S. cerevisiae'de Mayozu İncelemek için Hızlandırılmış Mikroskopi ve Proteinlerin Aşamaya Özgü Nükleer Tükenmesinin Kullanılması

Özet

Hızlandırılmış mikroskopi, tomurcuklanan mayadaki mayozu incelemek için değerli bir araçtır. Bu protokol, mayotik kromozom ayrışması sırasında belirli bir proteinin işlevinin nasıl çalışılacağını göstermek için hücre döngüsü senkronizasyonunu, hızlandırılmış mikroskopiyi ve bir hedef proteinin koşullu tükenmesini birleştiren bir yöntemi açıklar.

Özet

Hızlandırılmış floresan mikroskopi, genellikle sabit hücreleri görüntüleyerek görülmeyen zamansal ve mekansal veriler sağlayarak mayotik hücre döngüsü olaylarının anlaşılmasında devrim yaratmıştır. Tomurcuklanan maya, mayotik kromozom ayrışmasını incelemek için önemli bir model organizma olduğunu kanıtlamıştır, çünkü birçok mayotik gen oldukça korunmuştur. Tomurcuklanan mayadaki mayozun hızlandırılmış mikroskopisi, mutasyonun mayotik süreçleri nasıl bozduğunu göstermek için farklı mayotik mutantların izlenmesine izin verir. Bununla birlikte, birçok protein mayozda birden fazla noktada işlev görür. Bu nedenle, fonksiyon kaybı veya mayotik null mutantların kullanımı, erken bir süreci bozabilir, daha sonraki süreci bloke edebilir veya rahatsız edebilir ve her bir bireysel rolle ilişkili fenotipleri belirlemeyi zorlaştırabilir. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, bu protokol, proteinlerin mayozun belirli aşamalarında çekirdekten şartlı olarak nasıl tükenebileceğini açıklarken, hızlandırılmış mikroskopi kullanarak mayotik olayları izler. Spesifik olarak, bu protokol, hücrelerin faz I'de nasıl senkronize edildiğini, çapa atma tekniğinin belirli mayotik aşamalarda çekirdekten proteinleri tüketmek için nasıl kullanıldığını ve mayotik kromozom ayrışmasını izlemek için hızlandırılmış görüntülemenin nasıl kullanıldığını açıklar. Tekniğin yararlılığına bir örnek olarak, kinetochore proteini Ctf19, mayozis sırasında farklı zaman noktalarında çekirdekten tükenmiş ve mayoz II'nin sonunda kromatin kütlelerinin sayısı analiz edilmiştir. Genel olarak, bu protokol mayotik bölünmeleri izlerken çekirdekten farklı nükleer proteinleri tüketmek için uyarlanabilir.

Giriş

Hızlandırılmış floresan mikroskobu, tomurcuklanan maya ^1,2'deki mayotik kromozom ayrışmasının dinamiklerini incelemek için değerli bir araçtır. Tomurcuklanan maya hücreleri, temel besin maddelerinin açlığı yoluyla mayoza uğramaya teşvik edilebilir³. Mayoz sırasında, hücreler bir tur kromozom ayrışmasına ve ardından sporlara paketlenmiş dört mayotik ürün oluşturmak için iki bölüme ayrılır (Şekil 1). Bireysel hücreler, mayozun her aşamasında görselleştirilebilir, bu da sabit hücreli görüntüleme ile kolayca kaçırılabilecek uzamsal ve zamansal veriler üretir. Bu protokol, hızlandırılmış floresan mikroskopisinin daha önce kurulmuş iki yöntemle, indüklenebilir NDT80 sistemi (NDT80-in) ve çapa uzaklaştırma tekniği ile birleştirilmesinin farklı mayotik aşamalardaki spesifik proteinlerin işlevini incelemek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

NDT80-in sistemi, orta mayoz transkripsiyon faktörü NDT80 ^4,5'in indüklenebilir ekspresyonuna dayanan mayotik hücre döngüsü senkronizasyonu için güçlü bir araçtır. NDT80 ifadesi faz I çıkış ^6,7 için gereklidir. NDT80-in sistemi ile NDT80, bir östrojen reseptörüne (Gal4-ER) kaynaşmış Gal4 transkripsiyon faktörünü eksprese eden hücrelerde GAL1-10 promotörünün kontrolü ^{altındadır4,5}. Gal4-ER çekirdeğe sadece β-östradiol'e bağlandığında girdiğinden, NDT80-in hücreleri β-östradiol yokluğunda faz I'de durur ve bu da faz I'deki hücrelerin senkronizasyonuna izin verir (Şekil 1). β-östradiol ilavesi, Gal4-ER transkripsiyon faktörünün çekirdeğe translokasyonunu teşvik eder, burada NDT80'in ekspresyonunu sürmek için GAL1-10'u bağlar ve mayotik bölünmelere senkron girişe yol açar. Hızlandırılmış mikroskopi senkronizasyon olmadan yapılabilmesine rağmen, senkronizasyon kullanmanın avantajı, hücreler mayozun belirli bir aşamasındayken bir inhibitör veya ilaç ekleme yeteneğidir.

Çapa atma tekniği, rapamisin⁸ ilavesiyle bir proteinin çekirdekten tükenebileceği indüklenebilir bir sistemdir. Bu teknik, tomurcuklanan mayadaki hücre bölünmesi sırasında nükleer proteinleri incelemek için idealdir, çünkü maya hücreleri, nükleer zarfın parçalanmadığı kapalı mitoz ve mayoza uğrar. Ayrıca, bu teknik mayozda birden fazla işlevi olan proteinler için çok yararlıdır. Delesyonlardan, mutant alellerden veya mayotik null alellerin aksine, bir hedef proteinin belirli bir aşamada çekirdekten uzaklaştırılması, daha erken aşamalarda hedef protein aktivitesinden ödün vermez ve sonuçların daha doğru bir şekilde yorumlanmasına izin verir. Ankraj uzaklaştırma sistemi, ribozomal olgunlaşma üzerine ortaya çıkan çekirdek ve sitoplazma arasındaki ribozomal alt birimlerin titremesini kullanır⁸. Hedef proteini çekirdekten tüketmek için, hedef protein, ribozomal alt birim Rpl13A'nın FKBP12 ile etiketlendiği bir suşta FKBP12-rapamisin bağlayıcı etki alanı (FRB) ile etiketlenir. Rapamisin olmadan, FRB ve FKBP12 etkileşime girmez ve FRB etiketli protein çekirdekte kalır. Rapamisin ilavesi üzerine, rapamisin FKBP12 ve FRB ile kararlı bir kompleks oluşturur ve kompleks Rpl13A ile etkileşim nedeniyle çekirdekten dışarı atılır (Şekil 1). Rapatisin ilavesi üzerine hücre ölümünü önlemek için, hücreler TOR1 geninin tor1-1 mutasyonunu barındırır. Ek olarak, bu hücreler, endojen Fpr1'in FRB ve rapamisin bağlanması için Rpl13A-FKBP12'nin rekabet etmesini önleyen S. cerevisiae FKBP12 proteininin boş bir aleli olan fpr1Δ'yu içerir. Arka plan mutasyonlarını (tor1-1 ve fpr1Δ) uzaklaştırmak, mayotik zamanlamaları veya kromozom ayrışması^2'yi etkilemez.

Bu tekniğin yararlılığını göstermek için, kinetochore proteini Ctf19, mayozda farklı zaman noktalarında tükenmiştir. Ctf19, mitozda dağıtılabilen ancak mayoz^{9,10,11,12,13'te} uygun kromozom ayrışması için gerekli olan kinetochore'un bir bileşenidir. Mayozda, kinetochore faz I'de dökülür ve Ctf19, kinetochore yeniden montajı ^9,14 için önemlidir. Bu protokol için, NDT80-in sistemine sahip hücreler senkronize edildi ve çapa uzaklaştırma tekniği, faz I'den salınmadan önce ve sonra ve mayoz I kromozom ayrışmasından sonra çekirdekten hedef protein Ctf19'u tüketmek için kullanıldı (Şekil 1). Bu protokol, mayoz ve mitozun herhangi bir aşamasında ilgilenilen diğer proteinleri tüketmek için uyarlanabilir.

Protokol

1. Gerekli malzemelerin hazırlanması

1. Maya hücrelerinin büyümesi ve sporülasyonu için reaktifler hazırlayın.
   NOT: Tomurcuklanan maya suşları ade2 - ve trp1- ise, 1.1.1-1.1.3 adımlarındaki tüm ortamları, %1 stoklardan %0,01 adenin ve %0,01 triptofan nihai konsantrasyonu ile tamamlayın. Ortamları otoklav ile sterilize ediyorsanız, bu amino asitleri ancak reaktifler otoklavlandıktan ve oda sıcaklığına soğumaya bırakıldıktan sonra ekleyin.
   1. Vejetatif büyüme için, 500 mL suda 6.7 g maya azot bazını, 2 g tam amino asit karışımını ve 20 g dekstrozu amino asitler olmadan çözerek 2x sentetik tam + dekstroz ortamı (2XSC) hazırlayın. Karışımı 121 °C'de 20 dakika otoklavlayarak veya 0,2 μm'lik bir filtreden süzerek sterilize edin.
   2. Sporülasyonun ilk adımı için, 500 mL suda 6.7 g maya azot bazını, 2 g tam amino asit karışımını ve 20 g potasyum asetat amino asitsiz çözerek 2x sentetik tam + asetat ortamı (2XSCA) hazırlayın. Karışımı 121 °C'de 20 dakika otoklavlayarak veya 0,2 μm'lik bir filtreden süzerek sterilize edin.
   3. Sporülasyonun son adımı için, 5 g KAc'yi 500 mL suda çözerek% 1 potasyum asetat (% 1 KAc) hazırlayın. Karışımı 121 °C'de 20 dakika otoklavlayarak veya 0,2 μm'lik bir filtreden süzerek sterilize edin.
2. İlaçları ve reaktifleri mikroskopi, senkronizasyon ve çapa için hazırlayın.
   1. Hızlandırılmış görüntüleme sırasında hücreleri kapak kaymasına yapıştırmak için, 1x PBS'de 1 mg / mL konkanavalin A (ConA) yapın. 0,2 μm'lik bir filtre kullanarak filtreleyin ve -20 °C'de küçük (~10 μL) alikotları saklayın.
   2. NDT80-in sistemini kullanmak için, etanol içinde çözünmüş 2 mL 1 mM β-estradiol yapın. 0,2 μm'lik bir filtre kullanarak filtre sterilize edin ve -20 °C'de alikotları (~ 500 μL) saklayın.
   3. Ankraj uzaklaştırma sistemi için, DMSO'da çözünmüş 1 mg / mL rapamisin yapın. 0,2 μm'lik bir filtre kullanarak filtreleyin ve -20 °C'de küçük (~10 μL) alikotları saklayın.
      NOT: İlacın çoklu donma-çözülme döngülerini önlemek için küçük rapamisin alikotları hazırlayın.
3. NDT80-in sistemini içeren maya suşları oluşturun (P GAL1,10-NDT80/P_{GAL1,10-NDT80}; GAL4-ER/ GAL4-ER) ve çapa uzaklığındaki genetik arka planda FRB ile etiketlenmiş bir hedef protein (tor1-1/tor1-1; fpr1Δ/ fpr1Δ; Rpl13A-FKBP12/Rpl13A-FKBP12)^4,8. Bu çalışmada Ctf19-FRB kullanılmıştır. Ek olarak, histon proteini Htb2'nin bir kopyası, mayotik progresyonun ve kromatin ayrışmasının izlenmesine izin vermek için mCherry ile etiketlendi.
4. Hızlandırılmış görüntüleme için bir oda hazırlama
   1. Görüntülemeden 6 saat-24 saat önce odayı hazırlamaya başlayın (Şekil 2). Pipet ucu kutusu ucundan 18 mm x 18 mm'lik bir hazneyi ısıtılmış bir neşter veya başka bir keskin bıçak kullanarak kesin.
   2. Kapağın kapağına yapışacak olan odanın alt kenarlarının etrafına ince bir silikon dolgu macunu tabakası yaymak için plastik bir pipet ucu kullanın. Odanın kenarlarının tamamen kaplanması için yeterli sızdırmazlık maddesi ekleyin (bkz. Şekil 2).
   3. Odayı 24 mm x 50 mm'lik bir kapak kaymasına yapıştırın ve hazneyi yavaşça sızdırmazlık maddesini kapak kaymasına yerleştirin. Sızdırmazlık maddesinde boşluk olmadığından emin olun, böylece oda sızmaz.
   4. Kapak kapağına 8-10 μL ConA yayın. ConA'yı kapak kaymasının ortasına dağıtın ve ConA'yı odayla çevrili kapak kaymasının çoğunu kaplayacak şekilde ince bir tabakaya yaymak için bir pipet ucu kullanın.
      NOT: Plastik hazneler süresiz olarak yeniden kullanılabilir. Hızlandırılmış görüntüleme tamamlandıktan sonra, bir tıraş bıçağı kullanarak odayı kapak kapağından çıkarın, silikon dolgu macununu odadan temizleyin ve odaları ileride kullanmak üzere% 95 etanol içine batırılmış halde tutun.

2. Maya hücrelerinin sporülasyonu

1. Mayotik programı indüklemek için maya hücrelerinin açlıktan ölmesi için aşağıdaki adımları uygulayın.
   NOT: Bu adımlar, mayanın W303 suşunun sporülasyonu içindir. Diğer suşlar farklı protokoller gerektirebilir¹⁵. Sporülasyon verimliliği, laboratuvar suşları arasında oldukça değişkendir ve W303, ~% 60 ^16,17,18'lik bir sporülasyon verimliliği sergiler.
   1. Bir plakadan uygun diploid maya suşunun tek bir kolonisini alın ve 2 mL 2XSC'yi aşılayın ve doygunluğa 12-24 saat boyunca bir makaralı tambur üzerinde 30 ° C'de büyümeye bırakın.
   2. Doymuş kültürü, 2.1.1 adımından 2 mL'lik 2XSCA'ya 80 μL kültür ekleyerek 2XSCA'ya seyreltin. 12-16 saat boyunca bir makaralı tambur üzerinde 30 ° C'de büyümesine izin verin. 2XSCA'da 16 saatten daha uzun süre bırakmayın, çünkü hücreler hastalanabilir veya otomatik floresan olabilir.
   3. Kültürü oda sıcaklığında (25 ° C) 800 x g'da 1 dakika boyunca döndürerek, sıvıyı atarak ve peleti 2 mL steril damıtılmış suda yeniden askıya alarak iki yıkama yapın.
   4. İkinci yıkamadan sonra, sıvıyı çıkarın ve peleti% 1 KAc'lik 2 mL'de yeniden askıya alın ve 8-12 saat boyunca bir makaralı tambur üzerinde 25 ° C'de büyümesine izin verin. Mayoza giren hücreler, faz I'in pakiteninde tutuklanacaktır.
2. Profaze I serbest bırakma sistemi
   1. β-östradiol'ü doğrudan sporülasyon kültürüne 1 μM'lik bir son konsantrasyona ekleyin ve kültür tüpünü hızlı bir şekilde vorteksleyin. β-östradiol, hücreleri faz I'den serbest bırakacaktır.

3. Çapa atma tekniğini kullanarak hedef proteinin çekirdekten tükenmesi

1. FRB etiketli proteini çekirdekten belirli bir aşamada tüketmek için hücrelere rapamisin ekleyin.
   1. Faz I çıkışında çekirdekten proteinleri tüketmek için, sporülasyon kültürü tüpüne 1 μg / mL'lik son konsantrasyona rapamisin, β-östradiol ilavesiyle aynı anda ekleyin.
   2. Belirli bir mayozun belirli bir aşamasında çekirdekteki proteinleri tüketmek için, β-östradiol ilavesinden 60 dakika sonra başlayan hücre döngüsü aşamasını izleyin. Her 20 dakikada bir, 24 mm x 40 mm'lik bir kapak kayması üzerine 5 μL kültür pipeti takın ve hücreleri 18 mm x 18 mm'lik bir kapak kayması ile örtün. Kültürlerin makaralı tambur üzerinde zaman noktaları arasında 25 °C'de dönmesini sağlayın.
   3. A594/mCherry filtresini ve floresan mikroskobun 60x hedefini kullanarak hücreleri görüntüleyin. Yüzde geçirgenliği %2'ye ve maruz kalma süresini 250 ms'ye ayarlayın. Bir, iki veya dört DNA kütlesinin varlığı, hücrelerin ilerlediği mayotik aşamayı gösterecektir. Rapamisin'i, ilgilenilen mayotik aşamada 1 μg / mL'lik son konsantrasyona ekleyin.
2. Hücreleri görüntülemeye hazır olana kadar makaralı tambur üzerinde 25 °C'de döndürün. Bir hedef proteinin nükleer tükenmesi, rapamisin ilavesi ^2,8'den 30-45 dakika sonra meydana gelir.

4. Hızlandırılmış floresan mikroskopi

1. Görüntüleme için tek katmanlı bir hücre oluşturmak için kullanılacak bir agar pedi yapın (bkz. adım 4.2).
   1. Bir silindir oluşturmak için 1,5 mL'lik bir mikrofüj tüpünün kapağını ve alt 1/3'ünü kesin ve atın. Silindir, agar pedi için bir kalıp görevi görecektir. Agarın ilkinde düzgün bir şekilde polimerize olmaması durumunda fazladan iki silindir yapın.
   2. Kesilmiş mikrofüj tüpü silindirini, tüpün üst kısmı kızak üzerinde baş aşağı olacak şekilde temiz bir cam slayt üzerine yerleştirin.
   3. 50 mL'lik bir beherde %5'lik bir agar çözeltisinin 6 mL'sini (çözücü olarak %1 KAc kullanın) yapın ve agar tamamen çözünene kadar mikrodalgada pişirin.
      NOT: Agar mikrodalgada kolayca kaynar; agar'ı izleyin ve agar kaynamaya ve beheri döndürmeye başladığında mikrodalgayı başlatın ve durdurun. Agar'ı tamamen çözmek için mikrodalgayı birkaç kez başlatın ve durdurun. Agar çözeltisi, agarın tamamen çözünmesini sağlamak için gereken miktardan fazla yapılır.
   4. Daha büyük bir açıklık yapmak için pipetin ucunu kesin ve her bir mikrofüj tüpü silindirine ~ 500 μL erimiş agar pipetin. Agar katılaşana kadar oda sıcaklığında bekletin (~ 10-12 dakika).
2. Maya hücrelerinin görüntüleme için hazırlanması
   1. 1 mL mikrosantrifüj tüplerinde 2 dakika boyunca 800 x g'de 3.2. adımdan itibaren sporülasyon kültürünün 200 μL'sini döndürün. Süpernatanın 180 μL'sini çıkarın ve atın. Pelet, tüpü döndürerek ve hafifçe vurarak kalan süpernatantta yeniden askıya alın.
   2. Pipet 6 μL konsantrasyondaki hücrelerin üzerine örtü kayması haznenin ortasındaki 1.4. adımda yapılır.
   3. Silindiri adım 4.1'de yapılan agar pedi ile tutun ve dikkatlice cam kızaktan kaydırın. Agarın altta tamamen düz olduğundan ve bir pipet ucunun tabanını kullandığından emin olun, mikrofüj kalıbına hafif bir basınç uygulayın, böylece agar pedi tüpün sınırının biraz üzerine itilir.
   4. Kalıbı, agar pedi odaya doğru aşağı bakacak şekilde ters çevirin.
   5. Forseps kullanarak, agar pedini (hala mikrofüj tüp kalıbında) hücrelerin üzerine yavaşça yerleştirin. Bir pipet ucu kullanarak agar pedini haznenin etrafında 10-20 kez nazikçe kaydırarak kapak kapağında tek katmanlı bir hücre tabakası oluşturun.
   6. Agar pedini 12-15 dakika odada bırakın. Bu adım, hücrelerin kapak kapağındaki ConA'ya yapışmasını sağlayacaktır.
   7. Adım 3.2'den iki mikrosantrifüj tüpüne 2 mL sporülasyon kültürü aktarın ve 2 dakika boyunca 15.700 x g'de döndürün. Süpernatantı temiz mikrofüj tüplerine aktarın ve 2 dakika boyunca 15.700 x g'de tekrar döndürün. Bir sonraki adımda kullanılacak mikrosantrifüj tüplerini temizlemek için süpernatantı aktarın.
      NOT: İlgilenilen proteinin verimli sporülasyonunu ve sürekli tükenmesini sağlamak için önceden şartlandırılmış KAc süpernatantının β-estradiol ve rapamisin ile kullanılması önemlidir.
   8. Agar pedi haznede 12-15 dakika oturduktan sonra, görüntülemeden önce agar pedini yüzdürün ve çıkarın. Bunu yapmak için, 4.2.7 adımından odaya damla yönünde 2 mL süpernatant ekleyin. Sıvı odanın tepesine ulaştığında, agar pedi büyük olasılıkla yüzecektir.
      NOT: Agar pedi otomatik olarak yüzmezse, 1-2 dakika bekleyin. Agar pedi hala yüzmüyorsa, forsepslerle yavaşça çıkarın. İdeal olarak, agar pedi kendi kendine yüzer, çünkü yüzmeden önce çıkarılması hücrelerin çıkarılmasına yol açabilir.
   9. Agar pedi yüzdükten sonra, forseps ile yavaşça çıkarın ve atın. Görüntüleme sırasında buharlaşmayı önlemek için haznenin üstüne 24 mm x 50 mm'lik bir kapak kayması yerleştirin.
3. Mikroskopta bir film ayarlama
   NOT: Aşağıdaki talimatlar, 24 mm x 50 mm kapak kaymasını barındıran bir slayt tutucu ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop içindir (mikroskop, kamera ve yazılım ayrıntıları için Malzeme Tablosuna bakınız). Görüntü elde etmek için 60x yağa daldırma hedefi kullanılır. Diğer mikroskoplar veya diğer slayt tutucular kullanılırken bu protokolün değiştirilmesi gerekebilir. Adım 4.3.2'den adım 4.3.16'ya kadar olan adımları yürütmek için tam adımlar, kullanılan mikroskop ve görüntüleme yazılımına bağlı olarak değişecektir. Farklı bir mikroskop için talimatlar için bölüm 4.4'e bakın.
   1. Kapak kapağını sürgü tutucunun içine yerleştirin. Kalıplama kilini, sürgü tutucuda güvende tutmak için kapak kapağının yan tarafına yapıştırın.
   2. Görüntü alma yazılımını açın. DIC veya brightfield kullanarak hücreleri odaklamak için kurs ve ince ayar düğmelerini kullanın.
   3. Görüntü alma yazılımının ana menüsünde, Dosya > Edinme (3D Çözümle) üzerine tıklayın. Üç pencere açılır.
   4. Resolve 3D adlı pencerede, Erlenmeyer Flask simgesine tıklayın. Bu, hızlandırılmış bir film ayarlamak için deneme oluşturmaya yönelik kontrolleri içeren Tasarla/Denemeyi Çalıştır başlıklı bir pencere açar.
   5. Tasarım sekmesinin altında, Bölümleme etiketli sekmeye gidin. Z Bölümleme'nin yanındaki kutuyu seçin. Z yığınlarını aşağıdaki gibi ayarlayın: Optik kesit aralığı = 1 μm, Optik bölüm sayısı = 5, Numune kalınlığı = 5,0 μm.
   6. Kanallar sekmesinin altında, + simgesini tıklayın, böylece bir kanal seçeneği görünür. Uygun kanalı seçin. Bu deney için, mCherry'yi görüntülemek için kullanılan A594'ü seçtik. Referans Görüntü'nün yanındaki kutuyu seçin ve açılır menüden Z konumunu numunenin ortasına ayarlayın.
   7. Sırasıyla yüzde geçirgenliği ve pozlama süresini ayarlamak için %T ve Exp. öğelerinin yanındaki açılır menüden bir değer seçin. Bu deney için A594 kanalında %2 geçirgenlik ve 250 ms maruz kalma süresi, parlak alan için ise %10 geçirgenlik ve 500 ms maruz kalma süresi kullanılmıştır.
      NOT: Maruz kalma süresi ve yüzde geçirgenliği farklı mikroskoplara göre değişecektir. Aşırı maruz kalmayı önlemek için, ilgilenilen proteinin uygun şekilde görselleştirilmesini sağlayan en düşük yüzde geçirgenliği ve mümkün olan en kısa maruz kalma süresini kullanın.
   8. Hızlandırılmış çekim sekmesinin altında, Hızlandırılmış çekim'in yanındaki kutuyu seçin. Görüntülenen tabloda, hızlandırılmış satırdaki minimum sütunun altına 10 ve toplam zaman satırındaki saatler sütununun altına 10 girin. Bu, 10 saat boyunca her 10 dakikada bir görüntü alan bir zaman kursu çalıştıracaktır.
   9. Film sırasında sahne alanının kaymasını önlemek için Odağı Ultimate Focus ile Koru'nun yanındaki kutuyu seçin. Noktalar sekmesinin altında, Ziyaret Noktası Listesi'nin yanındaki kutuyu seçin.
   10. Ana menüde, > Noktası Listesini Görüntüle'ye tıklayın. Nokta listesi adlı bir pencere açılacaktır. Sahne alanını, odanın tek katmanlı bir hücre gösteren bir alanına taşıyın. Nokta listesi penceresinde Nokta İşareti'ne tıklayın.
   11. Hücrelerin aşırı pozlanmasını önlemek için herhangi bir çakışma olmadan 25-30 nokta seçmek için sahne alanını hareket ettirin. Her alan, her zaman kursu sırasında görüntülenecektir.
   12. Nokta listesi penceresinde, her nokta için nihai odağı ayarlamak üzere Tümünü Kalibre Et'i seçin. Desgin/Run Experiment (Desgin/Denemeyi Çalıştır) penceresindeki Tasarım sekmesinin altında, Nokta Listesini Ziyaret Et'in yanındaki kutuya nokta değerleri aralığını (nokta listesi penceresinden alınan) girin. Çalıştır sekmesi altında, dosyayı bilgisayardaki uygun hedefe kaydedin. Tasarla/Denemeyi Çalıştır penceresinde, filmi başlatmak için Oynat düğmesini (yeşil üçgen simgesi) seçin.
4. İsteğe bağlı yöntem: Mikroskopta film ayarlama
   NOT: Bu talimatlar, 24 mm x 50 mm'lik bir kapak kaymasını barındırabilen bir slayt tutucu ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop içindir. Kullanılan mikroskop, kamera ve görüntüleme yazılımı hakkında teknik özellikler için Malzeme Tablosu'na bakın. Görüntü elde etmek için 60x yağa daldırma hedefi kullanılır.
   1. Kapak kapağını sürgü tutucunun içine yerleştirin. Görüntü alma yazılımını açın. DIC veya brightfield kullanarak hücreleri odaklamak için kurs ve ince ayar düğmelerini kullanın. Yazılımın açık penceresine sağ tıklayın. Bir açılır menü görünecektir.
   2. Edinme Kontrolleri > Edinme'ye tıklayın. Denemeyi Tanımla/Çalıştır > Application (Uygulama Tanımla/Çalıştır) seçeneğine tıklayın. Bu, ND Edinme etiketli bir pencere açacaktır.
   3. Açılan pencerede, XY'nin yanındaki kutuyu işaretleyin. Sahne alanını istediğiniz konuma taşıyın ve o konumu nokta olarak seçmek için Nokta Adı'nın altındaki kutuyu tıklatın. Hücrelerin aşırı pozlanmasını önlemek için herhangi bir örtüşme olmadan 25-30 nokta seçilene kadar bunu tekrarlayın. Her alan, her zaman kursu sırasında görüntülenecektir.
   4. Her floresan kanal için yüzde geçirgenliği ayarlayın. Suşlar Htb2-mCherry ürettiğinden, burada mCherry filtresi kullanılır. 4.3.3 adımında açılan Edinme penceresinin altında, 555 nm düğmesine gidin. 555 nm düğmesinin altındaki kayar ölçeği %5 okuyana kadar ayarlayarak yüzde geçirgenliği %5 olarak ayarlayın.
   5. Her floresan kanal için pozlama süresini ayarlayın. Edinme penceresinin altında, Pozlama açılır menüsünden 200 ms'yi seçin.
      NOT: Maruz kalma süresi ve yüzde geçirgenliği farklı mikroskoplara göre değişecektir. Aşırı maruz kalmayı önlemek için, ilgilenilen proteinin uygun şekilde görselleştirilmesini sağlayan en düşük yüzde geçirgenliği ve mümkün olan en kısa maruz kalma süresini kullanın.
   6. ND Edinme penceresinde Z'nin yanındaki kutuya tıklayın. Maya hücrelerinin 1.2 μM uzaklıktaki beş z-yığınını ayarlayın.
   7. λ'nun yanındaki kutuya tıklayın. Deneme için kullanılacak uygun kanalları seçin. DIC için, Z pos altındaki açılır menüden Ana Sayfa'nın seçili olduğundan emin olun. mCherry için, Z pos altındaki açılır menüden Tümü'nün seçili olduğundan emin olun. Bu, DIC için yalnızca tek bir bölümün (z-yığınının ortasında) alınmasını sağlar.
   8. ND Alma penceresinde Saat'in yanındaki kutuyu seçin. Aşama altındaki kutuyu seçin. Aralık altındaki açılır menüde 10 dakika'yı seçin. Süre altında, 10 saat(ler)i seçin. Bu, görüntülerin 10 saat boyunca her 10 dakikada bir çekileceği şekilde zaman çizelgesi çalışacaktır.

5. Kromatin ayrışmasının analizi

1. Fiji yazılımını açın. Aynı anda bir görüş alanı açın: Her alan için DIC ve mCherry kanallarını açın.
2. Tek bir görüntü elde etmek için mCherry kanalının maksimum yoğunluk projeksiyonunu alın: Image > Stacks > Z Project'e tıklayın, açılır menüden Maksimum Yoğunluk'u seçin.
3. DIC ve mCherry kanallarını tek bir resimde birleştirin: Görüntü > Renk > Kanalları Birleştir'e tıklayın.
4. Mayoz yoluyla tek bir hücreyi takip edin. Mayoz II tamamlandıktan sonra, DNA kütlelerinin sayısını kaydedin.

Sonuçlar

Kromatin ayrışmasını izlemek için, histon proteini Htb2 mCherry ile etiketlendi. Faz I'de, kromatin tek bir Htb2 kütlesi olarak görünür. Homolog kromozomlar ilk mayotik bölünmede ayrıldıktan sonra, kromatin iki ayrı kütle olarak ortaya çıkar (Şekil 3A). Kardeş kromatitler ayrıldıktan sonra, kromatin dört kütle olarak görünür. Bazı kromozomlar iğ mikrotübüllerine tutunamazsa, mayoz I veya mayoz II'den sonra ek kitleler görülebilir.

Y...

Tartışmalar

Bu protokol, hücreleri senkronize etmek için NDT80-in sistemini, çekirdekten proteinleri tüketmek için çapa uzaklaştırma tekniğini ve mayoz sırasında tomurcuklanan maya hücrelerini görüntülemek için floresan hızlandırılmış mikroskopiyi birleştirir. NDT80-in sistemi, bir faz I tutuklaması ve ^4,8'i serbest bırakan mayotik hücre döngüsü senkronizasyonu için bir yöntemdir. Her ne kadar bireysel hücreler sonraki mayotik...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
β-estradiol	Millipore Sigma	E8875	Make 1mM stocks in 95% EtOH
0.22 uM Threaded Bottle-top Filter	Millipore Sigma	S2GPT02RE
100% EtOH	Fisher Scientific	22-032-601
10X PBS	Fisher Scientific	BP399500	Dilute 1:10 to use as solvent for ConA
24 mm x 50 mm coverslip No. 1.5	VWR North American	48393241
25 mm x 75 mm microscope slides	VWR North American	48300-026
Adenine hemisulfate salt	Millipore Sigma	A9126	To supplement SC, SCA, and 1% Kac
Bacto Agar	BD	214030
Concanavialin A	Mllipore Sigma	C2010	Make as 1mg/mL in 1X PBS
CoolSNAP HQ2 CCD camera	Photometrics		Used in Section 4.3
D-glucose	Fisher Scientific	D16-10
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids	BD	291920
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Millipore Sigma	D5879
Eclipse Ti2 inverted-objective micrscope	Nikon		Used in Section 4.4
Fiji	NIH		Download from https://fiji.sc/
GE Personal DeltaVision Microscope	Applied Precision		Used in Section 4.3
L-Tryptophan	Millipore Sigma	T0254	To supplement SC, SCA, and 1% Kac
Modeling Clay	Crayola	2302880000	To secure coverslip in slide holder
NIS-Elements AR 5.30.04 Imaging Software	Nikon		Used in Section 4.4
ORCA-Fustion BT Camera	Hamamatsu	C15440-20UP	Used in Section 4.4
Plastic pipette tip holder	Dot Scientific	LTS1000-HR	Cut a 4 square x 4 square section of the rack portion of this product.
Pottassium Acetate	Fisher Scientific	BP264
Rapamycin	Fisher Scientific	BP29631	Make 1mg/mL stocks in DMSO
Silicone Sealant	Aqueon	100165001	Also known as aquarium glue.
SoftWorx7.0.0  Imaging Software	Applied Precision		Used in Section 4.3
Synthetic Complete Mixture (Kaiser)	Formedium	DSCK2500
Type N immersion oil	Nikon	MXA22166