使用延时显微镜和蛋白质的阶段特异性核耗竭来研究酿酒酵母的减数分裂

摘要

延时显微镜是研究出芽酵母减数分裂的宝贵工具。该协议描述了一种结合细胞周期同步，延时显微镜和目标蛋白的条件耗竭的方法，以证明如何在减数分裂染色体分离期间研究特定蛋白质的功能。

摘要

延时荧光显微镜通过提供成像固定细胞通常看不到的时间和空间数据，彻底改变了对减数分裂细胞周期事件的理解。芽酵母已被证明是研究减数分裂染色体分离的重要模式生物，因为许多减数分裂基因是高度保守的。出芽酵母减数分裂的延时显微镜可以监测不同的减数分裂突变体，以显示突变如何破坏减数分裂过程。然而，许多蛋白质在减数分裂的多个点起作用。因此，使用功能丧失或减数分裂零突变体会破坏早期过程，阻断或干扰后期过程，并且难以确定与每个个体角色相关的表型。为了规避这一挑战，该协议描述了如何在减数分裂的特定阶段有条件地从细胞核中耗尽蛋白质，同时使用延时显微镜监测减数分裂事件。具体来说，该协议描述了细胞如何在前期I中同步，如何使用锚移技术在特定减数分裂阶段从细胞核中去除蛋白质，以及如何使用延时成像来监测减数分裂染色体分离。作为该技术实用性的一个例子，在减数分裂期间的不同时间点从细胞核中去除了动粒蛋白Ctf19，并在减数分裂II结束时分析染色质质量的数量。总体而言，该方案可以适应于从细胞核中消耗不同的核蛋白，同时监测减数分裂。

引言

延时荧光显微镜是研究出芽酵母^1，2中减数分裂染色体分离动力学的宝贵工具。通过饥饿关键营养素，可以诱导出芽酵母细胞发生减数分裂³。在减数分裂过程中，细胞经历一轮染色体分离，然后进行两次分裂，产生四种减数分裂产物，这些产物被包装成孢子（图1）。可以在减数分裂的每个阶段可视化单个细胞，从而生成固定细胞成像很容易错过的空间和时间数据。该协议显示了如何将延时荧光显微镜与两种先前建立的方法（诱导NDT80系统（NDT80-in）和锚移技术相结合，可用于研究不同减数分裂阶段特定蛋白质的功能。

NDT80-in系统是减数分裂细胞周期同步的强大工具，它依赖于中间减数分裂转录因子NDT80 4，⁵的诱导表达。第一阶段^出口6，7需要NDT80表达。使用NDT80-in系统，NDT80在表达与雌激素受体（ Gal4-ER^）融合的Gal4转录因子的细胞中的GAL1-10启动子的控制下4，⁵。由于Gal4-ER仅在与β-雌二醇结合时才进入细胞核，因此NDT80-in细胞在没有β-雌二醇的情况下在前期I中停滞，这允许前期I中的细胞同步（图1）。β-雌二醇加成促进Gal4-ER转录因子易位到细胞核中，在那里它结合GAL1-10以驱动NDT80的表达，导致同步进入减数分裂。虽然延时显微镜可以在没有同步的情况下进行，但使用同步的优点是能够在细胞处于减数分裂的特定阶段时添加抑制剂或药物。

锚移技术是一种可诱导系统，通过该系统，可以通过添加雷帕霉素⁸从细胞核中去除蛋白质。该技术非常适合在出芽酵母的细胞分裂过程中研究核蛋白，因为酵母细胞经历闭合的有丝分裂和减数分裂，其中核包膜不会分解。此外，该技术对于在整个减数分裂中具有多种功能的蛋白质非常有用。与缺失、突变等位基因或减数分裂无效等位基因不同，在特定阶段从细胞核中去除靶蛋白不会损害早期靶蛋白活性，从而可以更准确地解释结果。锚移系统利用核糖体成熟时核和细胞质之间核糖体亚基的穿梭^8。为了从细胞核中去除靶蛋白，在核糖体亚基Rpl13A用FKBP12标记的菌株中用FKBP12标记靶蛋白12-雷帕霉素结合结构域（FRB）标记靶蛋白。没有雷帕霉素，FRB和FKBP12不会相互作用，FRB标记的蛋白质保留在细胞核中。雷帕霉素加成后，雷帕霉素与FKBP12和FRB形成稳定的复合物，并且由于与Rpl13A的相互作用，复合物从细胞核中穿梭出来（图1）。为了防止雷帕霉素加成后的细胞死亡，细胞含有TOR1基因的tor1-1突变。此外，这些细胞含有 fpr1Δ，这是酿酒酵母 FKBP12 蛋白的空等位基因，可防止内源性 Fpr1 在 FRB 和雷帕霉素结合方面竞争 Rpl13A-FKBP12。锚定背景突变，tor1-1和fpr1Δ，不影响减数分裂时间或染色体分离²。

