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  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este protocolo describe una metodología para evaluar la función de los canales iónicos activados mecánicamente en células uroteliales nativas utilizando el sensor fluorescente de Ca2+ GCaMP5G.

Resumen

Los canales iónicos activados mecánicamente son transductores biológicos que convierten estímulos mecánicos como las fuerzas de estiramiento o cizallamiento en señales eléctricas y bioquímicas. En los mamíferos, los canales activados mecánicamente son esenciales para la detección de estímulos externos e internos en procesos tan diversos como la sensación táctil, la audición, la regulación del volumen de glóbulos rojos, la regulación de la presión arterial basal y la sensación de plenitud de la vejiga urinaria. Si bien la función de los canales iónicos activados mecánicamente se ha estudiado ampliamente en el entorno in vitro utilizando la técnica patch-clamp, evaluar su función en su entorno nativo sigue siendo una tarea difícil, a menudo debido al acceso limitado a los sitios de expresión de estos canales (por ejemplo, terminales aferentes, células de Merkel, barorreceptores y túbulos renales) o dificultades para aplicar la técnica patch-clamp (p. ej., las superficies apicales de las células paraguas uroteliales). Este protocolo describe un procedimiento para evaluar transitorios de Ca 2+ evocados mecánicamente utilizando el sensor fluorescente GCaMP5G en una preparación urotelial ex vivo, una técnica que podría adaptarse fácilmente para el estudio de eventos de Ca2+ evocados mecánicamente en otras preparaciones de tejidos nativos.

Introducción

Las células epiteliales en el tracto urinario están sujetas a fuerzas mecánicas a medida que el filtrado urinario viaja a través de las nefronas, y la orina se bombea fuera de la pelvis renal y viaja a través de los uréteres para almacenarse en la vejiga urinaria. Se ha reconocido desde hace mucho tiempo que las fuerzas mecánicas (por ejemplo, esfuerzo cortante y estiramiento) ejercidas por los fluidos sobre las células epiteliales que recubren el tracto urinario regulan la reabsorción de proteínas en el túbulo proximal y de solutos en la nefrona distal 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13, así como el almacenamiento de orina en la vejiga urinaria y micción14,15,16,17.

La conversión de estímulos mecánicos en señales eléctricas y bioquímicas, proceso denominado mecanotransducción, está mediada por proteínas que responden a la deformación de las estructuras celulares o de la matriz extracelular asociada 18,19,20,21. Los canales iónicos activados mecánicamente son únicos en el sentido de que pasan de un estado cerrado a un estado permeable abierto en respuesta a cambios en la tensión de la membrana, la presión o el esfuerzo cortante 18,19,20,21,22. Además, los transitorios de Ca 2+ pueden iniciarse por mecanotransducción mediada por integrina o por activación de sistemas de adhesión mecanosensibles en las uniones célula-célula23,24,25,26. La función del canal iónico generalmente se evalúa con la técnica patch-clamp, que implica la formación de un sello gigaohm entre la membrana celular y la pipeta del parche27. Sin embargo, las células ubicadas en capas de tejido profundo con una matriz extracelular densa (por ejemplo, túbulos renales) o rodeadas por una barrera física (por ejemplo, glicocalix) son difíciles de acceder con una micropipeta de vidrio. Del mismo modo, las células incrustadas o que son partes integrales de tejidos con poca estabilidad mecánica (por ejemplo, el urotelio) no se pueden estudiar fácilmente con la técnica de parche-pinza. Debido a que muchos canales iónicos activados mecánicamente son permeables al Ca 2+, un enfoque alternativo es evaluar su actividad mediante microscopía fluorescente utilizando un colorante sensible al Ca2+ o indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI) como GCaMP. Los esfuerzos recientes en ingeniería de proteínas han aumentado significativamente el rango dinámico, la sensibilidad y la respuesta de los GECI28,29,30, y los avances en genética han permitido su expresión en poblaciones celulares específicas, lo que las hace ideales para estudiar la mecanotransducción.

