JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь описана хирургическая индукция стабильно приобретенной лимфедемы в задней конечности кролика. Это экспериментальное животное может быть использовано для дальнейшего изучения эффекта лечения лимфедемы микрохирургическими методами.

Аннотация

Лимфедема является распространенным заболеванием, часто связанным с раком и его лечением, которое приводит к повреждению лимфатической системы, и современные методы лечения в основном являются паллиативными, а не лечебными. Его высокая частота среди онкологических больных указывает на необходимость изучения как нормальной лимфатической функции, так и патологической дисфункции. Для воспроизведения хронической лимфедемы необходимо выбрать подходящее экспериментальное животное. Попытки создания животных моделей ограничены регенеративной способностью лимфатической системы. Среди потенциальных кандидатов задняя конечность кролика проста в обращении и экстраполируется на клинический сценарий человека, что делает ее выгодной. Кроме того, размеры этого вида позволяют лучше подбирать лимфатические сосуды для васкуляризированной резекции лимфатических узлов.

В данном исследовании мы представляем процедуру резекции сосудистых лимфатических узлов в задней конечности кролика для индуцирования вторичной лимфедемы. Животные, находящиеся под наркозом, подвергались окружным измерениям, инфильтрации патентованным синим V и индоцианиновой зеленой лимфографии (ICG-L) с использованием флуоресценции ближнего инфракрасного диапазона в реальном времени, метода, который позволяет идентифицировать отдельные подколенные узлы и лимфатические каналы. Доступ к выявленным структурам достигается путем иссечения подколенного узла и лигирования медиальной и латеральной афферентных лимфатических лимфатических лимфок. Особое внимание следует уделять тому, чтобы любой лимфатический сосуд, который присоединяется к бедренной лимфатической системе в бедре, не входя в подколенный узел, мог быть идентифицирован и перевязан.

Послеоперационная оценка проводилась через 3, 6 и 12 месяцев после индукции с использованием окружных измерений задней конечности и ICG-L. Как было продемонстрировано во время наблюдения, у животных развился кожный обратный поток, который сохранялся до12-го месяца, что делает это экспериментальное животное полезным для новых долгосрочных оценок в лечении лимфедемы. В заключение следует отметить, что описанный здесь подход является осуществимым и воспроизводимым. Кроме того, в течение представленного временного окна он может быть репрезентативным для лимфедемы человека, тем самым обеспечивая полезный исследовательский инструмент.

Введение

Лимфедема является хроническим заболеванием, которое заслуживает особого внимания в связи с его распространенностью во всем мире, отсутствием излечивающего и стандартизированного лечения и серьезным влиянием на качество жизни пациентов 1,2.

В развитых странах лимфедема является в основном приобретенной и вторичной по отношению к раку молочной железы из-за высокой распространенности этого злокачественного новообразования; Кумулятивная заболеваемость лимфедемой, связанной с раком молочной железы, через 10 лет после операции может достигать 41,1%3. Тем не менее, такие заболевания, как меланома, гинекологический рак, опухоли мочеполовой системы, новообразования головы и шеи, также связаны с высокой частотой этого заболевания4. Регионарная резекция лимфатических узлов, как часть необходимого онкологического лечения для повышения выживаемости, приводит к нарушению функционального лимфодренажа. В некоторых случаях это приводит к появлению компенсаторных механизмов, которые предотвращают или задерживают начало лимфедемы5. Однако при назначении химиотерапии и лучевой терапии эти механизмы не могут компенсировать изменение, и в результате возникает лимфедема. Это оказывает негативное влияние на качество жизни пациентов, отражаясь на их функциональном, социальном и психологическом благополучии 6,7.

Потребность в эффективном лечении лимфедемы требует понимания физиопатологии лимфатической системы, а также глубокого проникновения в сложные клеточные механизмы и их реакцию как в нормальной, так и в дисфункциональной лимфатической системе 8,9,10. Такие выводы могут быть получены первоначально на экспериментальных животных моделях, способных воспроизводить хронические заболевания человека.