为了证明该技术的有效性，动粒蛋白Ctf19在整个减数分裂过程中的不同时间点耗尽。Ctf19是动粒的一种成分，在有丝分裂中是可有可无的，但在减数分裂9，10，11，^12，13中适当的染色体分离是必需的。在减数分裂中，动粒在前期I脱落，Ctf19对动粒^{重新组装很重要}9^，14。对于该协议，具有NDT80-in系统的细胞是同步的，并且使用锚移技术在前期I释放之前和之后以及减数分裂I染色体分离之后从细胞核中去除靶蛋白Ctf19（图1）。该协议可以适应在减数分裂和有丝分裂的任何阶段消耗其他感兴趣的蛋白质。

研究方案

1. 准备必要的材料

1. 准备酵母细胞生长和孢子形成的试剂。
   注意:如果出芽酵母菌株是 ade2 -和 trp1-，则在步骤1.1.1-1.1.3中补充所有培养基，终浓度为0.01%腺嘌呤和0.01%色氨酸。如果通过高压灭菌器灭菌培养基，则仅在试剂高压灭菌并冷却至室温后添加这些氨基酸。
   1. 对于营养生长，通过将 6.7 g 不含氨基酸的酵母氮碱、2 g 完全氨基酸混合物和 20 g 葡萄糖溶解在 500 mL 水中来制备 2x 合成完全 + 葡萄糖培养基 （2XSC）。通过在121°C高压灭菌20分钟或通过0.2μm过滤器过滤来灭菌混合物。
   2. 对于孢子形成的第一步，通过将 6.7 g 不含氨基酸的酵母氮碱、2 g 完全氨基酸混合物和 20 g 乙酸钾溶解在 500 mL 水中来制备 2x 合成完全 + 乙酸盐培养基 （2XSCA）。通过在121°C高压灭菌20分钟或通过0.2μm过滤器过滤来灭菌混合物。
   3. 对于孢子形成的最后一步，通过将 5 g KAc 溶解在 500 mL 水中来制备 1% 乙酸钾 （1% KAc）。通过在121°C高压灭菌20分钟或通过0.2μm过滤器过滤来灭菌混合物。
2. 准备用于显微镜检查、同步和锚定的药物和试剂。
   1. 为了在延时成像期间将细胞粘附到盖玻片上，在 1x PBS 中制备 1 mg/mL 刀豆球蛋白 A （ConA）。使用0.2μm过滤器过滤灭菌，并将小（~10μL）等分试样储存在-20°C。
   2. 要使用 NDT80-in系统，将2 mL的1 mM β-雌二醇溶解在乙醇中。使用0.2μm过滤器过滤灭菌，并将等分试样（~500μL）储存在-20°C。
   3. 对于锚定离开系统，将 1 mg/mL 的雷帕霉素溶解在 DMSO 中。使用0.2μm过滤器过滤灭菌，并将小（~10μL）等分试样储存在-20°C。
      注意:准备少量雷帕霉素，以避免药物的多次冻融循环。
3. 生成含有NDT80-in系统的酵母菌株（P GAL1，10-NDT80/P_{GAL1，10-NDT80};GAL4-ER / GAL4-ER）和锚定遗传背景中用FRB标记的靶蛋白（tor1-1 / tor1-1; fpr1Δ/ fpr1Δ;Rpl13A-FKBP12/Rpl13A-FKBP12）^4，8.本研究使用了Ctf19-FRB。此外，用mCherry标记组蛋白Htb2的一个拷贝，以监测减数分裂进展和染色质分离。
4. 为延时成像准备腔室
   1. 在成像前6小时-24小时开始准备腔室（图2）。使用加热的手术刀或其他锋利的刀片从移液器吸头盒插入物上切下 18 mm x 18 mm 的腔室。
   2. 使用塑料移液器吸头在腔室的底部边缘涂上一层薄薄的硅酮密封胶，以粘附在盖玻片上。添加足够的密封剂，使腔室的边缘完全覆盖（见 图2）。
   3. 将腔室轻轻地将密封剂面朝下放在盖玻片上，将腔室粘附在 24 mm x 50 mm 盖玻片上。确保密封剂中没有间隙，以免腔室泄漏。
   4. 将 8-10 μL ConA 涂抹在盖玻片上。将ConA分配到盖玻片的中间，并使用移液器吸头将ConA铺成薄薄的一层，使其覆盖被腔室包围的大部分盖玻片。
      注意:塑料腔可以无限期地重复使用。延时成像完成后，使用剃须刀从盖玻片上取下腔室，从腔室中清洁硅酮密封剂，并将腔室浸没在 95% 乙醇中以备将来使用。

2. 酵母细胞的孢子化

1. 执行以下步骤使酵母细胞饥饿以诱导减数分裂程序。
   注意:这些步骤适用于W303酵母菌株的孢子化。其他菌株可能需要不同的方案¹⁵。不同菌株的孢子形成效率差异很大，W303的孢子形成效率为~60%¹⁶，^17，18。
   1. 从平板中取出适当的二倍体酵母菌株的单个菌落，接种2mL的2XSC，并在滚筒上以30°C生长12-24小时至饱和。
   2. 通过将步骤 2.1.1 中的 80 μL 培养物添加到 2 mL 的 2XSCA 中，将饱和培养物稀释到 2XSCA 中。让它在滚筒上在30°C下生长12-16小时。不要在2XSCA中放置超过16小时，因为细胞会生病或发出自发荧光。
   3. 通过在室温（25°C）下以800× g 旋转培养物1分钟，丢弃液体，然后将沉淀重悬于2mL无菌蒸馏水中来进行两次洗涤。
   4. 第二次洗涤后，除去液体并将沉淀重悬于2mL的1%KAc中，使其在滚筒上于25°C生长8-12小时。进入减数分裂的细胞将在前期I的厚皮烯中停滞。
2. 第一阶段放行系统
   1. 将β-雌二醇直接添加到孢子培养物中至终浓度为1μM并快速涡旋培养管。β-雌二醇将从前期I释放细胞。

3. 使用锚移技术从细胞核中去除靶蛋白

1. 将雷帕霉素添加到细胞中以在特定阶段从细胞核中去除FRB标记的蛋白质。
   1. 为了在前期I出口时从细胞核中去除蛋白质，在添加β-雌二醇的同时，将雷帕霉素的终浓度为1μg/mL添加到孢子培养管中。
   2. 为了在减数分裂的特定阶段从细胞核中去除蛋白质，请在添加β-雌二醇后60分钟开始监测细胞周期阶段。每 20 分钟，将 5 μL 培养物移液到 24 mm x 40 mm 盖玻片上，并用 18 mm x 18 mm 盖玻片覆盖细胞。在时间点之间保持培养物在25°C的辊筒上旋转。
   3. 使用A594 / mCherry滤光片和荧光显微镜的60倍物镜对细胞进行成像。将透射率百分比设置为 2%，将曝光时间设置为 250 ms。一个、两个或四个DNA质量的存在将表明细胞进展的减数分裂阶段。在感兴趣的减数分裂阶段加入雷帕霉素至终浓度为1μg/ mL。
2. 保持细胞在25°C的滚筒上旋转，直到它们准备好成像。在雷帕霉素加注^2，8后30-45分钟发生靶蛋白的核耗竭。

4. 延时荧光显微镜

1. 制作一个琼脂垫，用于创建用于成像的单层细胞（参见步骤4.2）。
   1. 切下并丢弃 1.5 mL 微量离心管的盖子和底部 1/3 以形成圆柱体。圆筒将用作琼脂垫的模具。制作两个圆筒，以防琼脂在第一个圆筒中不能正确聚合。
   2. 将切割的微量离心管筒放在干净的载玻片上，管的顶部倒置在载玻片上。
   3. 在 50 mL 烧杯中制作 6 mL 的 5% 琼脂溶液（使用 1% KAc 作为溶剂），并用微波炉加热直至琼脂完全溶解。
      注意:琼脂在微波炉中很容易沸腾;观察琼脂，当琼脂开始沸腾并旋转烧杯时，启动和停止微波炉。启动和停止微波炉几次以完全溶解琼脂。琼脂溶液的量超过确保琼脂完全溶解所需的量。
   4. 切下移液管的尖端以形成更大的开口，并将~500μL融化的琼脂移液到每个微量离心管筒中。让它在室温下静置，直到琼脂凝固（~10-12分钟）。
2. 制备用于成像的酵母细胞
   1. 在 1 mL 微量离心管中以 800 x g 离心 200 μL 从步骤 3.2 旋转 2 μL 孢子培养物 2 分钟。取出并弃去 180 μL 上清液。通过旋转和轻弹试管将沉淀重悬于剩余的上清液中。
   2. 将 6 μL 浓缩细胞移液到步骤 1.4 中制成的腔室中间的盖玻片上。
   3. 用步骤4.1中制作的琼脂垫握住圆筒，然后小心地将其从载玻片上滑下。确保琼脂底部完全平坦，并使用移液器吸头的底部，对微量离心模具施加轻微的压力，使琼脂垫略高于管的边界。
   4. 倒置模具，使琼脂垫朝下朝向腔室。
   5. 使用镊子，轻轻地将琼脂垫（仍在微量离心管模具中）放在细胞顶部。使用移液器吸头在腔室周围轻轻滑动琼脂垫10-20次，以在盖玻片上形成单层细胞。
   6. 将琼脂垫留在腔室中12-15分钟。此步骤将允许细胞粘附在盖玻片上的ConA上。
   7. 将步骤 3.2 中的 2 mL 孢子培养物转移到两个微量离心管中，并以 15，700 x g 离心 2 分钟。将上清液转移到干净的微量离心管中，并以15，700× g 再次旋转2分钟。将上清液转移到干净的微量离心管中，以便在下一步中使用。
      注意:重要的是将预处理的KAc上清液与β-雌二醇和雷帕霉素一起使用，以确保有效孢子形成和目标蛋白质的持续消耗。
   8. 琼脂垫在腔室中放置12-15分钟后，漂浮并在成像前取出琼脂垫。为此，将步骤4.2.7中的2mL上清液滴加到腔室中。一旦液体到达腔室顶部，琼脂垫很可能会漂浮。
      注意:如果琼脂垫没有自动漂浮，请等待1-2分钟。如果琼脂垫仍然没有漂浮，请用镊子轻轻取出。理想情况下，琼脂垫会自行漂浮，因为在漂浮之前将其移除可能会导致细胞被移除。
   9. 琼脂垫漂浮后，用镊子轻轻取出并丢弃。将 24 mm x 50 mm 盖玻片放在腔室顶部，以防止成像过程中蒸发。
3. 在显微镜上设置视频
   注意:以下说明适用于装有载玻片支架的倒置显微镜，载玻片支架可容纳24 mm x 50 mm盖玻片（有关显微镜、相机和软件的详细信息，请参阅 材料表 ）。60倍油浸物镜用于图像采集。使用其他显微镜或其他载玻片支架时，可能需要更改此协议。执行步骤4.3.2至步骤4.3.16的确切步骤因所使用的显微镜和成像软件而异。有关不同显微镜的说明，请参见第4.4节。
   1. 将盖玻片安装在载玻片支架内。将成型粘土粘附在盖玻片的侧面，以将其牢固地固定在载玻片支架中。
   2. 打开图像采集软件。使用航向和微调旋钮使用 DIC 或明场聚焦细胞。
   3. 在图像采集软件的主菜单上，单击文件 >采集（Resolve 3D）。将弹出三个窗口。
   4. 在名为Resolve 3D的窗口中，单击 锥形瓶 图标。这将打开一个名为 "设计/运行实验"的窗口，其中包含用于设置实验以设置延时摄影影片的控件。
   5. 在 "设计 "选项卡下，导航到标有 "切片"的选项卡。选中 "Z 切片"旁边的框。按如下方式设置 z 堆栈:光学切片间距 = 1 μm，光学切片数 = 5，样品厚度 = 5.0 μm。
   6. 在 "频道 "选项卡下，单击 + 图标，以便显示一个频道选项。选择适当的通道。对于这个实验，我们选择A594，它用于对mCherry进行成像。选择参考图像旁边的框，然后从下拉菜单中将 Z 位置设置为样品的中间。
   7. 从 %T 和 Exp. 旁边的下拉菜单中选择一个值，分别设置透射率和曝光时间百分比。在本实验中，A594通道使用2%透射率和250 ms曝光时间，明场使用10%透射率和500 ms曝光时间。
      注意:曝光时间和透射率百分比因显微镜而异。为避免过度曝光，请使用尽可能低的透射率和最短的曝光时间，以便正确可视化感兴趣的蛋白质。
   8. 在"延时摄影"选项卡下，选中"延时摄影"旁边的框。在显示的表格中，在延时摄影行的最小列下输入 10，在总时间行的小时列下输入 10。这将运行一个时间过程，每 10 分钟拍摄一次图像，持续 10 小时。
   9. 选中"使用终极对焦保持对焦"旁边的框，以防止影片期间出现舞台漂移。在"点"选项卡下，选中"访问点列表"旁边的框。
   10. 在主菜单中，单击查看 >点列表。将弹出一个名为点列表的窗口。将载物台移动到显示单层细胞的腔室区域。单击点列表窗口中的 点标记 。
   11. 移动载物台以选择 25-30 个点，没有任何重叠，以避免单元格过度曝光。每个字段将在每个时间过程中成像。
   12. 在点列表窗口中，选择"全部校准"以为每个点设置最终焦点。在"设计/运行实验"窗口的"设计"选项卡下，在"访问点列表"旁边的框中输入点值范围（从点列表窗口获得）。在"运行"选项卡下，将文件保存到计算机上的相应目标。在"设计/运行实验"窗口中，选择"播放"按钮（绿色三角形图标）以启动影片。
4. 可选方法:在显微镜上设置短片
   注意:这些说明适用于装有载玻片支架的倒置显微镜，载玻片支架可容纳24 mm x 50 mm盖玻片。有关所用显微镜、相机和成像软件的规格，请参阅 材料表 。60倍油浸物镜用于图像采集。
   1. 将盖玻片安装在载玻片支架内。打开图像采集软件。使用航向和微调旋钮使用 DIC 或明场聚焦细胞。在软件打开的窗口中单击鼠标右键。将出现一个下拉菜单。
   2. 单击" 获取控制">"获取"。单击 应用程序>定义/运行实验。这将打开一个标记为 ND 采集的窗口。
   3. 在打开的窗口中，选中 XY 旁边的框。将舞台移动到所需位置，然后单击 "点名称" 下的框以选择该位置作为点。重复此操作，直到选择 25-30 个点而没有任何重叠，以避免单元格过度曝光。每个字段将在每个时间过程中成像。
   4. 设置每个荧光通道的透射率百分比。由于菌株产生 Htb2-mCherry，因此此处使用 mCherry 过滤器。在步骤 4.3.3 中打开的采集窗口下，导航到 555 nm 按钮。通过调整 555 nm 按钮下方的滑动比例，直到读数为 5%，将百分比透射率设置为 5%。
   5. 设置每个荧光通道的曝光时间。在 采集 窗口下，从曝光下拉菜单中选择 200 毫秒 。
      注意:曝光时间和透射率百分比因显微镜而异。为避免过度曝光，请使用尽可能低的透射率和最短的曝光时间，以便正确可视化感兴趣的蛋白质。
   6. 单击ND采集窗口中Z旁边的框。设置五个相距 1.2 μM 的酵母细胞 z 堆栈。
   7. 单击 λ 旁边的框。选择要用于实验的适当通道。对于 DIC，请确保从 Z pos 下的下拉菜单中选择 主页 。对于 mCherry，请确保从 Z pos 下的下拉菜单中选择 全部 。这可确保只有单个部分（在 z 堆栈的中间）用于 DIC。
   8. 在 ND 采集窗口中选中时间旁边的框。选中"阶段"下的框。在间隔下的下拉菜单中，选择 10 分钟。在"持续时间"下，选择 10 小时。这将运行时间过程，以便每 10 分钟拍摄一次图像，持续 10 小时。

5. 染色质分离分析

1. 打开斐济软件。一次打开一个视野:对于每个场，打开 DIC 和 mCherry 通道。
2. 采用 mCherry 通道的最大强度投影以获得单个图像:单击 图像> Z 项目的堆栈>， 从下拉菜单中选择 最大强度 。
3. 将DIC和mCherry通道合并到一个图像中:单击图像> 颜色>合并通道。
4. 跟随单个细胞通过减数分裂。减数分裂II完成后，记录DNA质量数。

结果

为了监测染色质分离，用mCherry标记组蛋白Htb2。在前期I中，染色质显示为单个Htb2肿块。同源染色体在第一次减数分裂中分离后，染色质显示为两个不同的肿块（图3A）。在姐妹染色单体分离后，染色质显示为四个肿块。如果某些染色体未能附着在纺锤体微管上，则在减数分裂I或减数分裂II后可以看到额外的肿块。

上述方法用于研究动粒成分 Ctf19 在确保?...

讨论

该协议结合了 NDT80-in系统以同步细胞，锚移技术以从细胞核中去除蛋白质，以及荧光延时显微镜以在减数分裂期间对出芽酵母细胞进行成像。 NDT80-in系统是一种用于减数分裂细胞周期同步的方法，它利用前期I阻滞和释放^4，8。尽管单个细胞在随后的每个减数分裂阶段所花费的时间略有不同，但大多数细胞将在整个减数分裂过程中保持高度?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
β-estradiol	Millipore Sigma	E8875	Make 1mM stocks in 95% EtOH
0.22 uM Threaded Bottle-top Filter	Millipore Sigma	S2GPT02RE
100% EtOH	Fisher Scientific	22-032-601
10X PBS	Fisher Scientific	BP399500	Dilute 1:10 to use as solvent for ConA
24 mm x 50 mm coverslip No. 1.5	VWR North American	48393241
25 mm x 75 mm microscope slides	VWR North American	48300-026
Adenine hemisulfate salt	Millipore Sigma	A9126	To supplement SC, SCA, and 1% Kac
Bacto Agar	BD	214030
Concanavialin A	Mllipore Sigma	C2010	Make as 1mg/mL in 1X PBS
CoolSNAP HQ2 CCD camera	Photometrics		Used in Section 4.3
D-glucose	Fisher Scientific	D16-10
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids	BD	291920
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Millipore Sigma	D5879
Eclipse Ti2 inverted-objective micrscope	Nikon		Used in Section 4.4
Fiji	NIH		Download from https://fiji.sc/
GE Personal DeltaVision Microscope	Applied Precision		Used in Section 4.3
L-Tryptophan	Millipore Sigma	T0254	To supplement SC, SCA, and 1% Kac
Modeling Clay	Crayola	2302880000	To secure coverslip in slide holder
NIS-Elements AR 5.30.04 Imaging Software	Nikon		Used in Section 4.4
ORCA-Fustion BT Camera	Hamamatsu	C15440-20UP	Used in Section 4.4
Plastic pipette tip holder	Dot Scientific	LTS1000-HR	Cut a 4 square x 4 square section of the rack portion of this product.
Pottassium Acetate	Fisher Scientific	BP264
Rapamycin	Fisher Scientific	BP29631	Make 1mg/mL stocks in DMSO
Silicone Sealant	Aqueon	100165001	Also known as aquarium glue.
SoftWorx7.0.0  Imaging Software	Applied Precision		Used in Section 4.3
Synthetic Complete Mixture (Kaiser)	Formedium	DSCK2500
Type N immersion oil	Nikon	MXA22166