El urotelio, el epitelio estratificado que cubre el interior de la vejiga urinaria, funciona como una barrera, evitando la difusión de solutos urinarios en el intersticio de la vejiga, pero también funciona como un transductor, detectando la plenitud de la vejiga y comunicando estos eventos a los nervios y la musculatura subyacentes16. Estudios previos han demostrado que la comunicación entre el urotelio y los tejidos subyacentes requiere los canales iónicos activados mecánicamente Piezo1 y Piezo231. Para evaluar los transitorios de Ca 2+ inducidos mecánicamente en células uroteliales, se desarrolló una nueva técnica descrita que utiliza la transferencia de genes adenovirales para expresar el sensor de Ca2+ GCaMP5G en células uroteliales. Esta técnica emplea una preparación de lámina mucosa que proporciona un fácil acceso a la capa celular paraguas más externa y un sistema asistido por computadora para la estimulación mecánica simultánea de células individuales con una micropipeta de vidrio cerrada y el registro de los cambios en la fluorescencia a lo largo del tiempo.

Protocolo

El cuidado y manejo de los animales se llevó a cabo de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pittsburgh. Para el presente estudio se utilizaron ratones hembra C57Bl/6J de 2-4 meses de edad. Los ratones se obtuvieron comercialmente (ver Tabla de Materiales).

1. Montaje y configuración del equipo

  1. Realice imágenes de Ca2+ con un microscopio vertical equipado con una cámara de alta resolución y una fuente de luz estable (consulte la Tabla de materiales).
    1. Adquiera las imágenes con un software compatible con microscopio que permite el control directo de la cámara, la fuente de luz y el actuador piezoeléctrico a través de un dispositivo de E/S digital USB (consulte la Tabla de materiales).
      NOTA: La figura 1 representa un esquema de la configuración. GCaMP5G tiene una longitud de onda de excitación máxima de 470 nm y una longitud de onda de emisión máxima de 497 nm28. Utilice un cubo de filtro adecuado para imágenes GCaMP5G.
  2. Para la estimulación de células uroteliales individuales en la preparación de la mucosa de la vejiga (ver paso 2), utilice un actuador piezoeléctrico controlado por un controlador piezoeléctrico de bucle abierto de un solo canal (ver Tabla de materiales). Monte el actuador piezoeléctrico en un micromanipulador.
    1. Monte las micropipetas de vidrio en un soporte de pipeta fijado al actuador piezoeléctrico (figura 1). Opere remotamente el controlador piezoeléctrico mediante un convertidor analógico/digital controlado por un programa de adquisición y análisis de datos electrofisiológicos (consulte la Tabla de materiales).
      NOTA: Se utiliza un disparador externo, en forma de una señal lógica transistor-transistor (TTL) iniciada por el software de imágenes, para activar el protocolo de estimulación en el software de adquisición y análisis de datos de electrofisiología que mueve el actuador piezoeléctrico (Figura 1).
  3. Asegúrese de que el software de imágenes (consulte Tabla de materiales) interactúe con el dispositivo de E/S digital. Configure un canal de salida digital en el dispositivo de E/S digital USB para entregar la señal TTL al convertidor analógico/digital, que iniciará el protocolo en el software de electrofisiología que mueve el actuador piezoeléctrico.
    1. Utilice un cable para conectar el puerto Start BNC del convertidor analógico/digital a tierra (GND) y un terminal de tornillo en el dispositivo de E/S digital USB.
  4. Configure el protocolo de grabación en el software de imágenes.
    NOTA: Los pasos siguientes describen cómo generar un protocolo que enviará una señal TTL y comenzará a recopilar imágenes en intervalos de tiempo especificados.
    1. Configure el protocolo de adquisición en el software de imágenes haciendo clic en el Administrador de experimentos y seleccionando Nuevo experimento. Se abrirá una nueva ventana.
    2. Seleccione el icono Time Lapse Loop y arrástrelo a la ventana recién abierta; Establezca el número de ciclos en 2 y el intervalo en el ajuste más rápido permitido en la configuración.
    3. Desde el icono Obturador transmitido/Obturador manual, seleccione el icono NI USB-6501 y arrástrelo a la ventana Bucle de lapso de tiempo, y luego configure el NI USB-6501 como cerrado. Arrastre un NI USB-6501 adicional desde el obturador transmitido/obturador manual a la ventana de bucle de lapso de tiempo y configúrelo como abierto. Para conectar los dos íconos de NI USB-6501, arrastre la punta de flecha en el costado del ícono cerrado de NI USB-6501 y tire hasta que toque el ícono abierto de NI USB-6501. Aparecerá una línea que conecta ambos iconos.
    4. Arrastre otro bucle de lapso de tiempo a la ventana del Administrador de experimentos y conéctelo al primero tirando de la punta de flecha. Establezca los parámetros para la grabación. Establezca el número de ciclos del nuevo bucle de lapso de tiempo en 2400.
    5. Desde el icono Adquisición de imágenes , arrastre el filtro GFP al bucle de lapso de tiempo abierto recientemente y establezca el tiempo de exposición en 100 ms.
    6. Establezca el tipo de imagen de la cámara en 8 bits, la resolución en 576 x 576 (Binning 4 x 4), el reloj de píxeles en 480 MHz y la corrección de píxeles en caliente en estándar.
      NOTA: Los parámetros se pueden ajustar según el nivel de expresión del sensor fluorescente, la sensibilidad de la cámara y la configuración de configuración.
  5. Configure el banco de laboratorio en el software de electrofisiología (consulte la Tabla de materiales).
    NOTA: Esto definirá la señal de salida en mV del convertidor analógico/digital.
    1. Vaya al menú Configurar en el software de electrofisiología y seleccione Lab Bench. En la ventana Señales de salida resultante, seleccione Analog Out #1, presione Agregar señal y asígnele el nombre (por ejemplo, "Piezo"). Ajuste la unidad de señal a mV y el factor de escala (mV/V) a 1.
  6. Genere un protocolo de estimulación en el software de electrofisiología siguiendo los pasos a continuación.
    1. Para generar un nuevo protocolo de estimulación en el software de electrofisiología, vaya al elemento de menú Adquirir y seleccione Nuevo protocolo.
    2. Establezca el modo/velocidad en estimulación episódica, correr/ probar en 1, barrir/correr a 1 y duración (s) de barrido (s) a 150.
    3. En el menú Salidas , seleccione el canal #1 Piezo como Salida analógica.
    4. En el menú Trigger, establezca el trigger (Entrada de inicio del digitalizador) y Internal Timer (Disparador interno).
    5. En el menú Forma de onda, seleccione el canal #1 y Forma de onda analógica con épocas. Establezca el paso A en Paso, Primer nivel en 0, Nivel Delta en 0, Primera duración en 10000 y Duración Delta en 0.
    6. Establezca el paso B en Paso, el primer nivel en 10, el nivel Delta en 0, la primera duración en 1000 y la duración delta en 0. Establezca el paso C en Paso, Primer nivel en 0, Nivel Delta en 0, Primera duración en 130000 y Duración delta en 0.
    7. Guarde el protocolo y asígnele el nombre Protocolo de estimulación.
  7. Utilice un cable BNC para conectar la salida analógica #1 en el convertidor analógico/digital a la ENTRADA EXT en la parte frontal del controlador piezoeléctrico de bucle abierto de un solo canal (consulte la Tabla de materiales).
  8. Fabricar micropipetas de vidrio para la estimulación mecánica de células paraguas a partir de tubos de vidrio capilar siguiendo los pasos a continuación.
    1. Coloque el vidrio capilar en un extractor (consulte Tabla de materiales) y ajústelo con las perillas de retención capilares.
    2. Coloque la unidad del calefactor a su altura máxima. Ajuste el primer control deslizante de posición de terminación de tracción del tirador a 5.
    3. Ajuste la primera perilla del calentador a 76.7 y la segunda perilla a 52.7.
    4. Tire del capilar de vidrio en dos pasos presionando el botón de inicio.
    5. Cierre la punta de la micropipeta con una microforja (consulte la Tabla de materiales) con la perilla de ajuste del calentador ajustada a 60.
      NOTA: Para el presente protocolo, el diámetro final de la punta de micropipeta utilizada para pinchar células individuales es ~1-3 μm.
  9. Compruebe que la micropipeta estimulante se mueve la distancia especificada en el protocolo de estimulación.
    NOTA: Los siguientes pasos son para asegurarse de que 12,5 s después de iniciar el protocolo de estimulación en el software de electrofisiología, se genere un pulso de voltaje con una duración de 1 s, haciendo que el actuador piezoeléctrico se mueva 20 μm.
    1. Monte una micropipeta en el soporte y conéctela al actuador piezoeléctrico.
    2. Coloque el actuador piezoeléctrico y la micropipeta conectada paralelos al centro de la platina del microscopio y dentro del área de visión.
    3. Concéntrese en la punta de la pipeta e inmovilice la varilla de montaje piezoeléctrica (consulte la Tabla de materiales) con cinta adhesiva. Bajo iluminación de campo brillante, ajuste los parámetros de la cámara para obtener una imagen clara de la punta de la pipeta.
    4. Abra el protocolo de estimulación en el software de electrofisiología y configúrelo para que se reproduzca.
      NOTA: El protocolo de electrofisiología no se iniciará hasta que se reciba la señal TTL enviada desde el software de imágenes.
    5. Desde Experiment Manager en el software de imágenes, presione Inicio para iniciar la adquisición de datos.
      NOTA: Esto activará el protocolo en el software de electrofisiología, que impulsará el actuador piezoeléctrico. El protocolo en el software de imágenes generará un archivo con las imágenes del experimento.
  10. Verifique la distancia recorrida por la pipeta siguiendo los pasos a continuación.
    1. Para medir la distancia recorrida por la pipeta durante el protocolo de estimulación, seleccione el elemento Contar y medir en el software de imágenes.
    2. En el menú Medir , seleccione la opción Medición y ROI, y aparecerá una nueva ventana debajo de la ventana de la película.
    3. En el menú Medir , elija la línea arbitraria.
    4. En la ventana de película, dibuje una línea arbitraria que comience en la punta de la pipeta. Tenga en cuenta que el final de la línea arbitraria se ajustará más adelante.
    5. Haga clic con el botón derecho en la línea arbitraria para convertir la línea en una región de interés (ROI), que será visible en todos los fotogramas de la película.
    6. Inspeccione la película y ajuste el final de la línea arbitraria (ROI) a la posición final recorrida por la pipeta en respuesta al estímulo.
      NOTA: La distancia recorrida por la pipeta en μm aparecerá en la ventana Medición y ROI . El protocolo de estimulación se puede modificar según las necesidades del usuario.

2. Transducción in situ y aislamiento de la mucosa vesical

  1. Transducir vejigas de ratón hembra in situ con un adenovirus que codifica el ADNc de CGaMP5G según el procedimiento descrito en el protocolo de transducción del virus31.
    1. Al transducir células uroteliales para experimentos de imágenes de Ca2+ , instilar las vejigas con 50 μL de la solución que contiene 2 x 107 partículas virales infecciosas (PIV).
      NOTA: Esta técnica tiende a restringir la expresión de CGaMP5G a la capa de células paraguas. Alternativamente, se podrían realizar experimentos con vejigas urinarias cosechadas de ratones transgénicos que expresan CGaMP5G en células uroteliales (es decir, expresión de GCaMP5G impulsada por un promotor de uroplacina-2) o cualquier otro tipo de célula de interés.
  2. 24-72 h después de la transducción, sacrificar a los ratones por asfixia deCO2 y realizar una toracotomía abriendo la cavidad torácica con tijeras para hacer colapsar los pulmones.
  3. Anular la uretra con un catéter de 24 G. Exponga la vejiga mediante una incisión abdominal de ~1.5 cm a través de la piel y el músculo, y use una sutura de 6.0 (consulte la Tabla de materiales) para asegurar el catéter a la uretra.
  4. Recolectar la vejiga y la uretra32 y fijarlas a una almohadilla de soporte de goma de silicona (ver Tabla de materiales) bañada en solución de registro que contiene (en mM): 135 NaCl, 5.0 KCl, 1 MgCl 2, 2.5 CaCl 2, 10 glucosa, 10 HEPES, pH 7.4, y burbujear con 100% O 2 (Figura 2A).
  5. Separar la mucosa vesical de la capa muscular subyacente con fórceps finos siguiendo informes publicados previamente32 (Figura 2B).
  6. Corte la mucosa de la vejiga y fíjela hacia abajo con el urotelio hacia arriba hasta un inserto de elastómero de silicona en el fondo de un plato cultivado de tejido de 35 mm de diámetro (Figura 2C).

3. Estimulación mecánica de células uroteliales individuales e imágenes de Ca2+

  1. Monte la placa de cultivo de tejido con la mucosa de la vejiga fijada en la etapa de microscopio equipada con una incubadora de placa de cultivo con elementos calefactores resistivos (Figura 2E). Perfundir (siguiendo las instrucciones del fabricante, ver Tabla de materiales) la placa de cultivo celular continuamente a una velocidad de 1,7 ml/min con solución de grabación calentada a ~37 °C con un calentador en línea.
  2. Mantenga la temperatura de la incubadora de platos de tejido y las soluciones a ~ 37 ° C con un modelo de controlador de temperatura bipolar de doble canal (consulte la Tabla de materiales). Equilibrar el tejido en la cámara con perfusión continua durante al menos 15 minutos antes de realizar más procedimientos experimentales.
  3. Para registrar transitorios de Ca2+ inducidos mecánicamente, sumerja la micropipeta en la solución bañando la mucosa de la vejiga fijada en la placa de tejido. Mueva la micropipeta al centro del campo con la ayuda de un objetivo de escaneo de bajo aumento (4x) utilizando iluminación de campo brillante.
    1. Mueva la micropipeta cerca de la superficie del tejido urotelial moviendo coordinadamente el micromanipulador en el plano vertical y ajustando el enfoque.
    2. Cambie el objetivo a uno con un aumento más alto (20x) adecuado para inmunofluorescencia con una apertura numérica alta (NA).
    3. Coloque el micromanipulador en Fino y mueva la micropipeta cerca de la parte superior de la celda objetivo.
    4. Cambie el campo de visión a la cámara y pulse Live en el software de imágenes.
      NOTA: Esto debe encender el obturador reflejado y permitir la observación de la señal fluorescente que emite el tejido en la computadora.
    5. Ajuste el enfoque para visualizar la parte superior de la celda y ajuste la posición de la pipeta si es necesario.
    6. Abra el protocolo de estimulación en el software de electrofisiología y configúrelo para que se reproduzca.
      NOTA: El protocolo en el software de electrofisiología no se iniciará hasta que se reciba la señal TTL enviada desde el software de imágenes.
    7. Desde Experiment Manager en el software de imágenes, presione Inicio para iniciar la adquisición de datos. Esto activará el protocolo en el software de electrofisiología, que impulsará el actuador piezoeléctrico y generará un archivo con las imágenes del experimento. El protocolo de estimulación se puede modificar según las necesidades del usuario.

4. Análisis de datos

  1. Cuantifique la intensidad de fluorescencia a lo largo del tiempo siguiendo los pasos a continuación.
    1. Abra el archivo de imagen en el software de imágenes y seleccione la ventana Contar y medir . Seleccione la herramienta polígono y dibuje un ROI en los límites de la celda que se pinchó.
    2. Vaya a la ventana Medida, seleccione Perfil de intensidad, establezca la medida en A lo largo del tiempo, Resultados en promedio, Resta de fondo en ninguno y, a continuación, presione Ejecutar. La intensidad media de fluorescencia se calculará a lo largo del tiempo (Figura 3).
    3. Para exportar los datos del perfil de intensidad, haga clic en el icono de Excel en la ventana Resultados del perfil de intensidad. Esto permitirá al usuario elegir la carpeta de destino y el nombre del archivo y guardar los datos en un formato .xlsx.
  2. Realice análisis de datos utilizando gráficos científicos y software de análisis de datos (consulte la Tabla de materiales).
    NOTA: La amplitud del pico de Ca2+ evocado por el pinchazo se expresa como el cambio en la intensidad de fluorescencia (ΔF / F), donde F es la intensidad de fluorescencia de GCaMP5G en el momento 0, y ΔF es la diferencia entre los máximos de intensidad de fluorescencia y los basales en el tiempo 0. La disminución de la respuesta de Ca2+ también se puede calcular (no se muestra).

Resultados

El presente protocolo describe una técnica para evaluar transitorios de Ca 2+ evocados mecánicamente en células paraguas utilizando el sensor fluorescente de Ca2+ GCaMP5G. La transducción adenoviral se empleó para expresar GCaMP5G en células uroteliales debido a su alta eficiencia y porque produce un elevado nivel de expresión. Las imágenes fluorescentes de criosecciones teñidas de una vejiga transducida se muestran en la Figura 2D. Para estos experimentos, la ...

Discusión

Todos los organismos, y aparentemente la mayoría de los tipos de células, expresan canales iónicos que responden a estímulos mecánicos 20,33,34,35,36,37. La función de estos canales activados mecánicamente se ha evaluado predominantemente con la técnica patch-clamp. Sin embargo, debido a problemas de accesibilidad, lo...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH R01DK119183 (a G.A. y M.D.C.) y S10OD028596 (a G.A.) y por los Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores del Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
20x ObjectiveOlympusUMPlanFL N
24 G ¾” catheterMedline Suresite IV slide 
4x ObjectiveOlympusUPlanFL N
Analog/digital converterMolecular DevicesDigidata 1440A
Anti-GFP antibodyAbcam Ab6556
Beam splitterChromaT495lpxr
Bipolar temperature controller Warner InstrumentsTC-344B
CaCl2Fluka21114-1L1 M solution
cellSens softwareOlympusImaging software
CMOS cameraHamamatsuORCA fusion
Donkey anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 488 Jackson ImmunoResearch711-545-152
ExcelMicrosoft Corporation
Filter Chroma ET470/40X
Glass capillaries Corning 8250 glassWarner Instruments G85150T-4
GlucoseSigmaG8270
HEPES SigmaH4034
Inline heater Warner InstrumentsSH-27B
KClSigma793590
Light sourceSutter InstrumentsLambda XL 
Manifold pump tubingFisherbrand14-190-510ID 1.52 mm
Manifold pump tubingFisherbrand14-190-533ID 2.79 mm
MgCl2SigmaM9272
Mice Jackson Lab6642-4 months old female C57BL/6J
MicroforgeNarishige MF-830
MicromanipulatorSutter InstrumentsMP-285
MicroscopeOlympusBX51W
Mounting media with DAPIInvitrogenS36964 Slowfade Diamond Antifade with DAPI
NaCl SigmaS7653
pClamp softwareMolecular DevicesVersion 10.4Patch-clamp electrophysiology data acquisition and analysis software
Peristaltic pumpGilsonMinipuls 3
Piezoelectric actuatorThorlabsPAS005
Pipette holderWorld Precision Instruments
Pipette pullerNarishigePP-830
Quick exchange heated base with perfusion and adapter ring kitWarner InstrumentsQE-1Quick exchange platform fits 35 mm dish  
Rhodamine-phalloidin InvitrogenR415
Sigma-PlotSystat Software IncVersion 14.0Scientific graphing and data analysis software  
Silicone elastomerDowSylgard 184
Single channel open-loop piezo controllerThorlabsMDT694B
Square grid holder padTed Pella10520
SutureAD SurgicalS-S618R136-0 Sylk
Teflon mounting rodCustom madeUse to mount the piezoelectric actuator in the micromanipulator
TubingFisher Scientific14171129Tygon S3 ID 1/16 IN, OD 1/8 IN
USB Digital I/O device National InstrumentsNI USB-6501

Referencias

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