Было предпринято много попыток воспроизвести лимфедему на экспериментальных животных моделях; Тем не менее, большинству из них препятствовали некоторые ограничения, в том числе невозможность воспроизвести хроническую лимфатическую недостаточность в стабильной животной модели, затраты на исследование и, что самое главное, большая регенеративная способность лимфатической системы, которая позволяет ей восстанавливатькровообращение.

В этом исследовании представлен экспериментальный подход к хирургическому индуцированию стабильной приобретенной лимфедемы с использованием задней конечности кролика. Исходя из обзора литературы, это животное можно считать оптимальным для развития лимфедемы из-за последовательной анатомии его лимфатической системы задних конечностей, которая включает в себя один подколенный узел, который дренирует заднюю конечность и достигает основной бедренной лимфатической системы в ноге14,15.

Специфическая анатомия задней конечности кролика позволяет воспроизводить хирургические процедуры, выполненные у людей для индуцирования вторичной лимфедемы. Таким образом, эта процедура может быть использована для микрохирургического обучения и доклинических исследований для экстраполяции результатов на медицину человека.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все процедуры были одобрены этическим комитетом Центра минимально инвазивной хирургии им. Хесуса Усона и руководящими принципами благосостояния регионального правительства, которые основаны на европейском законодательстве.

1. Предоперационная и хирургическая подготовка

  1. Содержать девять самок новозеландских белых кроликов весом 4-4,5 кг и в возрасте 4 месяцев в отдельных клетках, содержащихся при температуре 22-25 °С, со свободным доступом к пище и воде. Убедитесь, что в клетках находится лоток из полисульфонового материала площадью 3 м2 и высотой 40 см, а также грядка с древесной стружкой.
    1. Идентифицируйте клетки с помощью кода проекта и идентификационного номера животного.
    2. Акклиматизируйте животных в течение 1 недели перед операцией, чтобы предотвратить проблемы, вызванные стрессом. Соберите предоперационные лабораторные данные образцов крови, чтобы убедиться, что каждое животное находится в хорошем состоянии здоровья до начала анестезии.
  2. Убедитесь, что все кролики соблюдают 12-часовое голодание перед каждой хирургической процедурой.
    1. После премедикации кроликов предварительно насытить кислородом с помощью лицевой маски (маски Холла) в течение 5 мин со 100% кислородом и потоком свежего газа 3-5 л/мин. Проводите фазу коиндукции с мидазоламом (0,3 мг/кг) и пропофолом (10 мг/кг) внутривенно.
  3. Интубируют кроликов с помощью 3,0-3,5 эндотрахеальных трубок, с пневмотапонированием, подключенных к полузамкнутому кольцевому контуру, соединенному с аппаратом искусственной вентиляции легких с потоком свежих газов со скоростью 1 л/мин в течение начальных 5 мин, а затем устанавливают на 0,5 л/мин.
    1. Проводят поддерживающую анестезию путем ингаляции севофлурана в концентрации 3%-3,5%, установленной на вапорайзере.
  4. Непрерывно вводите раствор лактата Рингера (2-4 мл/кг/ч) через краевую вену уха кроликам, находящимся под наркозом, на протяжении всей хирургической процедуры.
    1. Используйте защитную мазь для глаз для защиты глазной поверхности.
  5. Мониторинг общей анестезии: с помощью ректального термометра отслеживают температуру на уровне 38,7-39,7 °C, осматривают цвет слизистой оболочки, контролируют сатурациюO2на >95% и частоту сердечных сокращений на уровне 180-240 уд/мин с помощью пульсоксиметра кролика.
  6. Установите термоподставку, чтобы животное поддерживало постоянную температуру на протяжении всей процедуры.
  7. Введите кеторолак (1,5 мг/кг) и трамадол (3 мг/кг) внутривенно для интраоперационной анальгезии.
  8. Введение антибиотиков (7,5 мг/(кг∙сут) энрофлоксацина подкожно [подкожно]) до операции и через 5 дней после операции, а также послеоперационная анальгезия (10 мкг/(кг∙сут) бупренорфина в.к.) в течение 5 дней.
  9. Поместите кроликов в положение лежа на спине и побрейте задние конечности и паховые области животного. Поместите животное в положение лежа на спине/спине и подстригите шерсть с задних конечностей и паховой области.
  10. Проведите антисептическую обработку кожи, нанеся на ранее выбритую кожу 0,5% хлоргексидина и 70% этанола. После того, как участок будет продезинфицирован, накройте кролика стерильной тканью, за исключением левой задней конечности.

2. Операция по резекции подколенных сосудистых лимфатических узлов (Рисунок 1)

  1. Инфильтрат 0,2-0,3 мл индоцианина зеленого (ICG) внутрикожно во второе и третье межпальцевые пространства левой задней конечности. Помассируйте, мягко согните и вытяните заднюю конечность на несколько минут, чтобы облегчить всасывание красителя в лимфатические сосуды. Используйте контралатеральную конечность в качестве контрольной.
  2. Используйте флуоресцентную камеру ближнего инфракрасного диапазона в режиме реального времени, чтобы визуализировать и отметить (с помощью хирургического маркера) лимфатические сосуды, пересекающиеся на уровне колена, и подколенный лимфатический узел (PLN) на коже (рис. 2).
  3. Введите патентованный синий V (0,2 мл) в межпальцевую область для последующей идентификации лимфатических сосудов и лимфатических узлов.
  4. После того, как PLN будет идентифицирован с помощью флуоресцентной камеры в ближнем инфракрасном диапазоне в режиме реального времени (рис. 3), сделайте разрез шириной 2 см в центре подколенной ямки, продольный по отношению к длинной оси задней конечности через седалищную вену, которая видна через кожу.
    1. Для получения панорамных изображений лимфатической системы в режиме реального времени с помощью флуоресцентной камеры ближнего инфракрасного диапазона в реальном времени используйте оптическую головку, оснащенную лазером класса 1 в качестве источника возбуждающего света, и чувствительную камеру ближнего инфракрасного диапазона, от лодыжки до колена задней конечности животного.
    2. Визуализируйте лимфатические сосуды над мышечной фасцией путем резекции подкожного жира5. Лимфатические сосуды выглядят синими из-за патентованного окрашивания в синий цвет V на шаге 2.3.
    3. Используйте микрохирургические щипцы для растяжения разреза и обнажения PLN, включая сосудистые и афферентные лимфатические ножки. Обеспечьте четкую видимость всех лимфатических и сосудистых структур (Рисунок 4).
    4. Определите PLN диаметром 0,8 мм под седалищной веной и между бицепсом бедра и медиальными мышцами подколенного сухожилия.
  5. Определите два основных лимфатических сосуда на медиальной поверхности ПЛН. Эти сосуды расположены параллельно дистальному отделу подкожной вены и по мере приближения к PLN разделяются на сеть микрососудов (рис. 5).
  6. Рассекайте ножку лимфатического узла, избегая при этом повреждения окружающих тканей и сосудов (рисунок 6).
  7. Перевязать медиальную артерию (ветвь подколенной артерии) и латеральную подкожную вену дистально и проксимально с помощью нейлоновых нерассасывающихся швов 10/0.
  8. Определите и прижгите две группы афферентных лимфатических сосудов, которые непосредственно присоединяются к бедренной лимфатической системе в бедре, но не входят в PLN (рис. 7).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Первая группа соответствует медиальным афферентным лимфатическим сосудам, которые дренируют лимфу из верхней части ноги и голени. Вторую группу составляют лимфатические сосуды в области мускулатуры нижних конечностей. Эти сосуды проходят вдоль икроножной мышцы, вместе с подкожной веной.
  9. Подтвердите полное нарушение работы лимфатической системы путем повторения флуоресцентной визуализации в ближнем инфракрасном диапазоне в режиме реального времени.
  10. Полностью удалите окружающую жировую ткань, чтобы избежать возможного лимфангиогенеза.
  11. Сшивайте разрез кожи рассасывающимися плетеными нитями 4-0 полигликолевой кислоты (ПГА) (с треугольной иглой 16 мм 3/8) с использованием непрерывного внутрикожного рисунка, чтобы избежать послеоперационного аутоукаличного вмешательства.
  12. После операции кроликов размещают по отдельности в клетках; держать их под наблюдением и при комнатной температуре от 16 до 22 °C.

3. Послеоперационная оценка

  1. Проведите послеоперационное обследование через 3, 6 и 12 месяцев после индукции.
  2. Обезболите кроликов, следуя выполненным ранее шагам (шаги 1.2-1.7).
  3. Измерьте периметры задних конечностей кроликов, находящихся под наркозом, с помощью рулетки. Снимайте мерки через каждые 2 см, причем первая точка находится на щиколотке, а последняя — на колене. Рассчитайте общий объем по формуле усеченного конуса.
  4. Используйте индоцианиновую зеленую лимфографию (ICG-L) для оценки лимфатической функции.
    1. Инфильтрируйте 0,2-0,3 мл ICG внутрикожно во второе и третье межпальцевые пространства и мягко массируйте в течение 1 минуты, чтобы облегчить всасывание ICG в лимфатические сосуды.
  5. Соберите изображения через 15 минут с помощью флуоресцентной системы ближнего инфракрасного диапазона для оценки обратного потока в коже.
  6. После завершения последующего наблюдения усыпьте кролика, следуя тому же протоколу анестезии, который использовался при вмешательстве. Как только желаемый уровень анестезии будет достигнут, введите внутривенно хлорид калия в ушную вену в среднем 2 мг-экв/кг.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

В этом исследовании девять кроликов подверглись индукции лимфедемы, однако трое кроликов умерли в течение непосредственного послеоперационного периода и не могли быть оценены. Данные исследования были получены через 3, 6 и 12 месяцев после операции тремя независимыми...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Резекция PLN у экспериментального животного является относительно новой процедурой, которая может вызвать вторичную лимфедему в конечностях для оценки и изучения. После резекции лимфатических узлов наступает период изменения функциональности лимфатической системы...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Этот исследовательский проект был выполнен в Центре минимально инвазивной хирургии им. Хесуса Усона (CCMIJU), который является частью ICTS Nanbiosis. Исследование проводилось с использованием следующих установок Nanbiosis: U21, экспериментальная операционная, и U22, содержание животных. Эта работа была поддержана больницей Санта-Креу-и-Сант-Пау. Эта работа была частично профинансирована Junta de Extremadura, Европейским фондом регионального развития (грант No GR21201). Спонсор играл роль в планировании исследования, сборе данных, анализе, принятии решения о публикации и подготовке рукописи. Особая благодарность выражается Марии Перес за подготовку фигур и отделению микрохирургии JUMISC за постоянную поддержку.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Bleu Patente V sodique (Guerbet)Guerbet. Villepinte, France2.5 g/100 mL
Buprenorphine (Bupaq)Richter Pharma. Wels, Austria0820645AA3 mg/10 mL
FluobeamFluoptics. Grenoble, FranceFluorescence imaging
IBM SPSS softwareIBMversion 21.0
Indocyanine green (Verdye, Diagnostic Green GmbH)Diagnostic Green GmbH. Aschheim-Dornach, Germany5 mg/mL
Ketorolaco  (Normon) Normon, S.A. Madrid, SpainT01H30 mg/mL
Microsoft ExcelMicrosoftversion 16.66.1
Midazolam (Normon) Normon, S.A. Madrid, SpainT35M15 mg/3 mL
Pentero 800 microscope, fluorescence moduleCarl Zeiss Meditec AG. Goeschwitzer Strasse 51-52. Jena, Germany302581-9245-000
Potassium chloride (Braun)B.Braun. Barcelona, Spain1926201020 mmol/10 mL
Propofol (Propomitor, Orion Pharma) Orion Pharma. Spoo, Finland20R039B200 mg/20 mL
RÜSCH endotracheal tubesTeleflex Medical IDA Business and Technology Park. Athione, Ireland.12CE 12Size Tube 4.0 I.D. mm
Sevoflurano (SevoFlo, Zoetis)Zoetis Belgium. Luvain-la-Neuve, Belgium60935591000 mg/g (250 mL)
Tramadol (Normon)Normon, S.A. Madrid, SpainT08U100 mg/2 mL

Ссылки

  1. Taylor, G. W. Lymphoedema. Postgraduate Medical Journal. 35 (399), 2-7 (1959).
  2. Weissleder, H., Schuchhardt, C. Lymphedema Diagnosis and Therapy. 2nd ed. , Kagerer Kommunikation. (1997).
  3. Pereira, A. C. P. R., Koifman, R. J., Bergmann, A. Incidence and risk factors of lymphedema after breast cancer treatment: 10 years of follow-up. The Breast. 36, 67-73 (2017).
  4. Coriddi, M., et al. Systematic review of patient-reported outcomes following surgical treatment of lymphedema. Cancers. 12 (3), 565(2020).
  5. Fernández Peñuela, R., Casaní Arazo, L., Masiá Ayala, J. Outcomes in vascularized lymph node transplantation in rabbits: A reliable model for improving the surgical approach to lymphedema. Lymphatic Research and Biology. 17 (4), 413-417 (2019).
  6. Armer, J. M., et al. ONS GuidelinesTM for cancer treatment–related lymphedema. Oncology Nursing Forum. 47 (5), 518-538 (2020).
  7. Villanueva, T. Avoiding lymphedema. Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 121(2014).
  8. Clavin, N. W., et al. TGF-β 1 is a negative regulator of lymphatic regeneration during wound repair. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 295 (5), 2113-2127 (2008).
  9. Schulte-Merker, S., Sabine, A., Petrova, T. V. Lymphatic vascular morphogenesis in development, physiology, and disease. The Journal of Cell Biology. 193 (4), 607-618 (2011).
  10. Padberg, Y., Schulte-Merker, S., Van Impel, A. The lymphatic vasculature revisited—new developments in the zebrafish. Methods in Cell Biology. 138, 221-238 (2017).
  11. Cornelissen, A. J. M., et al. Outcomes of vascularized versus non-vascularized lymph node transplant in animal models for lymphedema. Review of the literature. Journal of Surgical Oncology. 115 (1), 32-36 (2017).
  12. Hadamitzky, C., Pabst, R. Acquired lymphedema: An urgent need for adequate animal models. Cancer Research. 68 (2), 343-345 (2008).
  13. Shin, W. S., Szuba, A., Rockson, S. G. Animal models for the study of lymphatic insufficiency. Lymphatic Research and Biology. 1 (2), 159-169 (2003).
  14. Soto-Miranda, M. A., Suami, H., Chang, D. W. Mapping superficial lymphatic territories in the rabbit. Anatomical Record. 296 (6), 965-970 (2013).
  15. Bach, C., Lewis, G. P. Lymph flow and lymph protein concentration in the skin and muscle of the rabbit hind limb. The Journal of Physiology. 235 (2), 477-492 (1973).
  16. Mayer, J. Use of behavior analysis to recognize pain in small mammals. Lab Animal. 36 (6), 43-48 (2007).
  17. Jones-Bolin, S. Guidelines for the care and use of laboratory animals in biomedical research. Current Protocols in Pharmacology. 59 (1), 4(2012).
  18. Hawkins, P. Recognizing and assessing pain, suffering and distress in laboratory animals: a survey of current practice in the UK with recommendations. Laboratory Animals. 36 (4), 378-395 (2002).
  19. Kohn, D. F., et al. Public statement: Guidelines for the assessment and management of pain in rodents and rabbits. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 46 (2), 97-108 (2007).
  20. Wolfe, J. H., Rutt, D., Kinmonth, J. B. Lymphatic obstruction and lymph node changes–a study of the rabbit popliteal node. Lymphology. 16 (1), 19-26 (1983).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

Patent Blue VICG L

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены