稍后将调整任意行的末尾。
    5. 右键单击任意行以将该 行 转换为感兴趣区域 （ROI），该区域将在所有电影帧中可见。
    6. 检查视频并将任意线的末端（ROI）调整到移液器响应刺激而行进的最终位置。
       注意:移液器行进的距离（以μm为单位）将显示在 "测量和ROI "窗口中。刺激方案可根据用户需要修改。

2.膀胱黏膜原 位 转导和分离

1. 根据病毒转导方案³¹中描述的程序，用编码CGaMP5G的cDNA的腺病毒原位转导雌性小鼠膀胱。
   1. 当转导尿路上皮细胞进行Ca 2 +成像实验时，向膀胱内滴注含有² x 10⁷ 感染性病毒颗粒（IVP）的50μL溶液。
      注意:这种技术倾向于将CGaMP5G的表达限制在伞状细胞层。或者，可以使用从尿路上皮细胞中表达CGaMP5G的转基因小鼠（即由尿路蛋白-2启动子驱动的GCaMP5G表达）或任何其他感兴趣的细胞类型收获的膀胱进行实验。
2. 转导后24-72小时，通过CO₂ 窒息对小鼠实施安乐死，并通过用剪刀打开胸腔使肺部塌陷来进行开胸术。
3. 用 24 G 导管插入尿道。通过皮肤和肌肉~1.5cm的腹部切口暴露膀胱，并使用6.0缝合线（ 材料表）将导管固定在尿道上。
4. 收获膀胱和尿道³²，并贴在硅橡胶支架垫（见材料表）上，该垫沐浴在含有（mM）的记录溶液中:135 NaCl，5.0 KCl，1 MgCl 2，2.5 CaCl 2，10葡萄糖，10 HEPES，pH 7.4，并用100%O ₂鼓泡（图2A）。
5. 按照先前发表的报告³² （图2B），用细镊子将膀胱粘膜与下面的肌肉层分开。
6. 切开膀胱粘膜并将其固定，尿路上皮面向35毫米直径组织培养皿底部的有机硅弹性体插入物（图2C）。

3. 单个尿路上皮细胞的机械刺激和 Ca²⁺ 成像

1. 将带有固定膀胱粘膜的组织培养皿安装在配备带有电阻加热元件的培养皿培养箱的显微镜载物台中（图2E）。灌注（按照制造商的说明，参见 材料表）细胞培养皿以1.7mL / min的速率连续，记录溶液在~37°C下用在线加热器加热。
2. 使用双通道双极温度控制器模型将组织培养箱和溶液的温度保持在~37°C（参见 材料表）。在进行进一步的实验程序之前，用连续灌注平衡腔室中的组织至少15分钟。
3. 为了记录机械诱导的Ca^{2 +} 瞬变，将微量移液器浸入溶液中，将固定的膀胱粘膜沐浴在组织培养皿中。借助低倍率扫描物镜（4x）使用明场照明将微量移液器移动到视场中心。
   1. 通过在垂直平面上协调移动显微操纵器并调整焦点，将微量移液器移动到尿路上皮组织表面附近。
   2. 将物镜切换到具有更高放大倍率（20倍）的物镜，适用于具有高数值孔径（NA）的免疫荧光。
   3. 将显微操纵器设置为 精细 ，并将微量移液器移动到目标细胞顶部附近。
   4. 将视野更改为相机，然后在成像软件中按 实时 。
      注意:这必须打开反射快门，并允许观察计算机中组织发出的荧光信号。
   5. 调整焦点以可视化细胞顶部，并在必要时调整移液器的位置。
   6. 在电生理学软件中打开 刺激协议 并将其设置为 播放。
      注意:在收到从成像软件发送的TTL信号之前，电生理学软件中的协议不会启动。
   7. 从成像软件的 实验管理器 中，按 开始 启动数据采集。这将触发电生理学软件中的协议，该软件将驱动压电致动器并生成包含实验图像的文件。刺激方案可以根据用户的需要进行修改。

4. 数据分析

1. 按照以下步骤量化随时间推移的荧光强度。
   1. 在成像软件中打开图像文件，然后选择 计数和测量 窗口。选择 多边形 工具并在戳的单元格的边界上绘制 ROI。
   2. 转到"测量"窗口，选择"强度配置文件"，将测量值设置为"随时间推移"，"结果"设置为"平均值"，将"背景减法"设置为"无"，然后按"执行"。平均荧光强度将随时间计算（图3）。
   3. 要导出强度配置文件数据，请单击强度配置文件结果窗口中的 Excel 图标。这将允许用户选择目标文件夹和文件名，并以.xlsx格式保存数据。
2. 使用科学绘图和数据分析软件进行数据分析（见 材料表）。
   注意:戳引起的Ca²⁺ 峰的振幅表示为荧光强度（ΔF / F）的变化，其中F是GCaMP5G在时间0处的荧光强度，ΔF是荧光强度最大值与时间0的基底之间的差异。还可以计算Ca²⁺ 响应的衰减（未显示）。

结果

本协议描述了一种使用荧光Ca 2 +传感器^GCaMP5G评估伞形细胞中机械诱发的Ca^{2 +}瞬变的技术。腺病毒转导用于在尿路上皮细胞中表达GCaMP5G，因为它的效率高，并且产生更高的表达水平。来自转导膀胱的染色冷冻切片的荧光图像如图2D所示。对于这些实验，GCaMP5G在伞细胞层中的表达最高。在戳伞细胞的实验中捕获的一系列代表性图像如图3A所...

讨论

所有生物体，似乎大多数细胞类型，都表达响应机械刺激的离子通道²⁰，³³，34，^35，36，37。这些机械激活通道的功能主要通过膜片钳技术进行评估。然而，由于可及性问题，机械激活离子通道的膜片钳研究在很大程度上仅限于解离的细胞和细胞系。...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
20x Objective	Olympus	UMPlanFL N
24 G ¾” catheter	Medline	Suresite IV slide
4x Objective	Olympus	UPlanFL N
Analog/digital converter	Molecular Devices	Digidata 1440A
Anti-GFP antibody	Abcam	Ab6556
Beam splitter	Chroma	T495lpxr
Bipolar temperature controller	Warner Instruments	TC-344B
CaCl2	Fluka	21114-1L	1 M solution
cellSens software	Olympus		Imaging software
CMOS camera	Hamamatsu	ORCA fusion
Donkey anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 488	Jackson ImmunoResearch	711-545-152
Excel	Microsoft Corporation
Filter	Chroma	ET470/40X
Glass capillaries Corning 8250 glass	Warner Instruments	G85150T-4
Glucose	Sigma	G8270
HEPES	Sigma	H4034
Inline heater	Warner Instruments	SH-27B
KCl	Sigma	793590
Light source	Sutter Instruments	Lambda XL
Manifold pump tubing	Fisherbrand	14-190-510	ID 1.52 mm
Manifold pump tubing	Fisherbrand	14-190-533	ID 2.79 mm
MgCl2	Sigma	M9272
Mice	Jackson Lab	664	2-4 months old female C57BL/6J
Microforge	Narishige	MF-830
Micromanipulator	Sutter Instruments	MP-285
Microscope	Olympus	BX51W
Mounting media with DAPI	Invitrogen	S36964	Slowfade Diamond Antifade with DAPI
NaCl	Sigma	S7653
pClamp software	Molecular Devices	Version 10.4	Patch-clamp electrophysiology data acquisition and analysis software
Peristaltic pump	Gilson	Minipuls 3
Piezoelectric actuator	Thorlabs	PAS005
Pipette holder	World Precision Instruments
Pipette puller	Narishige	PP-830
Quick exchange heated base with perfusion and adapter ring kit	Warner Instruments	QE-1	Quick exchange platform fits 35 mm dish
Rhodamine-phalloidin	Invitrogen	R415
Sigma-Plot	Systat Software Inc	Version 14.0	Scientific graphing and data analysis software
Silicone elastomer	Dow	Sylgard 184
Single channel open-loop piezo controller	Thorlabs	MDT694B
Square grid holder pad	Ted Pella	10520
Suture	AD Surgical	S-S618R13	6-0 Sylk
Teflon mounting rod	Custom made		Use to mount the piezoelectric actuator in the micromanipulator
Tubing	Fisher Scientific	14171129	Tygon S3 ID 1/16 IN, OD 1/8 IN
USB Digital I/O device	National Instruments	NI USB-6501