Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
Представленный здесь протокол объясняет полный конвейер in silico , необходимый для прогнозирования и функциональной характеристики цирковых РНК на основе данных транскриптома секвенирования РНК, изучающих взаимодействия хозяина и патогена.
Кольцевые РНК (цирковые РНК) представляют собой класс некодирующих РНК, которые образуются путем обратного сплайсинга. Эти циркулярные РНК преимущественно изучаются на предмет их роли в качестве регуляторов различных биологических процессов. Примечательно, что новые данные демонстрируют, что цирковые РНК хозяина могут дифференциально экспрессироваться (ДЭ) при инфицировании патогенами (например, гриппом и коронавирусами), что свидетельствует о роли циркРНК в регуляции врожденных иммунных реакций хозяина. Однако исследования роли цирковых РНК во время патогенных инфекций ограничены знаниями и навыками, необходимыми для проведения необходимого биоинформатического анализа для идентификации цирковых РНК DE по данным секвенирования РНК (RNA-seq). Биоинформационное прогнозирование и идентификация циркулярных РНК имеет решающее значение перед любой проверкой и функциональными исследованиями с использованием дорогостоящих и трудоемких методов мокрой лаборатории. Для решения этой проблемы в данной рукописи приведен пошаговый протокол in silico предсказания и характеристики цирковых РНК с использованием данных RNA-seq. Протокол можно разделить на четыре этапа: 1) Прогнозирование и количественное определение циркулярных РНК DE с помощью конвейера CIRIquant; 2) Аннотация через circBase и характеристика цирковых РНК DE; 3) Прогнозирование взаимодействия CircRNA-miRNA через конвейер Circr; 4) анализ функционального обогащения родительских генов циркРНК с использованием Gene Ontology (GO) и Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Этот конвейер будет полезен для проведения будущих исследований in vitro и in vivo для дальнейшего раскрытия роли цирковых РНК во взаимодействиях хозяина и патогена.
Взаимодействия хозяина и патогена представляют собой сложное взаимодействие между патогенами и организмами-хозяевами, которое запускает врожденные иммунные реакции хозяев, которые в конечном итоге приводят к удалению вторгшихся патогенов 1,2. Во время патогенных инфекций регулируется множество иммунных генов хозяина, чтобы ингибировать репликацию и высвобождение патогенов. Например, общие интерферон-стимулированные гены (ISG), регулируемые патогенными инфекциями, включают ADAR1, IFIT1, IFIT2, IFIT3, ISG20, RIG-I и OASL 3,4. Помимо генов, кодирующих белок, исследования также показали, что некодирующие РНК, такие как длинные некодирующие РНК (днРНК), микроРНК (миРНК) и кольцевые РНК (циркРНК), также играют роль и регулируются одновременно во время патогенных инфекций 5,6,7. В отличие от генов, кодирующих белки, которые в основном кодируют белки как функциональные молекулы, известно, что некодирующие РНК (нРНК) функционируют как регуляторы генов на транскрипционном и посттранскрипционном уровнях. Однако исследования, включающие участие некодирующих РНК, особенно цирковых РНК, в регуляции иммунных генов хозяев, не очень хорошо представлены по сравнению с генами, кодирующими белок.
Цирковые РНК широко характеризуются своей ковалентно замкнутой непрерывной петлевой структурой, которая генерируется с помощью неканонического процесса сплайсинга, называемого обратным сплайсингом8. Процесс обратного сплайсинга, в отличие от процесса сплайсинга родственных линейных РНК, включает лигирование нижестоящего донорного сайта с вышестоящим акцепторным сайтом, образуя структуру круглой формы. В настоящее время предложены три различных механизма обратного сплайсинга для биогенеза циркРНК. Это опосредованная РНК связывающим белком (RBP)циркуляция 9,10, циркуляция, управляемая спариванием интронов, 11 и циркуляция, управляемая лариатом12,13,14. Учитывая, что цирковые РНК соединены встык в кольцевую структуру, они, как правило, естественным образом устойчивы к нормальному расщеплению экзонуклеазы и, таким образом, считаются более стабильными, чем их линейные аналоги15. Другая общая характеристика, проявляемая циркРНК, включает специфическую для клеток или тканей экспрессию у хозяев16.
Как следует из их уникальной структуры и клеточной или тканеспецифической экспрессии, было обнаружено, что циркРНК играют важные биологические функции в клетках. На сегодняшний день одной из основных функций цирковых РНК является их роль в качестве губок микроРНК (миРНК)17,18. Эта регуляторная роль цирковых РНК происходит за счет комплементарного связывания нуклеотидов циркРНК с затравочной областью микроРНК. Такое взаимодействие circRNA-miRNA ингибирует нормальные регуляторные функции микроРНК на мРНК-мишенях, тем самым регулируя экспрессию генов 19,20. Кроме того, известно также, что цирковые РНК регулируют экспрессию генов, взаимодействуя с РНК-связывающими белками (RBP) и образуя РНК-белковые комплексы21. Хотя цирковые РНК классифицируются как некодирующие РНК, есть также доказательства того, что цирковые РНК могут выступать в качестве шаблонов для трансляции белка22,23,24.
Недавно было продемонстрировано, что цирковые РНК играют ключевую роль в регулировании взаимодействий хозяина и патогена, особенно между хозяевами и вирусами. Как правило, предполагается, что циркРНК хозяина помогают регулировать иммунные реакции хозяина для устранения вторгшихся патогенов. Примером циркулярной РНК, способствующей иммунному ответу хозяина, является circRNA_0082633, о чем сообщают Guo et al.25. Эта циркулярная РНК усиливает передачу сигналов интерферона I типа (ИФН) в клетках A549, что помогает подавить репликацию вируса гриппа25. Кроме того, Qu et al. также сообщили об интронной циркулярной РНК человека, называемой циркулярной РНК AIVR, которая способствует иммунитету, регулируя экспрессию CREB-связывающего белка (CREBBP), сигнального преобразователя ИФН-β26,27. Тем не менее, циркулярные РНК, которые, как известно, способствуют патогенезу заболевания при заражении, также существуют. Например, Yu et al. недавно сообщили о роли, которую играет циркулярная РНК, сплайсированная из домена цинкового пальца GATA, содержащего ген 2A (circGATAD2A), в стимулировании репликации вируса H1N1 посредством ингибирования аутофагии клетки-хозяина28.
Для эффективного изучения цирковых РНК обычно реализуется полногеномный алгоритм прогнозирования циркулярных РНК с последующей характеристикой in silico предсказанных кандидатов на циркРНК до того, как можно будет провести какие-либо функциональные исследования. Такой биоинформатический подход к прогнозированию и характеристике цирковых РНК является менее дорогостоящим и более эффективным по времени. Это помогает уточнить количество кандидатов, подлежащих функциональному изучению, и потенциально может привести к новым выводам. Здесь мы предоставляем подробный биоинформатический протокол для идентификации, характеристики и функциональной аннотации circRNA in silico во время взаимодействия хозяина и патогена. Протокол включает идентификацию и количественное определение цирковых РНК из наборов данных секвенирования РНК, аннотацию через circBase и характеристику кандидатов на цирковые РНК с точки зрения типов цирковых РНК, количества перекрывающихся генов и прогнозируемых взаимодействий циркРНК-миРНК. Это исследование также обеспечивает функциональную аннотацию родительских генов циркРНК с помощью онтологии генов (GO) и анализа обогащения Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG).
В этом протоколе из базы данных Gene Expression Omnibus (GEO) были загружены и использованы деидентифицированные наборы данных библиотеки РНК-секвенирования РНК (рРНК), подготовленные из инфицированных вирусом гриппа А клеток макрофагов человека. Весь конвейер биоинформатики от прогнозирования до функциональной характеристики циркулярных РНК кратко представлен на рисунке 1. Каждая часть конвейера более подробно описана в разделах ниже.
1. Подготовка, загрузка и настройка перед анализом данных
ПРИМЕЧАНИЕ: Все программные пакеты, используемые в этом исследовании, являются бесплатными и с открытым исходным кодом.
2. Прогнозирование и анализ дифференциальной экспрессии цирковых РНК с использованием CIRIquant
ПРИМЕЧАНИЕ: Более подробное руководство по установке и выполнению анализа дифференциальных выражений можно найти в разделе о доступности кода документаCIRIquant 31. Дополнительные данные также включают некоторые из основных команд, используемых в этом протоколе.
3. Характеристика и аннотация предсказанных ДЭ циркРНК
4. Прогнозирование взаимодействия circRNA-miRNA с помощью Circr
ПРИМЕЧАНИЕ: Более подробное руководство по установке и использованию Circr для анализа взаимодействия circRNA-miRNA можно найти по адресу: https://github.com/bicciatolab/Circr37.
5. Построение сети цеРНК
ПРИМЕЧАНИЕ: Подробное руководство по использованию Cytoscape можно найти по адресу: http://manual.cytoscape.org/en/stable/ и https://github.com/cytoscape/cytoscape-tutorials/wiki#introduction
6. Анализ функционального обогащения
Протокол, перечисленный в предыдущем разделе, был изменен и настроен в соответствии с системой ОС Linux. Основная причина заключается в том, что большинство библиотек модулей и пакетов, участвующих в анализе circRNA, могут работать только на платформе Linux. В этом анализе деидентифицированные ...
Чтобы проиллюстрировать полезность этого протокола, в качестве примера использовали РНК-секвенирование из инфицированных вирусом гриппа А клеток макрофагов человека. Были исследованы циркРНК, функционирующие как потенциальные губки микроРНК во взаимодействиях хозяин-патоген, и их ?...
Авторам раскрывать нечего.
Автор хотел бы поблагодарить Тан Ке Эн и доктора Кэмерона Брэкена за их критическую рецензию на эту рукопись. Эта работа была поддержана грантами Схемы грантов на фундаментальные исследования (FRGS/1/2020/SKK0/UM/02/15) и Исследовательского гранта Университета Малайи (UM. C/625/1/HIR/MOE/CHAN/02/07).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Bedtools | GitHub | https://github.com/arq5x/bedtools2/ | Referring to section 4.1.2. Needed for Circr. |
BWA | Burrows-Wheeler Aligner | http://bio-bwa.sourceforge.net/ | Referring to section 2.1.1 and 2.1.2. Needed to run CIRIquant, and to index the genome |
Circr | GitHub | https://github.com/bicciatolab/Circr | Referring to section 4. Use to predict the miRNA binding sites |
CIRIquant | GitHub | https://github.com/bioinfo-biols/CIRIquant | Referring to section 2.1.3. To predict circRNAs |
Clusterprofiler | GitHub | https://github.com/YuLab-SMU/clusterProfiler | Referring to section 7. For GO and KEGG functional enrichment |
CPU | Intel | Intel(R) Xeon(R) CPU E5-2620 V2 @ 2.10 GHz Cores: 6-core CPU Memory: 65 GB Graphics card: NVIDIA GK107GL (QUADRO K2000) | Specifications used to run this entire protocol. |
Cytoscape | Cytoscape | https://cytoscape.org/download.html | Referring to section 5.2. Needed to plot ceRNA network |
FastQC | Babraham Bioinformatics | https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ | Referring to section 1.2.1. Quality checking on Fastq files |
HISAT2 | http://daehwankimlab.github.io/hisat2/ | Referring to section 2.1.1 and 2.1.2. Needed to run CIRIquant, and to index the genome | |
Linux | Ubuntu 20.04.5 LTS (Focal Fossa) | https://releases.ubuntu.com/focal/ | Needed to run the entire protocol. Other Ubuntu versions may still be valid to carry out the protocol. |
miRanda | http://www.microrna.org/microrna/getDownloads.do | Referring to section 4.1.2. Needed for Circr | |
Pybedtools | pybedtools 0.8.2 | https://pypi.org/project/pybedtools/ | Needed for BED file genomic manipulation |
Python | Python 2.7 and 3.6 or abover | https://www.python.org/downloads/ | To run necessary library modules |
R | The Comprehensive R Archive Network | https://cran.r-project.org/ | To manipulate dataframes |
RNAhybrid | BiBiServ | https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid | Referring to section 4.1.2. Needed for Circr |
RStudio | RStudio | https://www.rstudio.com/ | A workspace to run R |
samtools | SAMtools | http://www.htslib.org/ | Referring to section 2.1.2. Needed to run CIRIquant |
StringTie | Johns Hopkins University: Center for Computational Biology | http://ccb.jhu.edu/software/stringtie/index.shtml | Referring to section 2.1.2. Needed to run CIRIquant |
TargetScan | GitHub | https://github.com/nsoranzo/targetscan | Referring to section 4.1.2. Needed for Circr |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены