Uso de microscopía de lapso de tiempo y agotamiento nuclear de proteínas en etapa específica para estudiar la meiosis en S. cerevisiae

Resumen

La microscopía de lapso de tiempo es una herramienta valiosa para estudiar la meiosis en levaduras en ciernes. Este protocolo describe un método que combina la sincronización del ciclo celular, la microscopía de lapso de tiempo y el agotamiento condicional de una proteína diana para demostrar cómo estudiar la función de una proteína específica durante la segregación cromosómica meiótica.

Resumen

La microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo ha revolucionado la comprensión de los eventos del ciclo celular meiótico al proporcionar datos temporales y espaciales que a menudo no se ven al obtener imágenes de células fijas. La levadura en ciernes ha demostrado ser un organismo modelo importante para estudiar la segregación cromosómica meiótica porque muchos genes meióticos están altamente conservados. La microscopía de lapso de tiempo de la meiosis en levaduras en ciernes permite el monitoreo de diferentes mutantes meióticos para mostrar cómo la mutación interrumpe los procesos meióticos. Sin embargo, muchas proteínas funcionan en múltiples puntos de la meiosis. Por lo tanto, el uso de mutantes nulos meióticos o de pérdida de función puede interrumpir un proceso temprano, bloqueando o perturbando el proceso posterior y dificultando la determinación de los fenotipos asociados con cada rol individual. Para eludir este desafío, este protocolo describe cómo las proteínas pueden agotarse condicionalmente del núcleo en etapas específicas de la meiosis mientras se monitorean los eventos meióticos utilizando microscopía de lapso de tiempo. Específicamente, este protocolo describe cómo se sincronizan las células en la profase I, cómo se utiliza la técnica de anclaje para agotar las proteínas del núcleo en etapas meióticas específicas y cómo se utilizan las imágenes de lapso de tiempo para monitorear la segregación cromosómica meiótica. Como ejemplo de la utilidad de la técnica, la proteína cinetocoro Ctf19 se agotó del núcleo en diferentes puntos de tiempo durante la meiosis, y el número de masas de cromatina se analizó al final de la meiosis II. En general, este protocolo se puede adaptar para agotar diferentes proteínas nucleares del núcleo mientras se monitorean las divisiones meióticas.

Introducción

La microcopia de fluorescencia time-lapse es una herramienta valiosa para estudiar la dinámica de la segregación cromosómica meiótica en levaduras en ciernes ^1,2. Las células de levadura en ciernes pueden ser inducidas a someterse a meiosis a través de la inanición de nutrientes clave³. Durante la meiosis, las células se someten a una ronda de segregación cromosómica seguida de dos divisiones para crear cuatro productos meióticos que se empaquetan en esporas (Figura 1). Las células individuales se pueden visualizar a lo largo de cada etapa de la meiosis, lo que genera datos espaciales y temporales que pueden pasarse por alto fácilmente mediante imágenes de células fijas. Este protocolo muestra cómo la combinación de microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo con dos métodos previamente establecidos, el sistema NDT80 inducible (NDT80-in) y la técnica de anclaje, se puede utilizar para estudiar la función de proteínas específicas en distintas etapas meióticas.

El sistema NDT80-in es una poderosa herramienta para la sincronización del ciclo celular meiótico que se basa en la expresión inducible del factor de transcripción de meiosis media NDT80 ^4,5. La expresión de NDT80 es necesaria para la salida ^6,7 de la profase I. Con el sistema NDT80-in, NDT80 está bajo el control del promotor GAL1-10 en células que expresan el factor de transcripción Gal4 fusionado a un receptor de estrógeno (Gal4-ER)^4,5. Debido a que Gal4-ER solo ingresa al núcleo cuando se une al β-estradiol, las células NDT80-in se detienen en la profase I en ausencia de β-estradiol, lo que permite la sincronización de las células en la profase I (Figura 1). β-estradiol promueve la translocación del factor de transcripción Gal4-ER en el núcleo, donde se une a GAL1-10 para impulsar la expresión de NDT80, lo que lleva a la entrada sincrónica en las divisiones meióticas. Aunque la microscopía de lapso de tiempo se puede realizar sin sincronización, la ventaja de usar la sincronización es la capacidad de agregar un inhibidor o un medicamento mientras las células se encuentran en una etapa específica de la meiosis.

La técnica de anclaje es un sistema inducible por el cual una proteína puede ser agotada del núcleo con la adición de rapamicina⁸. Esta técnica es ideal para estudiar las proteínas nucleares durante la división celular en levadura en ciernes porque las células de levadura sufren mitosis cerrada y meiosis, en las que la envoltura nuclear no se descompone. Además, esta técnica es muy útil para proteínas que tienen múltiples funciones a lo largo de la meiosis. A diferencia de las deleciones, alelos mutantes o alelos nulos meióticos, la eliminación de una proteína diana del núcleo en una etapa específica no compromete la actividad de la proteína diana en etapas anteriores, lo que permite una interpretación más precisa de los resultados. El sistema de anclaje utiliza el desplazamiento de subunidades ribosómicas entre el núcleo y el citoplasma que ocurre en la maduración ribosómica⁸. Para agotar la proteína diana del núcleo, la proteína diana se marca con el dominio de unión a rapamicina FKBP12 (FRB) en una cepa en la que la subunidad ribosómica Rpl13A se marca con FKBP12. Sin rapamicina, FRB y FKBP12 no interactúan, y la proteína marcada con FRB permanece en el núcleo. Tras la adición de rapamicina, la rapamicina forma un complejo estable con FKBP12 y FRB, y el complejo es expulsado del núcleo debido a la interacción con Rpl13A (Figura 1). Para prevenir la muerte celular tras la adición de rapamicina, las células albergan la mutación tor1-1 del gen TOR1 . Además, estas células contienen fpr1Δ , un alelo nulo de la proteína FKBP12 de S. cerevisiae , que evita que Fpr1 endógeno supere a Rpl13A-FKBP12 para la unión de FRB y rapamicina. Las mutaciones de fondo de anclaje, tor1-1 y fpr1Δ, no afectan a los tiempos meióticos ni a la segregación cromosómica².

Para demostrar la utilidad de esta técnica, la proteína cinetocoro Ctf19 se agotó en diferentes puntos de tiempo a lo largo de la meiosis. Ctf19 es un componente del cinetocoro que es prescindible en la mitosis pero necesario para la segregación cromosómica adecuada en la meiosis 9,10,11,12,13. En la meiosis, el cinetocoro se desprende en la profase I, y Ctf19 es importante para el reensamblaje del cinetocoro ^9,14. Para este protocolo, las células con el sistema NDT80-in se sincronizaron, y se utilizó la técnica de anclaje para agotar la proteína diana Ctf19 del núcleo antes y después de la liberación de la profase I, y después de la segregación del cromosoma I de la meiosis (Figura 1). Este protocolo se puede adaptar para agotar otras proteínas de interés en cualquier etapa de la meiosis y la mitosis.

Protocolo

1. Preparación de los materiales necesarios

1. Preparar reactivos para el crecimiento y la esporulación de las células de levadura.
   NOTA: Si las cepas de levadura en ciernes son ade2- y trp1-, complemente todos los medios en los pasos 1.1.1-1.1.3 con una concentración final de 0,01% de adenina y 0,01% de triptófano de 1% de cepas. Si esteriliza los medios en autoclave, agregue estos aminoácidos solo después de que los reactivos hayan sido esterilizados en autoclave y se hayan dejado enfriar a temperatura ambiente.
   1. Para el crecimiento vegetativo, prepare 2x medio sintético completo + dextrosa (2XSC) disolviendo 6.7 g de base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos, 2 g de mezcla completa de aminoácidos y 20 g de dextrosa en 500 mL de agua. Esterilizar la mezcla en autoclave durante 20 min a 121 °C o filtrando a través de un filtro de 0,2 μm.
   2. Para el primer paso de la esporulación, prepare 2x medio sintético completo + acetato (2XSCA) disolviendo 6,7 g de base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos, 2 g de mezcla completa de aminoácidos y 20 g de acetato de potasio en 500 mL de agua. Esterilizar la mezcla en autoclave durante 20 min a 121 °C o filtrando a través de un filtro de 0,2 μm.
   3. Para el paso final de la esporulación, prepare acetato de potasio al 1% (1% de KAc) disolviendo 5 g de KAc en 500 ml de agua. Esterilizar la mezcla en autoclave durante 20 min a 121 °C o filtrando a través de un filtro de 0,2 μm.
2. Preparar medicamentos y reactivos para microscopía, sincronización y anclaje.
   1. Para adherir las células al cubreobjetos durante las imágenes de lapso de tiempo, produzca 1 mg / ml de concanavalina A (ConA) en 1x PBS. Esterilizar el filtro con un filtro de 0,2 μm y almacenar alícuotas pequeñas (~10 μL) a -20 °C.
   2. Para usar el sistema NDT80-in, haga 2 ml de 1 mM β-estradiol disuelto en etanol. Esterilizar el filtro con un filtro de 0,2 μm y almacenar las alícuotas (~500 μL) a -20 °C.
   3. Para el sistema de anclaje, hacer 1 mg/ml de rapamicina disuelta en DMSO. Esterilizar el filtro con un filtro de 0,2 μm y almacenar alícuotas pequeñas (~10 μL) a -20 °C.
      NOTA: Prepare pequeñas alícuotas de rapamicina para evitar múltiples ciclos de congelación-descongelación del medicamento.
3. Generar cepas de levadura que contengan el sistema NDT80-in (P GAL1,10-NDT80/P_{GAL1,10-NDT80}; GAL4-ER/ GAL4-ER) y una proteína diana marcada con FRB en el fondo genético de anclaje (tor1-1/tor1-1; fpr1Δ/ fpr1Δ; Rpl13A-FKBP12/Rpl13A-FKBP12)^4,8. Para este estudio se utilizó Ctf19-FRB. Además, una copia de la proteína histona Htb2 se marcó con mCherry para permitir el monitoreo de la progresión meiótica y la segregación de la cromatina.
4. Preparar una cámara para imágenes de lapso de tiempo
   1. Comience a preparar la cámara 6 h-24 h antes de la obtención de imágenes (Figura 2). Corte una cámara de 18 mm x 18 mm del inserto de la caja de punta de pipeta con un bisturí caliente u otra cuchilla afilada.
   2. Use una punta de pipeta de plástico para extender una capa delgada de sellador de silicona alrededor de los bordes inferiores de la cámara que se adherirá al cubreobjetos. Agregue suficiente sellador para que los bordes de la cámara estén completamente cubiertos (ver Figura 2).
   3. Adhiera la cámara a un cubreobjetos de 24 mm x 50 mm colocando suavemente la cámara, con el sellador hacia abajo, sobre el cubreobjetos. Asegúrese de que no haya huecos en el sellador para que la cámara no tenga fugas.
   4. Extienda 8-10 μL de ConA sobre el cubreobjetos. Dispense ConA en el centro del cubreobjetos y use una punta de pipeta para extender el ConA en una capa delgada tal que cubra la mayor parte del cubreobjetos que está rodeado por la cámara.
      NOTA: Las cámaras de plástico se pueden reutilizar indefinidamente. Después de completar las imágenes de lapso de tiempo, retire la cámara del cubreobjetos con una navaja de afeitar, limpie el sellador de silicona de la cámara y mantenga las cámaras sumergidas en etanol al 95% para su uso futuro.

2. Espporulación de las células de levadura

1. Realice los siguientes pasos para la inanición de las células de levadura para inducir el programa meiótico.
   NOTA: Estos pasos son para la esporulación de la cepa de levadura W303. Otras cepas pueden requerir protocolos diferentes¹⁵. La eficiencia de esporulación es muy variable entre las cepas de laboratorio, con W303 exhibiendo una eficiencia de esporulación de ~ 60%^16,17,18.
   1. Tomar una sola colonia de la cepa de levadura diploide apropiada de una placa e inocular 2 mL de 2XSC y dejar crecer a 30 °C en un tambor de rodillos durante 12-24 h hasta la saturación.
   2. Diluir el cultivo saturado en 2XSCA añadiendo 80 μL del cultivo desde el paso 2.1.1 hasta 2 ml de 2XSCA. Dejar crecer a 30 °C en un tambor de rodillos durante 12-16 h. No lo deje en 2XSCA por más de 16 h porque las células pueden enfermarse o autofluorescentes.
   3. Realice dos lavados haciendo girar el cultivo a 800 x g a temperatura ambiente (25 °C) durante 1 min, desechando el líquido y resuspendiendo el pellet en 2 ml de agua destilada estéril.
   4. Después del segundo lavado, retire el líquido y vuelva a suspender el pellet en 2 ml de KAc al 1% y déjelo crecer a 25 °C en un tambor de rodillos durante 8-12 h. Las células que han entrado en la meiosis se detendrán en paquiteno de la profase I.
2. Sistema de liberación Prophase I
   1. Añadir β-estradiol directamente al cultivo de esporulación hasta una concentración final de 1 μM y vortex el tubo de cultivo rápidamente. El β-estradiol liberará células de la profase I.

3. Agotamiento de la proteína diana del núcleo mediante la técnica de anclaje

1. Agregue rapamicina a las células para agotar la proteína marcada con FRB del núcleo en una etapa particular.
   1. Para agotar las proteínas del núcleo en la salida de la profase I, agregue rapamicina a una concentración final de 1 μg/ml al tubo de cultivo de esporulación al mismo tiempo que se agrega β-estradiol.
   2. Para agotar las proteínas del núcleo en una etapa particular de la meiosis, monitoree la etapa del ciclo celular comenzando a los 60 minutos después de la adición de β-estradiol. Cada 20 min, pipetear 5 μL de cultivo sobre un cubreobjetos de 24 mm x 40 mm y cubrir las células con un cubreobjetos de 18 mm x 18 mm. Mantenga los cultivos girando en el tambor de rodillos a 25 °C entre puntos de tiempo.
   3. Imagen de las células utilizando el filtro A594/mCherry y el objetivo 60x de un microscopio de fluorescencia. Establezca el porcentaje de transmitancia en 2% y el tiempo de exposición en 250 ms. La presencia de una, dos o cuatro masas de ADN indicará la etapa meiótica en la que las células han progresado. Añadir rapamicina a una concentración final de 1 μg/ml en la etapa meiótica de interés.
2. Mantenga las células girando en el tambor de rodillos a 25 °C hasta que estén listas para la obtención de imágenes. El agotamiento nuclear de una proteína diana ocurre 30-45 min después de la adición de rapamicina ^2,8.

4. Microscopía de fluorescencia time-lapse

1. Haga una almohadilla de agar que se utilizará para crear una monocapa de células para obtener imágenes (consulte el paso 4.2).
   1. Corte y deseche la tapa y el 1/3 inferior de un tubo de microfuga de 1,5 ml para crear un cilindro. El cilindro servirá como molde para la almohadilla de agar. Hacer dos cilindros para tener un extra en caso de que el agar no polimerice correctamente en el primero.
   2. Coloque el cilindro del tubo de microfuga cortado en un portaobjetos de vidrio limpio con la parte superior del tubo boca abajo sobre el portaobjetos.
   3. Haga 6 ml de una solución de agar al 5% (use KAc al 1% como solvente) en un vaso de precipitados al 50 ml y microondas hasta que el agar esté completamente disuelto.
      NOTA: El agar se evaporará fácilmente en el microondas; Observe el agar y encienda y detenga el microondas cuando el agar comience a hervir y gire el vaso de precipitados. Inicie y detenga el microondas varias veces para disolver completamente el agar. La solución de agar se hace en exceso de la cantidad necesaria para asegurar que el agar se disuelva completamente.
   4. Corte la punta de la pipeta para hacer una abertura más grande y pipete ~ 500 μL de agar fundido en cada cilindro de tubo de microfuga. Déjelo reposar a temperatura ambiente hasta que el agar se solidifique (~10-12 min).
2. Preparación de células de levadura para la obtención de imágenes
   1. Girar 200 μL del cultivo de esporulación desde el paso 3.2 a 800 x g durante 2 min en tubos de microcentrífuga de 1 ml. Retirar y desechar 180 μL del sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet en el sobrenadante restante girando y moviendo el tubo.
   2. Pipeta 6 μL de las células concentradas en el cubreobjetos del centro de la cámara realizada en el paso 1.4.
   3. Sujete el cilindro con la almohadilla de agar hecha en el paso 4.1 y deslícelo con cuidado fuera del portaobjetos de vidrio. Asegúrese de que el agar esté completamente plano en la parte inferior y, utilizando la parte inferior de la punta de una pipeta, aplique una ligera cantidad de presión al molde de microfuga de modo que la almohadilla de agar se empuje ligeramente por encima del límite del tubo.
   4. Invierta el molde de tal manera que la almohadilla de agar esté mirando hacia abajo hacia la cámara.
   5. Con fórceps, coloque suavemente la almohadilla de agar (todavía en el molde del tubo de microfuga) en la parte superior de las celdas. Use una punta de pipeta para deslizar suavemente la almohadilla de agar alrededor de la cámara 10-20 veces para crear una monocapa de células en el cubreobjetos.
   6. Deje la almohadilla de agar en la cámara durante 12-15 min. Este paso permitirá que las células se adhieran al ConA en el cubreobjetos.
   7. Transfiera 2 ml de cultivo de esporulación del paso 3.2 a dos tubos de microcentrífuga y gire a 15.700 x g durante 2 min. Transfiera el sobrenadante a tubos de microfuga limpios y gire de nuevo a 15.700 x g durante 2 min. Transfiera el sobrenadante a los tubos de microcentrífuga limpios que se utilizarán en el siguiente paso.
      NOTA: Es importante utilizar el sobrenadante KAc preacondicionado con el β-estradiol y la rapamicina para asegurar una esporulación eficiente y el agotamiento continuo de la proteína de interés.
   8. Después de que la almohadilla de agar se haya asentado en la cámara durante 12-15 minutos, flote y retire la almohadilla de agar antes de obtener la imagen. Para ello, añadir 2 ml del sobrenadante desde el paso 4.2.7 gota a gota a la cámara. Una vez que el líquido ha alcanzado la parte superior de la cámara, lo más probable es que la almohadilla de agar flote.
      NOTA: Si la almohadilla de agar no flota automáticamente, espere 1-2 minutos. Si la almohadilla de agar aún no flota, retírela suavemente con fórceps. Idealmente, la almohadilla de agar flotaría por sí sola porque eliminarla antes de flotar podría llevar a la eliminación de las células.
   9. Después de que la almohadilla de agar haya flotado, retírela suavemente con fórceps y deséchela. Coloque un cubreobjetos de 24 mm x 50 mm en la parte superior de la cámara para evitar la evaporación durante la obtención de imágenes.
3. Configuración de una película en el microscopio
   NOTA: Las instrucciones a continuación son para un microscopio invertido equipado con un portaportaobjetos que acomoda el cubreobjetos de 24 mm x 50 mm (consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre microscopio, cámara y software). Se utiliza un objetivo de inmersión en aceite de 60x para la adquisición de imágenes. Es posible que sea necesario modificar este protocolo cuando se usan otros microscopios u otros portaportaobjetos. Los pasos exactos para ejecutar los pasos 4.3.2 a 4.3.16 variarán según el microscopio y el software de imágenes utilizado. Ver sección 4.4 para obtener instrucciones para un microscopio diferente.
   1. Coloque el cubreobjetos dentro del portaobjetos. Adhiera la arcilla de moldeo al costado del cubreobjetos para mantenerla segura en el soporte de la corredera.
   2. Abra el software de adquisición de imágenes. Utilice perillas de ajuste fino y de rumbo para enfocar las celdas mediante DIC o campo claro.
   3. En el menú principal del software de adquisición de imágenes, haga clic en Archivo > Adquirir (Resolver 3D). Aparecerán tres ventanas.
   4. En la ventana llamada Resolve 3D, haga clic en el icono del matraz Erlenmeyer . Esto abrirá una ventana titulada Experimento de diseño/ejecución, que contiene los controles para configurar un experimento para configurar una película de lapso de tiempo.
   5. En la pestaña Diseño , navegue hasta la pestaña etiquetada Secciones. Seleccione la casilla situada junto a Sección Z. Establezca las pilas z de la siguiente manera: Espaciado de sección óptica = 1 μm, Número de secciones ópticas = 5, Espesor de muestra = 5,0 μm.
   6. En la pestaña Canales , haga clic en el icono + para que aparezca una opción de canal. Seleccione el canal adecuado. Para este experimento, seleccionamos A594, que se utiliza para obtener imágenes de mCherry. Seleccione la casilla situada junto a Imagen de referencia y establezca la posición Z en el centro de la muestra en el menú desplegable.
   7. Seleccione un valor del menú desplegable adyacente a %T y Exp. para establecer el porcentaje de transmitancia y el tiempo de exposición, respectivamente. Para este experimento, se utiliza una transmitancia del 2% y un tiempo de exposición de 250 ms en el canal A594, y una transmitancia del 10% y un tiempo de exposición de 500 ms para el campo claro.
      NOTA: El tiempo de exposición y el porcentaje de transmitancia variarán con diferentes microscopios. Para evitar la sobreexposición, utilice el porcentaje de transmitancia más bajo y el tiempo de exposición más corto posible que permita una visualización adecuada de la proteína de interés.
   8. En la pestaña Time-lapse, seleccione la casilla junto a Time-lapse. En la tabla que aparece, escriba 10 en la columna min en la fila time-lapse y 10 en la columna horas en la fila de tiempo total. Esto ejecutará un curso de tiempo tomando imágenes cada 10 minutos durante 10 h.
   9. Selecciona la casilla situada junto a Mantener el enfoque con Ultimate Focus para evitar la desviación del escenario durante la película. En la pestaña Puntos , seleccione la casilla junto a Lista de puntos de visita.
   10. En el menú principal, haga clic en Ver > lista de puntos. Aparecerá una ventana llamada lista de puntos. Mueva el escenario a un área de la cámara que muestre una monocapa de celdas. Haga clic en Marca de punto en la ventana de lista de puntos.
   11. Mueva el escenario para seleccionar 25-30 puntos sin ninguna superposición para evitar la sobreexposición de las celdas. Cada campo será fotografiado durante cada curso de tiempo.
   12. En la ventana de lista de puntos, seleccione Calibrar todo para establecer el enfoque definitivo para cada punto. En la pestaña Diseño de la ventana Experimento de diseño/ejecución , introduzca el rango de valores de puntos (obtenidos de la ventana de lista de puntos) en el cuadro situado junto a Lista de puntos de visita. En la pestaña Ejecutar , guarde el archivo en el destino apropiado en el equipo. En la ventana Diseñar/Ejecutar experimento , seleccione el botón Reproducir (icono de triángulo verde) para iniciar la película.
4. Método opcional: configurar una película en un microscopio
   NOTA: Estas instrucciones son para un microscopio invertido equipado con un portaportaobjetos que puede acomodar un cubreobjetos de 24 mm x 50 mm. Consulte la Tabla de materiales para obtener especificaciones sobre el microscopio, la cámara y el software de imágenes utilizado. Se utiliza un objetivo de inmersión en aceite de 60x para la adquisición de imágenes.
   1. Coloque el cubreobjetos dentro del portaobjetos. Abra el software de adquisición de imágenes. Utilice perillas de ajuste fino y de rumbo para enfocar las celdas mediante DIC o campo claro. Haga clic derecho en la ventana abierta del software. Aparecerá un menú desplegable.
   2. Haga clic en Controles de adquisición > Adquisición. Haga clic en Aplicación > Definir/Ejecutar experimento. Esto abrirá una ventana etiquetada ND Acquisition.
   3. En la ventana que se abre, marca la casilla situada junto a XY. Mueva el escenario a la ubicación deseada y haga clic en el cuadro debajo de Nombre de punto para seleccionar esa ubicación como punto . Repita esto hasta que se seleccionen 25-30 puntos sin ninguna superposición para evitar sobreexponer las celdas. Cada campo será fotografiado durante cada curso de tiempo.
   4. Establezca el porcentaje de transmitancia para cada canal fluorescente. Debido a que las cepas producen Htb2-mCherry, aquí se utiliza el filtro mCherry. En la ventana Adquisición que se abrió en el paso 4.3.3, navegue hasta el botón de 555 nm. Establezca el porcentaje de transmitancia en 5% ajustando la escala móvil debajo del botón de 555 nm hasta que lea 5%.
   5. Establezca el tiempo de exposición para cada canal fluorescente. En la ventana Adquisición , seleccione 200 ms en el menú desplegable Exposición.
      NOTA: El tiempo de exposición y el porcentaje de transmitancia variarán con diferentes microscopios. Para evitar la sobreexposición, utilice el porcentaje de transmitancia más bajo y el tiempo de exposición más corto posible que permita una visualización adecuada de la proteína de interés.
   6. Haga clic en el cuadro junto a Z en la ventana ND Acquisition . Coloque cinco pilas z de las células de levadura que están separadas por 1.2 μM.
   7. Haga clic en el cuadro junto a λ. Seleccione los canales apropiados que se utilizarán para el experimento. Para DIC, asegúrese de que Inicio esté seleccionado en el menú desplegable en Z pos. Para mCherry, asegúrese de que Todo esté seleccionado en el menú desplegable en Z pos. Esto asegura que solo se tome una sección (en el medio de la pila z) para DIC.
   8. Seleccione la casilla situada junto a Hora en la ventana Adquisición de ND . Seleccione la casilla debajo de Fase. En el menú desplegable de Intervalo, seleccione 10 min. En Duración, seleccione 10 horas (s). Esto ejecutará el curso de tiempo de tal manera que las imágenes se tomen cada 10 minutos durante 10 h.

5. Análisis de la segregación de cromatina

1. Abra el software Fiji. Abra un campo de visión a la vez: para cada campo, abra los canales DIC y mCherry.
2. Tome la proyección de máxima intensidad del canal mCherry para obtener una sola imagen: haga clic en Image > Stacks > Z Project, seleccione Max Intensity en el menú desplegable.
3. Fusione los canales DIC y mCherry en una sola imagen: haga clic en Imagen > Color > Combinar canales.
4. Siga una sola célula a través de la meiosis. Después de completar la meiosis II, registre el número de masas de ADN.

Resultados

Para controlar la segregación de la cromatina, la proteína histona Htb2 se marcó con mCherry. En la profase I, la cromatina aparece como una sola masa Htb2. Después de que los cromosomas homólogos se segregan en la primera división meiótica, la cromatina aparece como dos masas distintas (Figura 3A). Después de que las cromátidas hermanas se segregan, la cromatina aparece como cuatro masas. Si algunos cromosomas no se adhieren a los microtúbulos fusiformes, se pueden ver masas adici...

Discusión

Este protocolo combina el sistema NDT80-in para sincronizar células, la técnica de anclaje para agotar las proteínas del núcleo y la microscopía de lapso de tiempo de fluorescencia para obtener imágenes de las células de levadura en ciernes durante la meiosis. El sistema NDT80-in es un método para la sincronización del ciclo celular meiótico que utiliza una profase I de detención y liberación ^4,8. Aunque las células individuales var...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
β-estradiol	Millipore Sigma	E8875	Make 1mM stocks in 95% EtOH
0.22 uM Threaded Bottle-top Filter	Millipore Sigma	S2GPT02RE
100% EtOH	Fisher Scientific	22-032-601
10X PBS	Fisher Scientific	BP399500	Dilute 1:10 to use as solvent for ConA
24 mm x 50 mm coverslip No. 1.5	VWR North American	48393241
25 mm x 75 mm microscope slides	VWR North American	48300-026
Adenine hemisulfate salt	Millipore Sigma	A9126	To supplement SC, SCA, and 1% Kac
Bacto Agar	BD	214030
Concanavialin A	Mllipore Sigma	C2010	Make as 1mg/mL in 1X PBS
CoolSNAP HQ2 CCD camera	Photometrics		Used in Section 4.3
D-glucose	Fisher Scientific	D16-10
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids	BD	291920
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Millipore Sigma	D5879
Eclipse Ti2 inverted-objective micrscope	Nikon		Used in Section 4.4
Fiji	NIH		Download from https://fiji.sc/
GE Personal DeltaVision Microscope	Applied Precision		Used in Section 4.3
L-Tryptophan	Millipore Sigma	T0254	To supplement SC, SCA, and 1% Kac
Modeling Clay	Crayola	2302880000	To secure coverslip in slide holder
NIS-Elements AR 5.30.04 Imaging Software	Nikon		Used in Section 4.4
ORCA-Fustion BT Camera	Hamamatsu	C15440-20UP	Used in Section 4.4
Plastic pipette tip holder	Dot Scientific	LTS1000-HR	Cut a 4 square x 4 square section of the rack portion of this product.
Pottassium Acetate	Fisher Scientific	BP264
Rapamycin	Fisher Scientific	BP29631	Make 1mg/mL stocks in DMSO
Silicone Sealant	Aqueon	100165001	Also known as aquarium glue.
SoftWorx7.0.0  Imaging Software	Applied Precision		Used in Section 4.3
Synthetic Complete Mixture (Kaiser)	Formedium	DSCK2500
Type N immersion oil	Nikon	MXA22166