兔后肢腘窝血管淋巴结切除术治疗继发性淋巴水肿诱导

摘要

在这里，描述了兔后肢稳定获得性淋巴水肿的手术诱导。该实验动物可用于进一步研究通过显微外科技术治疗淋巴水肿的效果。

摘要

淋巴水肿是一种常见病症，通常与癌症及其治疗有关，导致淋巴系统受损，目前的治疗大多是姑息性的，而不是治愈性的。它在肿瘤患者中的高发病率表明需要研究正常的淋巴功能和病理功能障碍。要再现慢性淋巴水肿，需要选择合适的实验动物。建立动物模型的尝试受到淋巴系统再生能力的限制。在潜在的候选者中，兔子后肢易于处理并推断到人类临床场景，使其具有优势。此外，该物种的大小允许更好地选择淋巴管进行血管化淋巴结切除术。

在这项研究中，我们提出了一种在兔后肢进行血管淋巴结切除术以诱导继发性淋巴水肿的手术。麻醉动物使用实时近红外荧光进行圆周测量、专利蓝 V 浸润和吲哚菁绿淋巴造影 （ICG-L），该技术可以识别单个腘窝淋巴结和淋巴管。通过切除腘窝淋巴结并结扎内侧和外侧传入淋巴管，可以进入已识别的结构。必须特别注意确保可以识别和结扎任何在不进入腘窝结的情况下加入大腿内股淋巴系统的淋巴管。

在诱导后 3 、 6 和 12 个月使用后肢和 ICG-L 的圆周测量进行术后评估。正如在随访中证明的那样，动物出现了皮肤回流，一直持续到^第 12 个月，这使得这种实验动物可用于淋巴水肿管理的新型长期评估。总之，此处描述的方法是可行且可重复的。此外，在所呈现的时间窗口内，它可以代表人类淋巴水肿，从而提供有用的研究工具。

引言

淋巴水肿是一种值得特别关注的慢性疾病，因为它的发病率在全球范围内，缺乏治愈性和标准化的治疗，并且对患者的生活质量有严重影响 ^1,2。

在发达国家，淋巴水肿主要是获得性的，继发于乳腺癌，因为这种恶性肿瘤的患病率很高;手术后 10 年乳腺癌相关淋巴水肿的累积发生率可高达 41.1%³。然而，黑色素瘤、妇科癌症、泌尿生殖系统肿瘤和头颈部肿瘤等疾病也与这种疾病的高发病率有关⁴。区域淋巴结切除术作为提高存活率的必要肿瘤治疗的一部分，会导致功能性淋巴引流中断。在某些情况下，这会导致预防或延迟淋巴水肿发作的代偿机制⁵。然而，当进行化疗和放疗时，这些机制无法补偿变化，导致淋巴水肿的发生。这对患者的生活质量产生负面影响，影响他们的功能、社交和心理健康 ^6,7。

需要有效治愈淋巴水肿，需要了解淋巴系统的生理病理学，以及深入了解复杂的细胞机制及其在正常和功能失调的淋巴系统中的反应 ^8,9,10。这种见解最初可以从可以复制慢性人类疾病的实验动物模型中获得¹¹。

已经进行了许多尝试在实验动物模型中复制淋巴水肿;然而，他们中的大多数都受到一些限制的阻碍，包括无法在稳定的动物模型中复制慢性淋巴功能不全、研究成本，最重要的是，淋巴系统的巨大再生能力，使其能够恢复血液循环^12,13。

本研究提出了使用兔后肢手术诱导稳定获得性淋巴水肿的实验方法。根据文献综述，这种动物可以被认为是最适合发生淋巴水肿的动物，因为它的后肢淋巴系统解剖结构一致，其中包括一个腘窝淋巴结，该淋巴结引流后肢并到达腿部的主要股骨淋巴系统^14,15。

兔子后肢的特定解剖结构允许复制在人类中进行的外科手术以诱导继发性淋巴水肿。因此，该程序可用于显微外科培训和临床前研究，以将结果外推到人类医学。

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研究方案

所有程序均由 Jesús Usón 微创手术中心伦理委员会和地区政府的福利指南批准，这些指南基于欧洲立法。

1. 术前和手术准备

1. 将 9 只重 4-4.5 公斤、龄 4 个月的雌性新西兰白兔饲养在单独的笼子中，保持在 22-25 °C 的温度下，可以自由获得食物和水。确保笼子包含一个表面积为 3 m² 且高度为 40 cm 的聚砜托盘，以及一张带有木屑的床。
   1. 使用项目代码和动物识别号识别笼子。
   2. 手术前让动物适应 1 周，以防止压力引起的问题。收集血样的术前实验室值，以确保每只动物在麻醉前身体健康。
2. 确保所有兔子在每次手术前禁食 12 小时。
   1. 术前用药后，使用面罩（霍尔面罩）用 100% 氧气和 3-5 L/min 的新鲜气流给兔子预充氧 5 分钟。静脉注射咪达唑仑 （0.3 mg/kg） 和异丙酚 （10 mg/kg） 进行共诱导期。
3. 用 3.0-3.5 气管插管给兔子插管，气肺通气，连接到连接到呼吸机的半封闭圆形回路，新鲜气体流量为 1 L/min，最初 5 分钟，随后设置为 0.5 L/min。
   1. 通过吸入浓度为 3%-3.5% 的七氟烷在蒸发器上进行维持麻醉。
4. 在整个手术过程中，通过耳朵的边缘静脉向麻醉的兔子连续输注林格氏乳酸溶液 （2-4 mL/kg/h）。
   1. 使用保护性眼药膏保护眼表。
5. 全身麻醉监测：用直肠温度计监测 38.7-39.7 °C 的温度，检查粘膜颜色，用兔脉搏血氧仪监测 O₂饱和度 >95% 和心率 180-240 bpm。
6. 放置热支架，使动物在整个过程中保持恒定温度。
7. 静脉内给予酮咯酸 （1.5 mg/kg） 加曲马多 （3 mg/kg） 进行术中镇痛。
8. 手术前和手术后 5 天皮下注射抗生素（7.5 mg/（kg∙day） 恩诺沙星皮下注射 [sc]），以及术后镇痛（10 μg/（kg∙day） 丁丙诺啡皮下注射 5 天。
9. 将兔子置于仰卧位，剃掉动物的后肢和腹股沟区域。将动物置于背侧/仰卧位，剪掉后肢和腹股沟区域的毛发。
10. 通过在先前剃过的皮肤上涂抹 0.5% 氯己定和 70% 乙醇来进行皮肤消毒。消毒该区域后，用无菌布盖住兔子，左后肢除外。

2. 腘窝血管淋巴结切除术（图1）

1. 皮内浸润 0.2-0.3 mL 吲哚菁绿 （ICG） 在左后肢的第二和第三指间间隙。按摩、轻轻弯曲并伸展后肢几分钟，以促进染料吸收到淋巴管中。使用对侧肢体作为对照。
2. 使用实时近红外荧光相机可视化和标记（使用手术标记）在膝盖水平交叉的淋巴管和皮肤上的腘淋巴结 （PLN）（图 2）。
3. 将专利蓝色 V （0.2 mL） 注射到指间区域，以便随后识别淋巴管和淋巴结。
4. 使用实时近红外荧光相机识别 PLN 后（图 3），在腘窝中心创建一个 2 厘米的切口，纵向通过坐骨静脉与后肢长轴相连，可通过皮肤看到。
   1. 要使用实时近红外荧光相机获得淋巴系统的实时全景图像，请使用配备 1 类激光的光学头作为激发光源和近红外敏感相机，从动物后肢的脚踝到膝盖。
   2. 通过切除皮下脂肪，可视化肌肉筋膜上方的淋巴管⁵.由于步骤 2.3 中的专利蓝色 V 染色，淋巴管呈蓝色。
   3. 使用显微外科手术钳拉伸切口并暴露 PLN，包括血管和传入淋巴蒂。确保所有淋巴和血管结构清晰可见（图 4）。
   4. 确定直径为 0.8 毫米的 PLN，位于坐骨静脉下方以及股二头肌和内侧腘绳肌之间。
5. 确定 PLN 内侧的两个主要淋巴管。这些血管平行于远端大隐静脉，并在接近 PLN 时分成微血管网络（图5）。
6. 解剖淋巴结蒂，同时避免损伤周围组织和血管（图6）。
7. 使用 10/0 尼龙不可吸收缝合线在远端和近端连接内侧动脉（腘动脉的一个分支）和外侧隐静脉。
8. 识别并烧灼直接加入大腿内股骨淋巴系统但不进入 PLN 的两组传入淋巴管（图7）。
   注意：第一组对应于从大腿和小腿排出淋巴液的内侧传入淋巴管。第二组由下肢肌肉组织中的淋巴管组成。这些血管沿着腓肠肌和大隐静脉延伸。
9. 通过重复实时近红外荧光成像来确认淋巴系统完全破坏。
10. 完全去除周围的脂肪组织，以避免可能的淋巴管生成。
11. 使用 4-0 聚乙醇酸 （PGA） 可吸收编织缝合线（用 16 毫米 3/8 三角针）使用连续皮内模式缝合皮肤切口，以避免术后自动残缺。
12. 手术后将兔子单独关在笼子里;将它们置于 16 至 22 °C 的室温下。

3. 术后评估

1. 在诱导后 3、6 和 12 个月进行术后评估。
2. 按照以前使用的步骤（步骤 1.2-1.7）麻醉兔子。
3. 用卷尺测量麻醉兔子后肢的周长。每 2 厘米测量一次，第一个点在脚踝处，最后一个点在膝盖处。使用截断锥公式计算总体积。
4. 使用吲哚菁绿淋巴造影 （ICG-L） 评估淋巴功能。
   1. 将 0.2-0.3 mL ICG 皮内渗入第二和第三指间，轻轻按摩 1 分钟以促进 ICG 摄取到淋巴管中。
5. 使用近红外荧光系统在 15 分钟后收集图像以评估皮肤回流。
6. 随访完成后，按照与干预中使用的相同的麻醉方案对兔子实施安乐死。一旦达到所需的麻醉平面，以平均 2 meq/kg 的速度静脉注射氯化钾到耳静脉中。

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结果

在这项研究中，9 只兔子接受了淋巴水肿诱导，然而，3 只兔子在术后即刻死亡，无法评估。研究数据由三名独立研究人员在术后 3 、 6 和 12 个月获得。在全身麻醉下进行后肢圆周测量和 ICG-L，以评估淋巴系统功能和皮肤回流。

ICG-L 在术后 3 个月获得的数据显示兔子左后肢皮肤回流和不存在 PLN，与正常淋巴系统功能的破坏相符。术后 6 个月和 12 个月...

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讨论

在实验动物中切除 PLN 是一种相对较新的手术，可在肢体中诱导继发性淋巴水肿以进行评估和研究。淋巴结切除术后，有一段时间的淋巴系统功能改变、淋巴液积聚和淋巴管的组织学变化，表现为扩张。当这种淋巴液积聚达到足够的水平时，可以使用 ICG-L 等客观技术观察到类似于在人类中观察到的淋巴水肿的特征性皮肤回流。这项技术的发展可能会创造出一种具有成本效...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bleu Patente V sodique (Guerbet)	Guerbet. Villepinte, France		2.5 g/100 mL
Buprenorphine (Bupaq)	Richter Pharma. Wels, Austria	0820645AA	3 mg/10 mL
Fluobeam	Fluoptics. Grenoble, France		Fluorescence imaging
IBM SPSS software	IBM	version 21.0
Indocyanine green (Verdye, Diagnostic Green GmbH)	Diagnostic Green GmbH. Aschheim-Dornach, Germany		5 mg/mL
Ketorolaco  (Normon)	Normon, S.A. Madrid, Spain	T01H	30 mg/mL
Microsoft Excel	Microsoft	version 16.66.1
Midazolam (Normon)	Normon, S.A. Madrid, Spain	T35M	15 mg/3 mL
Pentero 800 microscope, fluorescence module	Carl Zeiss Meditec AG. Goeschwitzer Strasse 51-52. Jena, Germany	302581-9245-000
Potassium chloride (Braun)	B.Braun. Barcelona, Spain	19262010	20 mmol/10 mL
Propofol (Propomitor, Orion Pharma)	Orion Pharma. Spoo, Finland	20R039B	200 mg/20 mL
RÜSCH endotracheal tubes	Teleflex Medical IDA Business and Technology Park. Athione, Ireland.	12CE 12	Size Tube 4.0 I.D. mm
Sevoflurano (SevoFlo, Zoetis)	Zoetis Belgium. Luvain-la-Neuve, Belgium	6093559	1000 mg/g (250 mL)
Tramadol (Normon)	Normon, S.A. Madrid, Spain	T08U	100 mg/2 mL