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摘要

此处提交的协议解释了从研究宿主-病原体相互作用的RNA测序转录组数据中预测和功能表征circRNA所需的完整 计算机 管道。

摘要

环状RNA（circRNA）是一类通过反向剪接 形成的 非编码RNA。这些circRNA主要因其作为各种生物过程的调节剂的作用而被研究。值得注意的是，新出现的证据表明，宿主circRNA在感染病原体（例如流感和冠状病毒）时可以差异表达（DE），这表明circRNA在调节宿主先天免疫反应方面发挥作用。然而，关于 circRNA 在致病性感染中的作用的研究受到进行必要的生物信息学分析以从 RNA 测序 （RNA-seq） 数据中识别 DE circRNA 所需的知识和技能的限制。在任何验证之前，circRNA的生物信息学预测和鉴定至关重要，并且使用昂贵且耗时的湿实验室技术进行功能研究。为了解决这个问题，本文提供了使用RNA-seq数据对circRNA进行 计算机 预测和表征的分步方案。该协议可分为四个步骤:1）通过CIRIquant管道 预测 和定量DE circRNA;2）通过circBase 进行 注释和DE circRNA的表征;3）通过Circr流水线预测CircRNA-miRNA相互作用;4）使用基因本体（GO）和京都基因和基因组百科全书（KEGG）对circRNA亲本基因进行功能富集分析。该管道将有助于推动未来的 体外 和 体内 研究，以进一步揭示circRNA在宿主 - 病原体相互作用中的作用。

引言

宿主-病原体相互作用代表了病原体和宿主生物之间的复杂相互作用，它触发了宿主的先天免疫反应，最终导致入侵病原体的去除1，2。在致病性感染期间，许多宿主免疫基因受到调节以抑制病原体的复制和释放。例如，对致病性感染进行调节的常见干扰素刺激基因（ISG）包括ADAR1，IFIT1，IFIT2，IFIT3，ISG20，RIG-I和OASL3，4。除了蛋白质编码基因外，研究还报告说，非编码RNA，如长非编码RNA（lncRNA），microRNA（miRNA）和环状RNA（circRNA）也在致病性感染期间发挥作用并同时受到调节5，6，7。与主要将蛋白质编码为功能分子的蛋白质编码基因相反，已知非编码RNA（ncRNA）在转录和转录后水平上充当基因的调节因子。然而，与蛋白质编码基因相比，涉及非编码RNA（特别是circRNA）参与调节宿主免疫基因的研究并没有很好的报道。

CircRNA的广泛特征是其共价闭合的连续环结构，该结构是通过称为反向剪接8的非规范剪接过程产生的。与同源线性RNA的剪接过程不同，反向剪接过程涉及下游供体位点与上游受体位点的连接，形成圆形结构。目前，已经提出了三种不同的circRNA生物发生的反向剪接机制。这些是RNA结合蛋白（RBP）介导的环化9，10，内含子配对驱动的环化11和lariat驱动的环化12，13，14。鉴于circRNA以环状结构端到端连接，它们往往对正常的核酸外切酶消化具有天然抵抗力，因此被认为比线性对应物更稳定15。circRNA表现出的另一个共同特征包括宿主16中的细胞或组织类型特异性表达。

正如其独特的结构和细胞或组织特异性表达所暗示的那样，circRNA已被发现在细胞中发挥重要的生物学功能。迄今为止，circRNA的突出功能之一是它们作为microRNA（miRNA）海绵的作用17，18。circRNA的这种调节作用是通过circRNA核苷酸与miRNA种子区域的互补结合而发生的。这种circRNA-miRNA相互作用抑制了miRNA对靶mRNA的正常调节功能，从而调节基因19，20的表达。此外，circRNA还已知通过与RNA结合蛋白（RBP）相互作用并形成RNA-蛋白质复合物来调节基因表达21。虽然circRNA被归类为非编码RNA，但也有证据表明circRNA可以作为蛋白质翻译的模板22，23，24。

最近，circRNA已被证明在调节宿主 - 病原体相互作用中起着关键作用，特别是在宿主和病毒之间。通常，宿主circRNA被认为有助于调节宿主的免疫反应以消除入侵的病原体。促进宿主免疫反应的circRNA的一个例子是circRNA_0082633，由Guo等人报道25。这种circRNA增强了A549细胞内的I型干扰素（IFN）信号传导，有助于抑制流感病毒复制25。此外，Qu等人还报道了一种名为circRNA AIVR的人内含子circRNA，它通过调节CREB结合蛋白（CREBBP）的表达来促进免疫，CREBBP是IFN-β26，27的信号换能器。然而，已知在感染时促进疾病发病机制的circRNA也存在。例如，Yu等人最近报道了从含有2A基因的GATA锌指结构域剪接而成的circRNA通过抑制宿主细胞自噬28在促进H1N1病毒复制中所起的作用。

为了有效地研究circRNA，通常实施全基因组circRNA预测算法，然后在进行任何功能研究之前对预测的circRNA候选物进行 计算机 表征。这种预测和表征circRNA的生物信息学方法成本更低，时间效率更高。它有助于完善要进行功能研究的候选者的数量，并可能导致新的发现。在这里，我们提供了一个详细的基于生物信息学的协议，用于宿主 - 病原体相互作用过程中circRNA 的计算机鉴定， 表征和功能注释。该协议包括从RNA测序数据集中鉴定和定量circRNA，通过circBase 进行 注释，以及根据circRNA类型，重叠基因的数量和预测的circRNA-miRNA相互作用来表征circRNA候选者。本研究还通过基因本体（GO）和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析提供了circRNA亲本基因的功能注释。

研究方案

在该协议中，从基因表达综合（GEO）数据库中下载并使用由甲型流感病毒感染的人巨噬细胞制备的去识别核糖体RNA（rRNA）耗尽RNA-seq库数据集。 图1总结了从circRNA的预测到功能表征的整个生物信息学管道。以下各节将进一步解释管道的每个部分。

1. 数据分析前的准备、下载和设置

注意:本研究中使用的所有软件包都是免费和开源的。

  1. 在 Linux 平台上下载所需的工具
    1. 按照开发人员提供的说明，在 Linux 高性能计算机上下载并安装 材料表中 列出的所需软件和工具。
      注意:大多数工具和软件都有自己的在线 GitHub 页面或文档，其中包含有关安装和使用其工具的说明（请参阅 材料表）。
    2. 从序列存档网站（例如，欧洲核苷酸存档和基因表达综合）下载所需的 RNA-seq 数据集，用于 circRNA 检测和分析。
    3. 下载参考基因组（FASTA格式）和注释文件（GTF/GFF3格式），与制备RNA-seq数据集的宿主兼容。宿主参考基因组和注释文件通常位于在线基因组浏览器上，例如国家生物技术信息中心（NCBI），加州大学圣克鲁斯分校（UCSC）和Ensembl网站。
  2. 核糖核酸序列的质量检查
    1. 将 FASTQ 文件输入 FASTQC 程序以确定 RNA 序列的质量。如果 FASTQ 文件的质量较低（例如，29，30 等工具进行进一步修整。

2. 利用CIRIquant对circRNA进行预测和差异表达分析

注意:有关安装和执行差异表达分析的更详细手册，请参见CIRIquant论文31的代码可用性部分。补充数据还包括此协议中使用的一些基本命令。

  1. 环核糖核酸预测
    1. 首先使用BWA和HISAT2对准器索引宿主的参考基因组。然后，在 Linux 终端上，在主机参考基因组的目录中执行命令 bwa index 32 和 hisat2-build33 以对其进行索引。
    2. 接下来，准备一个 YML 配置文件，其中包含文件名、工具路径（BWA、HISAT2、stringtie34、samtools35）、下载的参考文件的路径（宿主的参考基因组 FASTA 文件、注释文件）以及步骤 2.1.1 中索引文件的路径。
    3. 使用默认或手动参数从终端执行 CIRIquant 工具。用户可以在执行 CIRIquant 工具时指定 RNA-seq 数据的文库类型（链或非链）。
      注意:RNA-seq数据的文库类型可以通过了解所用文库制备试剂盒的类型来确定。如果文库制备试剂盒的身份未知，则可以使用称为RSeQC36 的RNA-seq对照生物信息学包来确定RNA-seq数据的链状。
  2. 差异表达分析
    注意:CIRIquant 软件包包括 prep_CIRIquant、 prepDE.py 和 CIRI_DE_replicate;因此，这三个工具不需要其他下载。
    1. 准备一个文本文件 （.lst），其中包含包含以下内容的数据列表:
      第 1 列:步骤 2.1.3 中使用的 RNA-seq 数据的 ID
      第 2 列:CIRIquant 输出的 GTF 文件的路径
      第 3 列:RNA-seq 数据的分组，无论是对照组还是处理组。
    2. 有关示例，请参阅下面的 表 1 。
      注意:没有必要放入标题，因为它们仅供参考。
    3. 在 Linux 终端上，使用步骤 2.2.1 中准备的文本文件 （.lst） 作为输入运行 prep_CIRIquant 。运行将生成文件列表: library_info.csv、 circRNA_info.csv、 circRNA_bsj.csv和 circRNA_ratio.csv。
    4. 准备第二个文本文件，其中包含包含RNA-seq ID及其各自StringTie输出路径的数据列表。文件布局必须类似于步骤 2.2.1 中的文本文件，不带分组列。
    5. 使用步骤 2.2.4 中准备的文本文件作为输入运行 prepDE.py 以生成基因计数矩阵文件。
    6. 使用步骤 2.2.3 中的library_info.csv和circRNA_bsj.csv文件以及步骤 2.2.5 中的gene_count_matrix.csv文件作为输入执行CIRI_DE_replicate，以输出最终的 circRNA_de.tsv 文件。
  3. DE 环核糖核酸的过滤
    1. 使用R（在计算机终端或RStudio中）或任何电子表格软件（例如，Microsoft Excel）打开从步骤2.2.6生成的 circRNA_de.tsv 文件，以过滤和确定差异表达（DE）circRNA的数量。
    2. 根据标准过滤DE circRNA > |2|罗斯福<0.05。
    3. 创建一个名为 DE_circRNAs.txt 的文件来存储 DE circRNA 的信息。

3. 预测DE circRNA的表征和注释

  1. DE circRNA 的注释状态
    1. 在RStudio中加载名为 DE_circRNAs.txt 的文件，该文件由从步骤2.3.3过滤的DE circRNA列表组成。包括其他信息，例如基因组位置（Chr，开始，结束），链方向（+或-），基因名称和circRNA类型。在继续之前，通过减去 1 个碱基对将 circRNA 基因组起始坐标从 CIRIquant 转换为 0-基。
      注意:上述其他信息可以从 CIRIquant 输出的 GTF 文件（补充文件 1）中获得。
    2. 通过下载包含 circRNA 数据库（例如 circBase）沉积的 circRNA 的基因组位置的文库来确定预测的 DE circRNA 的注释状态。
      注意:在进行比较之前，请确保用于预测circRNA的基因组版本与circRNA数据库库相同。此处使用的circBase数据文件可在Github（https://github.com/bicciatolab/Circr）37中提供的驱动器文件夹中免费获得。
    3. 准备好步骤 3.1.1 和步骤 3.1.2 中的文件后，运行 补充文件 1 中给出的 R 脚本。DE circRNA的染色体位置在分配状态"注释"或"未注释"之前被查询到文库。
  2. DE 环核糖核酸的表征
    1. 使用 R 和其他电子表格软件根据 circRNA 类型（即外显子、内含子、基因间和反义）和 circRNA 跨越的基因数量（1 或 >1）汇总 circRNA 的数量（补充文件 1）。注意:CIRIquant只能检测四种类型的circRNA（外显子，内含子，基因间和反义）。外显子-内含子circRNA，也称为ElciRNA，不能被CIRIquant检测到。

4. 使用 Circr 预测 circRNA-miRNA 相互作用

注意:有关如何安装和使用Circr进行circRNA-miRNA相互作用分析的更详细手册，请访问: https://github.com/bicciatolab/Circr37。

  1. 准备文件
    1. 使用相关软件（如"WinRar"或"7-zip"）从 Circr GitHub 页面下载 Circr.zip 文件的内容后，解压缩并提取到将进行分析的新目录中。
    2. 在进行circRNA-miRNA分析之前，安装必备软件应用程序（miRanda，RNAhybrid，Pybedtools和samtools）。
    3. Circr 作者在 Github 页面 （https://github.com/bicciatolab/Circr）37 中提供了几种感兴趣的生物体的参考基因组和注释文件、rRNA 坐标文件、经过验证的 miRNA 相互作用文件和 circBase circRNA 文件。单击驱动器文件夹中的支持文件后，选择感兴趣的生物体文件夹，miRNA文件夹和circBase文本文件并下载。
    4. 在步骤 4.1.3 中下载必要的文件后，在步骤 4.1.1 中提到的目录中创建一个名为 support_files 的新目录。然后，解压缩内容并将其解压缩到 support_files 目录中。
    5. 使用 samtools faidx 命令（补充文件1）索引感兴趣的生物体的参考基因组文件。
    6. 在制表符分隔的BED文件中准备一个由感兴趣的DE circRNA的坐标组成的输入文件，如 表2所示。
      注意:由于CIRIquant预测的circRNA不是基于0的，因此在将其转换为BED格式之前，有必要在起始坐标处减去1 bp（如步骤3.1.1中所述）。 表 2 中显示的标头仅供参考，在 BED 文件中不需要。
    7. 此时，请确保 Circr 分析的预期文件夹树结构如图 2 所示。
  2. 跑步 Circr.py
    1. 使用 Python 3 执行 Circr.py，并在命令行中指定 circRNA 输入文件、感兴趣生物体的 FASTA 基因组、所选生物体的基因组版本、线程数和输出文件的名称作为参数。
    2. 如果在步骤 4.1.3 中列出的驱动器文件夹中未提供感兴趣的生物体，或者如果用户希望拥有一组自定义文件来运行分析，则在执行 Circr.py 时需要包含指定这些文件位置的其他命令。
    3. Circr 分析完成后，程序会输出 csv 格式的 circRNA-miRNA 相互作用文件。
    4. 根据用户特定的偏好过滤circRNA-miRNA相互作用结果。在本研究中，使用 Rstudio 根据以下标准过滤预测:
      -由所有三个软件工具检测
      -Targetscan和miRanda报告的两个或多个结合位点
      -在"AGO"或"已验证"列中标识
      -过滤掉没有种子区域的相互作用
    5. 将传递步骤 4.2.3 中过滤条件的 circRNA 写入名为 circRNA_miRNA.txt 的新文本文件中。此类筛选可以提高预测交互的置信度。

5. ceRNA网络的构建

注意:有关如何使用Cytoscape的详细手册，请访问:http://manual.cytoscape.org/en/stable/ 和 https://github.com/cytoscape/cytoscape-tutorials/wiki#introduction

  1. 下载和准备
    1. 从以下位置下载最新版本的 Cytoscape38 :https://cytoscape.org/download.html。
    2. 执行在步骤 5.1.1 中下载的安装程序向导，并选择 Cytoscape 软件的文件位置。
    3. 准备一个制表符分隔的文件，其中包含感兴趣的circRNA及其靶miRNA。第一列由 circRNA 名称组成;第二列指定第一列中的RNA类型;第三列是目标miRNA;第四列指定第三列中的RNA类型。 表 3 显示了该文件的示例。
  2. 构建 ceRNA 网络图
    1. 打开步骤 5.1.2 中安装的 Cytoscape 软件。
    2. 在 Cytoscape 中，导航到 "文件>从文件导入网络">。选择在步骤 5.1.3 中准备的文件。
    3. 在新选项卡中，选择第一列和第二列作为"源节点"和"源节点属性"，同时选择第三列和第四列作为"目标节点"和"目标节点属性"。单击 "确定"，网络将显示在 Cytoscape 的右上角。
    4. 要更改网络的视觉样式，请按 Cytoscape 左侧的 "样式 "按钮。
    5. 按 "填充颜色"右侧的箭头。为列选择 "类型" ，为映射类型选择" 离散映射 "。然后，选择每种RNA类型所需的颜色。
    6. 更改颜色后，通过导航到 "形状 "并按照步骤 5.2.5 更改节点的形状。

6. 功能富集分析

  1. 基因本体（GO）和京都基因和基因组百科全书（KEGG）对circRNA亲本基因的分析
    1. 确保集群探查器39，40 和组织。Hs.eg.db Rstudio 中已安装了 41 个软件包。组织。Hs.eg.db41包是仅针对人类的全基因组注释包。 如果感兴趣的生物是另一个物种，请参阅:https://bioconductor.org/packages/release/BiocViews.html#OrgDb
    2. 将步骤 2.3.1 中的DE_circRNA信息导入 Rstudio 工作区。
    3. 在接下来的步骤中，使用此文件中提供的circRNA的亲本基因进行富集分析。但是，如果用户希望将基因符号转换为其他格式，例如 Entrez ID，请使用"bitr"等函数。
    4. 通过使用基因 ID 作为输入，使用默认参数在 clusterProfiler39，40软件包中使用 enrichGO 函数运行 GO 富集分析。
    5. 通过使用基因 ID 作为输入，使用默认参数在 clusterProfiler39，40 软件包中使用 enrichKEGG 函数运行 KEGG 富集分析。

结果

上一节中列出的协议已经过修改和配置，以适应 Linux 操作系统系统。主要原因是大多数涉及 circRNA 分析的模块库和包只能在 Linux 平台上工作。在该分析中，从GEO数据库42下载了从GEO数据库42 中制备的由甲型流感病毒感染的人巨噬细胞制备的去识别核糖体RNA（rRNA）耗尽RNA-seq文库数据集，并用于生成具有代表性的结果。

环形RNA预测和定量
本分?...

讨论

为了说明该协议的实用性，以来自甲型流感病毒感染的人巨噬细胞的RNA-seq为例。研究了在宿主-病原体相互作用中充当潜在miRNA海绵的circRNA及其在宿主内的GO和KEGG功能富集。尽管网上有各种各样的circRNA工具，但它们中的每一个都是一个独立的软件包，不会相互交互。在这里，我们汇总了circRNA预测和定量，circRNA功能富集，circRNA-miRNA相互作用预测和ceRNA网络构建所需的一些工具。这种简化的方案节?...

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

作者要感谢Tan KeEn和Cameron Bracken博士对这份手稿的批判性评论。这项工作得到了基础研究资助计划（FRGS/1/2020/SKK0/UM/02/15）和马来亚大学高影响力研究资助计划（UM.C/625/1/HIR/MOE/CHAN/02/07）。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
BedtoolsGitHubhttps://github.com/arq5x/bedtools2/Referring to section 4.1.2. Needed for Circr.
BWABurrows-Wheeler Alignerhttp://bio-bwa.sourceforge.net/Referring to section 2.1.1 and 2.1.2. Needed to run CIRIquant, and to index the genome
CircrGitHubhttps://github.com/bicciatolab/CircrReferring to section 4. Use to predict the miRNA binding sites
CIRIquantGitHubhttps://github.com/bioinfo-biols/CIRIquantReferring to section 2.1.3. To predict circRNAs
ClusterprofilerGitHubhttps://github.com/YuLab-SMU/clusterProfilerReferring to section 7. For GO and KEGG functional enrichment
CPUIntel Intel(R) Xeon(R) CPU E5-2620 V2 @ 2.10 GHz   Cores: 6-core CPU Memory: 65 GB Graphics card: NVIDIA GK107GL (QUADRO K2000) Specifications used to run this entire protocol.
CytoscapeCytoscapehttps://cytoscape.org/download.htmlReferring to section 5.2. Needed to plot ceRNA network
FastQCBabraham Bioinformaticshttps://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/Referring to section 1.2.1. Quality checking on Fastq files
HISAT2http://daehwankimlab.github.io/hisat2/Referring to section 2.1.1 and 2.1.2. Needed to run CIRIquant, and to index the genome
LinuxUbuntu 20.04.5 LTS (Focal Fossa)https://releases.ubuntu.com/focal/Needed to run the entire protocol. Other Ubuntu versions may still be valid to carry out the protocol.
miRandahttp://www.microrna.org/microrna/getDownloads.doReferring to section 4.1.2. Needed for Circr
Pybedtoolspybedtools 0.8.2https://pypi.org/project/pybedtools/Needed for BED file genomic manipulation
PythonPython 2.7 and 3.6 or aboverhttps://www.python.org/downloads/To run necessary library modules
RThe Comprehensive R Archive Networkhttps://cran.r-project.org/To manipulate dataframes
RNAhybridBiBiServhttps://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybridReferring to section 4.1.2. Needed for Circr
RStudioRStudiohttps://www.rstudio.com/A workspace to run R
samtools SAMtoolshttp://www.htslib.org/Referring to section 2.1.2. Needed to run CIRIquant
StringTieJohns Hopkins University: Center for Computational Biologyhttp://ccb.jhu.edu/software/stringtie/index.shtmlReferring to section 2.1.2. Needed to run CIRIquant
TargetScanGitHubhttps://github.com/nsoranzo/targetscanReferring to section 4.1.2. Needed for Circr

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