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  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Le protocole soumis ici explique le pipeline in silico complet nécessaire pour prédire et caractériser fonctionnellement les circRNA à partir de données de transcriptome de séquençage de l’ARN étudiant les interactions hôte-pathogène.

Résumé

Les ARN circulaires (circRNA) sont une classe d’ARN non codants qui sont formés par épissage arrière. Ces circRNA sont principalement étudiés pour leurs rôles de régulateurs de divers processus biologiques. Notamment, de nouvelles preuves démontrent que les circRNA de l’hôte peuvent être exprimés de manière différentielle (DE) lors de l’infection par des agents pathogènes (p. ex. grippe et coronavirus), ce qui suggère un rôle pour les ARNcirc dans la régulation des réponses immunitaires innées de l’hôte. Cependant, les recherches sur le rôle des circRNA lors d’infections pathogènes sont limitées par les connaissances et les compétences requises pour effectuer l’analyse bioinformatique nécessaire pour identifier les circRNA DE à partir des données de séquençage de l’ARN (RNA-seq). La prédiction bioinformatique et l’identification des circRNA sont cruciales avant toute vérification et études fonctionnelles utilisant des techniques de laboratoire humide coûteuses et longues. Pour résoudre ce problème, un protocole étape par étape de prédiction et de caractérisation in silico des circRNA à l’aide de données RNA-seq est fourni dans ce manuscrit. Le protocole peut être divisé en quatre étapes : 1) Prédiction et quantification des circRNA DE via le pipeline CIRIquant ; 2) Annotation via circBase et caractérisation des circRNAs DE; 3) Prédiction de l’interaction CircRNA-miARN par pipeline Circr; 4) analyse de l’enrichissement fonctionnel des gènes parentaux circRNA à l’aide de l’ontologie génique (GO) et de l’Encyclopédie des gènes et des génomes de Kyoto (KEGG). Ce pipeline sera utile pour mener de futures recherches in vitro et in vivo afin de mieux comprendre le rôle des circRNA dans les interactions hôte-pathogène.

Introduction

Les interactions hôte-pathogène représentent une interaction complexe entre les agents pathogènes et les organismes hôtes, qui déclenche les réponses immunitaires innées des hôtes qui finissent par entraîner l’élimination des agents pathogènes envahisseurs 1,2. Au cours des infections pathogènes, une multitude de gènes immunitaires de l’hôte sont régulés pour inhiber la réplication et la libération d’agents pathogènes. Par exemple, les gènes communs stimulés par l’interféron (ISG) régulés sur les infections pathogènes comprennent ADAR1, IFIT1, IFIT2, IFIT3, ISG20, RIG-I et OASL 3,4. Outre les gènes codant pour les protéines, des études ont également rapporté que les ARN non codants tels que les longs ARN non codants (ARNnc), les microARN (miARN) et les ARN circulaires (ARNcirc) jouent également un rôle et sont régulés simultanément lors d’infections pathogènes 5,6,7. Contrairement aux gènes codant pour des protéines qui codent principalement des protéines en tant que molécules fonctionnelles, les ARN non codants (ARNnc) sont connus pour fonctionner comme régulateurs des gènes aux niveaux transcriptionnel et post-transcriptionnel. Cependant, les études impliquant la participation d’ARN non codants, en particulier les circRNA, dans la régulation des gènes immunitaires des hôtes ne sont pas bien rapportées par rapport aux gènes codant pour les protéines.

Les circRNA sont largement caractérisés par leur structure de boucle continue fermée par covalence, qui est générée par un processus d’épissage non canonique appelé back-sprisage8. Le processus d’épissage arrière, contrairement au processus d’épissage des ARN linéaires apparentés, implique la ligature du site donneur en aval vers le site accepteur en amont, formant une structure de forme circulaire. Actuellement, trois mécanismes différents d’épissage inverse pour la biogenèse des circRNAs ont été proposés. Il s’agit de la circularisation médiée par la protéine de liaison à l’ARN(RBP) 9,10, de la circularisation induite par l’appariement d’introns 11 et de la circularisation induite par le lariat12,13,14. Étant donné que les circRNA sont connectés bout à bout dans une structure circulaire, ils ont tendance à être naturellement résistants aux digestions normales des exonucléases et, par conséquent, sont considérés comme plus stables que leurs homologues linéaires15. Une autre caractéristique commune présentée par les circRNA comprend l’expression spécifique au type de cellule ou de tissu chez les hôtes16.

Comme l’impliquent leur structure unique et leur expression spécifique à la cellule ou au tissu, on a découvert que les circRNA jouent des fonctions biologiques importantes dans les cellules. À ce jour, l’une des fonctions importantes des circRNA est leur rôle en tant qu’éponges de microARN (miARN)17,18. Ce rôle régulateur des circRNA se produit par la liaison complémentaire des nucléotides circRNA avec la région semencière des miARN. Une telle interaction circRNA-miARN inhibe les fonctions régulatrices normales des miARN sur les ARNm cibles, régulant ainsi l’expression des gènes19,20. De plus, les circRNA sont également connus pour réguler l’expression des gènes en interagissant avec les protéines de liaison à l’ARN (RBP) et en formant des complexes ARN-protéine21. Bien que les circRNA soient classés comme ARN non codants, il existe également des preuves que les circRNA peuvent servir de modèles pour la traduction des protéines22,23,24.

Récemment, il a été démontré que les circRNA jouent un rôle central dans la régulation des interactions hôte-pathogène, en particulier entre les hôtes et les virus. En général, les circRNA de l’hôte sont supposés aider à réguler les réponses immunitaires de l’hôte pour éliminer les agents pathogènes envahisseurs. Un exemple de circRNA qui favorise les réponses immunitaires de l’hôte est circRNA_0082633, rapporté par Guo et al.25. Ce circRNA améliore la signalisation de l’interféron de type I (IFN) dans les cellules A549, ce qui aide à supprimer la réplication du virus de la grippe25. De plus, Qu et al. ont également signalé un circRNA intronique humain, appelé circRNA AIVR, qui favorise l’immunité en régulant l’expression de la protéine de liaison CREB (CREBBP), un transducteur de signal de l’IFN-β26,27. Cependant, il existe également des circRNA connus pour favoriser la pathogenèse de la maladie lors de l’infection. Par exemple, Yu et al. ont récemment rapporté le rôle joué par un circRNA épissé à partir du domaine du doigt de zinc GATA contenant le gène 2A (circGATAD2A) dans la promotion de la réplication du virus H1N1 par l’inhibition de l’autophagie de la cellule hôte28.

Pour étudier efficacement les circRNA, un algorithme de prédiction circRNA à l’échelle du génome est généralement mis en œuvre, suivi d’une caractérisation in silico des candidats circRNA prédits avant que toute étude fonctionnelle puisse être réalisée. Une telle approche bioinformatique pour prédire et caractériser les circRNA est moins coûteuse et plus rapide. Il aide à affiner le nombre de candidats à étudier fonctionnellement et pourrait potentiellement conduire à de nouvelles découvertes. Ici, nous fournissons un protocole bioinformatique détaillé pour l’identification in silico , la caractérisation et l’annotation fonctionnelle des circRNA au cours des interactions hôte-pathogène. Le protocole comprend l’identification et la quantification des circRNA à partir d’ensembles de données de séquençage d’ARN, l’annotation via circBase et la caractérisation des candidats circRNA en termes de types circRNA, de nombre de gènes qui se chevauchent et d’interactions circRNA-miARN prévues. Cette étude fournit également l’annotation fonctionnelle des gènes parentaux circRNA par le biais de l’ontologie génique (GO) et de l’analyse d’enrichissement de l’Encyclopédie des gènes et des génomes de Kyoto (KEGG).

Protocole

Dans ce protocole, des ensembles de données de bibliothèque de séquençage d’ARN ribosomique (ARNr) appauvris en ARN dépersonnalisés, préparés à partir de cellules de macrophages humains infectées par le virus de la grippe A, ont été téléchargés et utilisés à partir de la base de données GEO (Gene Expression Omnibus). L’ensemble du pipeline bioinformatique, de la prédiction à la caractérisation fonctionnelle des circRNA, est résumé à la figure 1. Chaque partie du pipeline est expliquée plus en détail dans les sections ci-dessous.

1. Préparation, téléchargement et configuration avant l’analyse des données

NOTE: Tous les progiciels utilisés dans cette étude sont gratuits et open-source.

  1. Téléchargement des outils requis sur la plateforme Linux
    1. Téléchargez et installez les logiciels et outils requis répertoriés dans le tableau des matériaux sur un ordinateur Linux haute performance en suivant les instructions fournies par le développeur.
      REMARQUE: La plupart des outils et logiciels ont leurs propres pages GitHub en ligne ou une documentation contenant des instructions sur l’installation et l’utilisation de leurs outils (reportez-vous au tableau des matériaux).
    2. Téléchargez les ensembles de données de séquençage d’ARN souhaités pour la détection et l’analyse de circRNA à partir de sites Web d’archives de séquences (par exemple, European Nucleotides Archive et Gene Expression Omnibus).
    3. Téléchargez le(s) génome(s) de référence (format FASTA) et les fichiers d’annotation (format GTF/GFF3), compatibles avec l’hôte à partir duquel l’ensemble de données RNA-seq a été préparé. Les génomes de référence de l’hôte et les fichiers d’annotation se trouvent généralement sur les navigateurs de génomes en ligne tels que le National Center for Biotechnology Information (NCBI), l’Université de Californie à Santa Cruz (UCSC) et les sites Web Ensembl.
  2. Contrôle de la qualité du séquençage de l’ARN
    1. Entrez les fichiers FASTQ dans le programme FASTQC pour déterminer la qualité des séquences d’ARN. Si la qualité des fichiers FASTQ est faible (par exemple, 29,30.

2. Prédiction et analyse d’expression différentielle des circRNA à l’aide de CIRIquant

REMARQUE : Un manuel plus détaillé sur l’installation et l’exécution de l’analyse d’expression différentielle se trouve dans la section disponibilité du code du document CIRIquant31. Les données supplémentaires incluent également certaines des commandes de base utilisées dans ce protocole.

  1. Prédictions CircRNA
    1. Indexez d’abord le génome de référence de l’hôte à l’aide des aligneurs BWA et HISAT2. Ensuite, sur un terminal Linux, exécutez les commandes bwa index 32 et hisat2-build33 dans le répertoire du génome de référence de l’hôte pour l’indexer.
    2. Ensuite, préparez un fichier de configuration YML contenant le nom du fichier, le chemin des outils (BWA, HISAT2, stringtie34, samtools35), le chemin d’accès aux fichiers de référence téléchargés (fichiers FASTA du génome de référence de l’hôte, fichiers d’annotation) et le chemin d’accès aux fichiers d’index de l’étape 2.1.1.
    3. Exécutez l’outil CIRIquant à partir du terminal en utilisant les paramètres par défaut ou manuels. L’utilisateur peut spécifier le type de bibliothèque (brin ou non) des données RNA-seq lors de l’exécution de l’outil CIRIquant.
      REMARQUE: Le type de bibliothèque des données RNA-seq peut être déterminé en connaissant le type de kit de préparation de bibliothèque utilisé. Si l’identité du kit de préparation de la bibliothèque est inconnue, un progiciel bioinformatique de contrôle ARN-seq appelé RSeQC36 peut être utilisé pour déterminer le brins des données de séquençage de l’ARN.
  2. Analyse d’expression différentielle
    REMARQUE: Le package CIRIquant comprend prep_CIRIquant, prepDE.py et CIRI_DE_replicate; Par conséquent, aucun téléchargement supplémentaire n’est nécessaire pour ces trois outils.
    1. Préparez un fichier texte (.lst) avec une liste de données contenant les éléments suivants :
      1ère colonne : ID des données RNA-seq utilisées à l’étape 2.1.3
      2ème colonne : chemin d’accès aux fichiers GTF générés par CIRIquant
      3ème colonne : regroupement des données RNA-seq, qu’il s’agisse d’un groupe témoin ou traité.
    2. Pour obtenir un exemple, reportez-vous au tableau 1 ci-dessous.
      REMARQUE: Il n’est pas nécessaire de mettre les en-têtes car ils sont juste pour référence.
    3. Sur le terminal Linux, exécutez prep_CIRIquant avec le fichier texte (.lst) préparé à l’étape 2.2.1 en entrée. L’exécution génère une liste de fichiers : library_info.csv, circRNA_info.csv, circRNA_bsj.csv et circRNA_ratio.csv.
    4. Préparez un deuxième fichier texte avec une liste de données contenant les ID RNA-seq et le chemin d’accès à leur sortie StringTie respective. La mise en page du fichier doit être similaire au fichier texte de l’étape 2.2.1 sans la colonne de regroupement.
    5. Exécutez prepDE.py avec le fichier texte préparé à l’étape 2.2.4 en entrée pour générer les fichiers de matrice de numération des gènes.
    6. Exécutez CIRI_DE_replicate avec les fichiers library_info.csv et circRNA_bsj.csv de l’étape 2.2.3 et le fichier gene_count_matrix.csv de l’étape 2.2.5 comme entrées pour sortir le fichier circRNA_de.tsv final.
  3. Filtrage des circRNAs DE
    1. Utilisez R (dans le terminal informatique ou RStudio) ou n’importe quel tableur (par exemple, Microsoft Excel) pour ouvrir le fichier circRNA_de.tsv généré à partir de l’étape 2.2.6 afin de filtrer et de déterminer le nombre de circRNA exprimés différentiellement (DE).
    2. Filtrer les circRNAs DE selon les critères LogFC > |2| et FDR < 0,05.
    3. Créez un fichier nommé DE_circRNAs.txt pour stocker les informations des circRNAs DE.

3. Caractérisation et annotation des circRNAs DE prédits

  1. Statut d’annotation des circRNAs DE
    1. Chargez le fichier nommé DE_circRNAs.txt dans RStudio , qui consiste en la liste des circRNA DE filtrés à partir de l’étape 2.3.3. Inclure d’autres informations telles que les positions génomiques (Chr, Start, End), l’orientation des brins (+ ou -), le nom du gène et le type circRNA. Avant de continuer, convertissez les coordonnées génomiques circRNA de CIRIquant à 0 en soustrayant 1 paire de bases.
      REMARQUE: Les autres informations mentionnées ci-dessus peuvent être obtenues à partir des fichiers GTF générés par CIRIquant (Fichier supplémentaire 1).
    2. Déterminez l’état d’annotation des circRNA DE prédits en téléchargeant une bibliothèque contenant les positions génomiques des circRNA-database (par exemple, circBase) déposées circRNA.
      REMARQUE: Assurez-vous que la version du génome utilisée pour prédire les circRNA est identique à la bibliothèque de base de données circRNA avant de faire la comparaison. Le fichier de données circBase utilisé ici est disponible gratuitement dans le dossier du lecteur fourni dans Github (https://github.com/bicciatolab/Circr)37.
    3. Une fois les fichiers de l’étape 3.1.1 et de l’étape 3.1.2 préparés, exécutez le script R fourni dans le fichier supplémentaire 1. Les emplacements chromosomiques des circRNA DE sont interrogés à la bibliothèque avant d’attribuer le statut Annoté ou Non annoté.
  2. Caractérisation des circRNAs DE
    1. Utilisez R et d’autres tableurs pour résumer le nombre de circRNA en fonction des types de circRNA (c.-à-d. exon, intron, intergénique et antisens) et du nombre de gènes que les circRNA couvrent (1 ou >1) (fichier supplémentaire 1).REMARQUE: CIRIquant ne peut détecter que quatre types de circRNA (exon, intron, intergénique et antisens). Les circRNA d’exon-intron, également appelés ElciRNA, ne peuvent pas être détectés par CIRIquant.

4. Prédire l’interaction circRNA-miARN à l’aide de Circr

REMARQUE: Un manuel plus détaillé sur la façon d’installer et d’utiliser Circr pour l’analyse de l’interaction circRNA-miARN peut être trouvé à: https://github.com/bicciatolab/Circr37.

  1. Préparation des dossiers
    1. Décompressez et extrayez le contenu du fichier Circr.zip après l’avoir téléchargé à partir de la page GitHub Circr en utilisant le logiciel approprié tel que « WinRar » ou « 7-zip » dans un nouveau répertoire où l’analyse sera effectuée.
    2. Installez les applications logicielles prérequises (miRanda, RNAhybrid, Pybedtools et samtools) avant d’effectuer l’analyse circRNA-miRNA.
    3. Les génomes de référence et les fichiers d’annotation pour plusieurs organismes d’intérêt, le fichier de coordonnées de l’ARNr, le fichier d’interaction miARN validé et les fichiers circBase circRNA sont fournis par l’auteur de Circr dans la page Github (https://github.com/bicciatolab/Circr)37. En cliquant sur les fichiers de support dans le dossier du lecteur, sélectionnez le dossier de l’organisme d’intérêt, le dossier miRNA et le fichier texte circBase et téléchargez-le.
    4. Après avoir téléchargé les fichiers nécessaires à l’étape 4.1.3, créez un nouveau répertoire nommé support_files dans le répertoire mentionné à l’étape 4.1.1. Ensuite, décompressez et extrayez le contenu dans le répertoire support_files .
    5. Indexez le fichier génome de référence de l’organisme d’intérêt à l’aide de la commande samtools faidx (Fichier supplémentaire 1).
    6. Préparez un fichier d’entrée comprenant les coordonnées des circRNA DE d’intérêt dans un fichier BED délimité par des tabulations, comme indiqué dans le tableau 2.
      REMARQUE: Étant donné que les circRNA prédits par CIRIquant ne sont pas basés sur 0, il est nécessaire de moins 1 pb à la coordonnée de départ (comme mentionné à l’étape 3.1.1) avant de les convertir au format BED. Les en-têtes indiqués dans le tableau 2 sont juste à titre de référence et ne sont pas nécessaires dans les fichiers BED.
    7. À ce stade, assurez-vous que l’arborescence de dossiers attendue pour l’analyse Circr est la même que dans la figure 2.
  2. Exécution Circr.py
    1. Exécutez Circr.py à l’aide de Python 3 et, en tant qu’arguments, spécifiez le fichier d’entrée circRNA, le génome FASTA de l’organisme d’intérêt, la version génomique de l’organisme sélectionné, le nombre de threads et le nom du fichier de sortie dans la ligne de commande.
    2. Si l’organisme d’intérêt n’est pas fourni dans le dossier du lecteur répertorié à l’étape 4.1.3 ou si l’utilisateur préfère disposer d’un ensemble personnalisé de fichiers pour exécuter l’analyse, des commandes supplémentaires spécifiant l’emplacement de ces fichiers doivent être incluses lors de l’exécution de Circr.py.
    3. Une fois l’analyse Circr terminée, le programme génère un fichier d’interaction circRNA-miARN au format csv.
    4. Filtrez les résultats de l’interaction circRNA-miARN en fonction des préférences spécifiques à l’utilisateur. Pour cette étude, les prédictions sont filtrées à l’aide de Rstudio selon les critères ci-dessous :
      -Détecté par les trois outils logiciels
      -Deux sites de liaison ou plus signalés par Targetscan et miRanda
      -Identifié dans les colonnes « AGO » ou « validé »
      -Filtrer aucune interaction avec la région de graine
    5. Écrivez les circRNA qui passent les conditions filtrées de l’étape 4.2.3 dans un nouveau fichier texte nommé circRNA_miRNA.txt. Un tel filtrage peut augmenter la confiance des interactions prévues.

5. Construction du réseau ceRNA

REMARQUE: Un manuel détaillé sur la façon d’utiliser Cytoscape peut être trouvé à: http://manual.cytoscape.org/en/stable/ et https://github.com/cytoscape/cytoscape-tutorials/wiki#introduction

  1. Téléchargement et préparation
    1. Téléchargez la dernière version de Cytoscape38 à partir de : https://cytoscape.org/download.html.
    2. Exécutez l’assistant d’installation téléchargé à l’étape 5.1.1 et sélectionnez l’emplacement du fichier pour le logiciel Cytoscape.
    3. Préparez un fichier délimité par des tabulations contenant les circRNA d’intérêt et leur miARN cible. La première colonne se compose du nom circRNA; la deuxième colonne spécifie le type d’ARN de la première colonne; la troisième colonne est le miARN cible; et la quatrième colonne spécifie le type d’ARN de la troisième colonne. Un exemple du fichier est présenté dans le tableau 3.
  2. Construction de la carte du réseau ceRNA
    1. Ouvrez le logiciel Cytoscape installé à l’étape 5.1.2.
    2. Dans Cytoscape, accédez à Fichier > Importer > Réseau à partir d’un fichier. Sélectionnez le fichier qui a été préparé à l’étape 5.1.3.
    3. Dans le nouvel onglet, sélectionnez la première et la deuxième colonne comme « Nœud source » et « Attribut du nœud source », tandis que sélectionnez la troisième et la quatrième colonne comme « Nœud cible » et « Attribut du nœud cible » respectivement. Cliquez sur OK et le réseau apparaîtra en haut à droite de Cytoscape.
    4. Pour changer le style visuel du réseau, appuyez sur le bouton Style sur le côté gauche de Cytoscape.
    5. Appuyez sur la flèche située à droite de Couleur de remplissage. Choisissez Type pour la colonne et Mappage discret pour le type de mappage. Ensuite, sélectionnez la couleur souhaitée pour chacun des types d’ARN.
    6. Après avoir modifié la couleur, modifiez la forme des nœuds en accédant à Forme et en suivant l’étape 5.2.5.

6. Analyse de l’enrichissement fonctionnel

  1. Analyse de l’ontologie des gènes (GO) et de l’Encyclopédie des gènes et des génomes de Kyoto (KEGG) pour le gène parental des circRNA
    1. Assurez-vous que clusterProfiler 39,40 et org. Hs.eg.db41 paquets ont été installés dans Rstudio. L’organisation. Le paquet Hs.eg.db41 est un paquet d’annotation à l’échelle du génome uniquement pour les humains. Si l’organisme d’intérêt est une autre espèce, reportez-vous à : https://bioconductor.org/packages/release/BiocViews.html#OrgDb
    2. Importez les informations DE_circRNA de l’étape 2.3.1 dans l’espace de travail Rstudio.
    3. Utilisez le gène parental des circRNAs fournis dans ce fichier pour l’analyse d’enrichissement dans les prochaines étapes. Cependant, si l’utilisateur souhaite convertir le symbole du gène dans d’autres formats, tels que l’ID Entrez, utilisez une fonction telle que « bitr ».
    4. En utilisant l’ID du gène comme entrée, exécutez l’analyse d’enrichissement GO à l’aide de la fonction enrichGO dans le package clusterProfiler39,40 à l’aide des paramètres par défaut.
    5. En utilisant l’ID du gène comme entrée, exécutez l’analyse d’enrichissement KEGG à l’aide de la fonction enrichKEGG dans le package clusterProfiler39,40 à l’aide des paramètres par défaut.

Résultats

Le protocole enrôlé dans la section précédente a été modifié et configuré pour s’adapter au système d’exploitation Linux. La raison principale est que la plupart des bibliothèques de modules et des paquets impliqués dans l’analyse des circRNA ne peuvent fonctionner que sur la plate-forme Linux. Dans cette analyse, des ensembles de données de bibliothèques de séquences d’ARN ribosomique (ARNr) appauvries en ARN dépersonnalisées préparées à partir des cellules de macrophages humains infectées pa...

Discussion

Pour illustrer l’utilité de ce protocole, le séquençage de l’ARN provenant de cellules de macrophages humains infectées par le virus de la grippe A a été utilisé comme exemple. Les circRNA fonctionnant comme des éponges miARN potentielles dans les interactions hôte-pathogène et leur enrichissement fonctionnel GO et KEGG au sein d’un hôte ont été étudiés. Bien qu’il existe une variété d’outils circRNA disponibles en ligne, chacun d’eux est un package autonome qui n’interagit pas les uns avec...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

L’auteur tient à remercier Tan Ke En et le Dr Cameron Bracken pour leur examen critique de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par des subventions du programme de subventions de recherche fondamentale (FRGS / 1 / 2020 / SKK0 / UM / 02/15) et de la subvention de recherche à fort impact de l’Université de Malaisie (UM. C/625/1/HIR/MOE/CHAN/02/07).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
BedtoolsGitHubhttps://github.com/arq5x/bedtools2/Referring to section 4.1.2. Needed for Circr.
BWABurrows-Wheeler Alignerhttp://bio-bwa.sourceforge.net/Referring to section 2.1.1 and 2.1.2. Needed to run CIRIquant, and to index the genome
CircrGitHubhttps://github.com/bicciatolab/CircrReferring to section 4. Use to predict the miRNA binding sites
CIRIquantGitHubhttps://github.com/bioinfo-biols/CIRIquantReferring to section 2.1.3. To predict circRNAs
ClusterprofilerGitHubhttps://github.com/YuLab-SMU/clusterProfilerReferring to section 7. For GO and KEGG functional enrichment
CPUIntel Intel(R) Xeon(R) CPU E5-2620 V2 @ 2.10 GHz   Cores: 6-core CPU Memory: 65 GB Graphics card: NVIDIA GK107GL (QUADRO K2000) Specifications used to run this entire protocol.
CytoscapeCytoscapehttps://cytoscape.org/download.htmlReferring to section 5.2. Needed to plot ceRNA network
FastQCBabraham Bioinformaticshttps://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/Referring to section 1.2.1. Quality checking on Fastq files
HISAT2http://daehwankimlab.github.io/hisat2/Referring to section 2.1.1 and 2.1.2. Needed to run CIRIquant, and to index the genome
LinuxUbuntu 20.04.5 LTS (Focal Fossa)https://releases.ubuntu.com/focal/Needed to run the entire protocol. Other Ubuntu versions may still be valid to carry out the protocol.
miRandahttp://www.microrna.org/microrna/getDownloads.doReferring to section 4.1.2. Needed for Circr
Pybedtoolspybedtools 0.8.2https://pypi.org/project/pybedtools/Needed for BED file genomic manipulation
PythonPython 2.7 and 3.6 or aboverhttps://www.python.org/downloads/To run necessary library modules
RThe Comprehensive R Archive Networkhttps://cran.r-project.org/To manipulate dataframes
RNAhybridBiBiServhttps://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybridReferring to section 4.1.2. Needed for Circr
RStudioRStudiohttps://www.rstudio.com/A workspace to run R
samtools SAMtoolshttp://www.htslib.org/Referring to section 2.1.2. Needed to run CIRIquant
StringTieJohns Hopkins University: Center for Computational Biologyhttp://ccb.jhu.edu/software/stringtie/index.shtmlReferring to section 2.1.2. Needed to run CIRIquant
TargetScanGitHubhttps://github.com/nsoranzo/targetscanReferring to section 4.1.2. Needed for Circr

Références

  1. Raman, K., Bhat, A. G., Chandra, N. A systems perspective of host-pathogen interactions: predicting disease outcome in tuberculosis. Molecular BioSystems. 6 (3), 516-530 (2010).
  2. Casadevall, A., Pirofski, L. A. Host-pathogen interactions: basic concepts of microbial commensalism, colonization, infection, and disease. Infection and Immunity. 68 (12), 6511-6518 (2000).
  3. Yang, E., Li, M. M. H. All About the RNA: Interferon-stimulated genes that interfere with viral RNA processes. Frontiers in Immunology. 11, 605024 (2020).
  4. Schneider, W. M., Chevillotte, M. D., Rice, C. M. Interferon-stimulated genes: A complex web of host defenses. Annual Review of Immunology. 32 (1), 513-545 (2014).
  5. Shirahama, S., Miki, A., Kaburaki, T., Akimitsu, N. Long non-coding RNAs involved in pathogenic infection. Frontiers in Genetics. 11, 454 (2020).
  6. Chandan, K., Gupta, M., Sarwat, M. Role of host and pathogen-derived microRNAs in immune regulation during infectious and inflammatory diseases. Frontiers in Immunology. 10, 3081 (2019).
  7. Chen, X., et al. Circular RNAs in immune responses and immune diseases. Theranostics. 9 (2), 588-607 (2019).
  8. Kristensen, L. S., et al. The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nature Reviews Genetics. 20 (11), 675-691 (2019).
  9. Ashwal-Fluss, R., et al. circRNA biogenesis competes with pre-mRNA splicing. Molecular Cell. 56 (1), 55-66 (2014).
  10. Conn, S. J., et al. The RNA binding protein quaking regulates formation of circRNAs. Cell. 160 (6), 1125-1134 (2015).
  11. Zhang, X. O., et al. Complementary sequence-mediated exon circularization. Cell. 159 (1), 134-147 (2014).
  12. Robic, A., Demars, J., Kuhn, C. In-depth analysis reveals production of circular RNAs from non-coding sequences. Cells. 9 (8), 1806 (2020).
  13. Eger, N., Schoppe, L., Schuster, S., Laufs, U., Boeckel, J. N. Circular RNA splicing. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1087, 41-52 (2018).
  14. Barrett, S. P., Wang, P. L., Salzman, J. Circular RNA biogenesis can proceed through an exon-containing lariat precursor. eLife. 4, 07540 (2015).
  15. Memczak, S., et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).
  16. Misir, S., Wu, N., Yang, B. B. Specific expression and functions of circular RNAs. Cell Death and Differentiation. 29 (3), 481-491 (2022).
  17. Bai, S., et al. Construct a circRNA/miRNA/mRNA regulatory network to explore potential pathogenesis and therapy options of clear cell renal cell carcinoma. Scientific Reports. 10 (1), 13659 (2020).
  18. Sakshi, S., Jayasuriya, R., Ganesan, K., Xu, B., Ramkumar, K. M. Role of circRNA-miRNA-mRNA interaction network in diabetes and its associated complications. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 26, 1291-1302 (2021).
  19. Hansen, T. B., et al. miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA. The EMBO Journal. 30 (21), 4414-4422 (2011).
  20. Lu, M. Circular RNA: functions, applications, and prospects. ExRNA. 2 (1), 15 (2020).
  21. Liu, K. S., Pan, F., Mao, X. D., Liu, C., Chen, Y. J. Biological functions of circular RNAs and their roles in occurrence of reproduction and gynecological diseases. American Journal of Translational Research. 11 (1), 1-15 (2019).
  22. Pamudurti, N. R., et al. Translation of CircRNAs. Molecular Cell. 66 (1), 9-21 (2017).
  23. Legnini, I., et al. Circ-ZNF609 Is a circular RNA that can be translated and functions in myogenesis. Molecular Cell. 66 (1), 22-37 (2017).
  24. Weigelt, C. M., et al. An insulin-sensitive circular RNA that regulates lifespan in Drosophila. Molecular Cell. 79 (2), 268-279 (2020).
  25. Guo, Y., et al. Identification and characterization of circular RNAs in the A549 cells following Influenza A virus infection. Veterinary Microbiology. 267, 109390 (2022).
  26. Qu, Z., et al. A novel intronic circular RNA antagonizes influenza virus by absorbing a microRNA that degrades CREBBP and accelerating IFN-β production. mBio. 12 (4), 0101721 (2021).
  27. Kawarada, Y., et al. TGF-β induces p53/Smads complex formation in the PAI-1 promoter to activate transcription. Scientific Reports. 6 (1), 35483 (2016).
  28. Yu, T., et al. Circular RNA GATAD2A promotes H1N1 replication through inhibiting autophagy. Veterinary Microbiology. 231, 238-245 (2019).
  29. FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data. Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010)
  30. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  31. Zhang, J., Chen, S., Yang, J., Zhao, F. Accurate quantification of circular RNAs identifies extensive circular isoform switching events. Nature Communications. 11 (1), 90 (2020).
  32. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
  33. Kim, D., Paggi, J. M., Park, C., Bennett, C., Salzberg, S. L. Graph-based genome alignment and genotyping with HISAT2 and HISAT-genotype. Nature Biotechnology. 37 (8), 907-915 (2019).
  34. Pertea, M., et al. StringTie enables improved reconstruction of a transcriptome from RNA-seq reads. Nature Biotechnology. 33 (3), 290-295 (2015).
  35. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  36. Wang, L., Wang, S., Li, W. RSeQC: quality control of RNA-seq experiments. Bioinformatics. 28 (16), 2184-2185 (2012).
  37. Dori, M., Caroli, J., Forcato, M. Circr, a computational tool to identify miRNA:circRNA associations. Frontiers in Bioinformatics. 2, 852834 (2022).
  38. Shannon, P., et al. Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Research. 13 (11), 2498-2504 (2003).
  39. Wu, T., et al. clusterProfiler 4.0: A universal enrichment tool for interpreting omics data. The Innovation. 2 (3), 100141 (2021).
  40. Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. OMICS: A Journal of Integrative Biology. 16 (5), 284-287 (2012).
  41. . org.Hs.eg.db: Genome wide annotation for human. 2022. R package version 3.15.0 Available from: https://bioconductor.org/packages/release/data/annotation/html/org.Hs.eg.db.html (2022)
  42. Barrett, T., et al. NCBI GEO: archive for functional genomics data sets-update. Nucleic Acids Research. 41, 991-995 (2012).
  43. Gao, Y., Zhang, J., Zhao, F. Circular RNA identification based on multiple seed matching. Briefings in Bioinformatics. 19 (5), 803-810 (2018).
  44. Zhang, X. O., et al. Diverse alternative back-splicing and alternative splicing landscape of circular RNAs. Genome Research. 26 (9), 1277-1287 (2016).
  45. Memczak, S., et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).
  46. Wang, K., et al. MapSplice: Accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery. Nucleic Acids Research. 38 (18), 178 (2010).
  47. Song, X., et al. Circular RNA profile in gliomas revealed by identification tool UROBORUS. Nucleic Acids Research. 44 (9), 87 (2016).
  48. Hansen, T. B. Improved circRNA identification by combining prediction algorithms. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 20 (2018).
  49. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: A bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
  50. Ma, X. K., et al. CIRCexplorer3: A CLEAR pipeline for direct comparison of circular and linear RNA expression. Genomics Proteomics Bioinformatics. 17 (5), 511-521 (2019).
  51. Gaffo, E., Buratin, A., Dal Molin, A., Bortoluzzi, S. Sensitive, reliable and robust circRNA detection from RNA-seq with CirComPara2. Briefings in Bioinformatics. 23 (1), (2022).
  52. Glažar, P., Papavasileiou, P., Rajewsky, N. circBase: a database for circular RNAs. RNA. 20 (11), 1666-1670 (2014).
  53. Tan, S., et al. Circular RNA F-circEA-2a derived from EML4-ALK fusion gene promotes cell migration and invasion in non-small cell lung cancer. Molecular Cancer. 17 (1), 138 (2018).
  54. Guarnerio, J., et al. Oncogenic role of Fusion-circRNAs Derived from cancer-associated chromosomal translocations. Cell. 165 (2), 289-302 (2016).
  55. McGeary, S. E., et al. The biochemical basis of microRNA targeting efficacy. Science. 366 (6472), (2019).
  56. Enright, A. J., et al. MicroRNA targets in Drosophila. Genome Biology. 5 (1), 1 (2003).
  57. Rehmsmeier, M., Steffen, P., Hochsmann, M., Giegerich, R. Fast and effective prediction of microRNA/target duplexes. RNA. 10 (10), 1507-1517 (2004).
  58. Zhang, D., et al. AllEnricher: a comprehensive gene set function enrichment tool for both model and non-model species. BMC Bioinformatics. 21 (1), 106 (2020).
  59. Zhou, Y., et al. Metascape provides a biologist-oriented resource for the analysis of systems-level datasets. Nature Communications. 10 (1), 1523 (2019).

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