脱细胞软骨细胞外基质水凝胶的合成

摘要

本文介绍了一种合成脱细胞软骨细胞外基质（DC-ECM）水凝胶的新方法。DC-ECM水凝胶具有优异的生物相容性，为细胞生长提供了优越的微环境。因此，它们可以成为理想的细胞支架和生物递送系统。

摘要

脱细胞软骨细胞外基质（DC-ECM）水凝胶因其生物相容性和模仿天然组织特性的能力而成为组织工程和再生医学的有前途的生物材料。该协议旨在产生与软骨组织的天然ECM非常相似的DC-ECM水凝胶。该方案涉及物理和化学破坏以及酶消化的组合，以去除细胞物质，同时保留ECM的结构和组成。DC-ECM使用化学试剂交联，形成稳定且具有生物活性的水凝胶。DC-ECM水凝胶具有优异的生物活性、空间结构和生物诱导功能，以及低免疫原性。这些特性有利于促进细胞粘附、增殖、分化和迁移，并为细胞生长创造优越的微环境。该协议为组织工程领域的研究人员和临床医生提供了宝贵的资源。仿生水凝胶可以潜在地促进软骨修复和再生的有效组织工程策略的开发。

引言

软骨组织工程是一个快速发展的领域，旨在再生受损或患病的软骨组织¹。该领域的一个关键挑战是开发仿生支架，该支架可以支持软骨细胞的生长和分化，软骨细胞是负责产生软骨^的细胞2。软骨组织的ECM在调节软骨细胞的行为中起着关键作用。DC-ECM 是组织工程应用的有效支架³.

已经开发了许多技术来从软骨组织生产 DC-ECM，包括化学、酶和物理方法。然而，这些方法通常会导致产生不充分仿生的ECM水凝胶，这限制了它们在组织工程应用中的潜力^4,5。因此，需要一种更有效的方法来生产DC-ECM水凝胶。

这项技术的发展很重要，因为它可以通过提供一种新方法来创建可以支持组织再生和修复的仿生支架来推进组织工程领域。此外，该技术可以很容易地适应从其他组织生产ECM水凝胶，从而扩大其潜在应用。

在更广泛的文献中，人们对使用 DC-ECM 作为组织工程应用的支架越来越感兴趣⁶。大量研究表明，DC-ECM 水凝胶在促进各种组织（包括软骨）的细胞生长和分化方面是有效的 ^7,8。因此，开发一种用于生产与软骨组织天然ECM非常相似的DC-ECM水凝胶的方案是对该领域的重大贡献。

本文提出的方案通过提供一种生产DC-ECM水凝胶的新方法来解决这一需求，该水凝胶与软骨组织的天然ECM非常相似。该方案涉及使软骨组织脱细胞，分离所得的ECM，并通过将ECM与生物相容性聚合物交联来产生水凝胶。由此产生的水凝胶在支持软骨细胞的生长和分化方面显示出有希望的结果。

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研究方案

本研究经浙江省同德医院伦理委员会批准。

1. DC-ECM水凝胶的制备

注:在这项研究中，软骨是从12个月大的巴马微型猪的膝关节中获得的，避免了骨组织的收集。

1. 取收集的软骨，用手术刀将其块状切成1-2毫米³ 块。
2. 将 20 g 切碎的软骨放入 50 mL 离心管中，并加入 20 mL 低渗 Tris-HCl 缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0）以完全浸没组织。将离心管置于-80°C冰箱中3小时，然后在37°C烘箱中放置3小时。重复冷冻和加热步骤六次。在此步骤中，不需要更换低渗Tris-HCl缓冲液。
3. 使用涡旋混合器以1,000rpm的速度摇动离心管30秒。将不锈钢筛（孔径:~250μm）放在新的50mL离心管上。
4. 将脱细胞的软骨缓慢倒入不锈钢筛中，用无菌PBS洗涤组织三次，并收集软骨。
5. 加入10mL胰蛋白酶溶液（0.25%胰蛋白酶的PBS溶液），并将试管置于37°C的振荡器上24小时。在此期间，每4小时更换一次胰蛋白酶。使用不锈钢筛过滤悬浮液，并保存组织。胰蛋白酶可以在其中一个消化过程中过夜处理，这不会影响最终消化。
6. 用高渗缓冲液（1.5M NaCl，50mM Tris-HCl，pH 7.6）洗涤胰蛋白酶消化组织。
7. 加入10mL核酸酶溶液（50U / mL脱氧核糖核酸酶和1U / mL核糖核酸酶在10mM Tris-HCl，pH 7.5中），并将管置于37°C的振荡器上4小时。
8. 取出核酸酶溶液，用无菌PBS洗涤软骨三次，加入低渗Tris-HCl溶液。将离心管放在振荡器上，并在室温（RT）下冲洗20小时。
9. 除去低渗Tris-HCl溶液，用无菌PBS洗涤软骨三次，并加入1%Triton X-100溶液将组织浸没24小时。
10. 除去Triton X-100溶液，用蒸馏水彻底冲洗脱细胞软骨3天，每12小时更换一次蒸馏水。
11. 将软骨浸泡在过氧乙酸溶液（0.1%PAA在4%乙醇中）中4小时。除去过氧乙酸溶液，用无菌蒸馏水洗涤软骨三次。
12. 将不锈钢筛（孔径:~250μm）放在50mL离心管上。将脱细胞的软骨慢慢倒入不锈钢筛中，并收集软骨。通过估计 DNA、胶原蛋白和糖胺聚糖 （GAG） 含量来测试软骨的脱细胞程度和基质保留。
13. 将脱细胞软骨放入研磨碗中，加入液氮，将脱细胞软骨研磨成粉末。取脱细胞软骨粉2g，加入0.5M乙酸80mL和胃蛋白酶20mg，消化24小时。以400× g 离心10分钟;弃去沉淀物，收集上清液（DC-ECM溶液）。
14. 每孔倒入 1 mL DC-ECM 溶液到 6 孔板中。将 6 孔板放入冻干机中。冻结 DC-ECM 解决方案。一旦冷冻干燥机中的温度降至-40°C，打开真空泵，并将真空度保持在10Pa22小时。
15. 取出冻干的DC-ECM溶液，将其置于离心管中，并储存在-20°C。 冻干DC-ECM溶液的最短储存期超过半年。
16. 加入 1 mL 无菌蒸馏水，使 20 mg 冻干 DC-ECM 溶液溶解在离心管中。在室温下使用涡旋混合器以1,000rpm的速度摇动1分钟。 向DC-ECM溶液中加入1mg维生素B2（0.1%w / v），在37°C下孵育60分钟，并用紫外光（370nm，3.5mW / cm²）照射3分钟以形成水凝胶（DC-ECM水凝胶）。

2.脱细胞软骨的检测

1. 脱细胞软骨的DNA含量检测
   注意:使用DNEasy血液和组织试剂盒提取DNA。
   1. 首先，在离心管中取 20 mg DC-ECM 软骨。通过涡旋振荡加入180μL缓冲液GTL和20μL蛋白酶K，并将软骨在56°C孵育4小时直至完全溶解。
   2. 使用涡旋混合器在室温下以1,000rpm的速度摇动离心管15秒。接下来，加入 200 μL 缓冲液 GL 和无水乙醇，并通过涡旋振动充分混合。在4°C下以6,000× g 的速度离心样品1分钟。
   3. 向吸附柱中加入500μL缓冲液GW1，并在4°C下以12,000× g 的速度离心样品1分钟。 向吸附柱中加入500μL缓冲液GW2，并在4°C下以20,000× g 离心1分钟。最后，向吸附柱中加入50μL灭菌水，并在4°C下以6,000× g 的速度离心1分钟以收集DNA溶液。使用分光光度计测定DNA含量。
2. 脱细胞软骨中的胶原蛋白含量检测
   1. 为了检测脱细胞软骨中的胶原蛋白含量，使用羟脯氨酸作为胶原氨基酸标志物。在100°C下用5mL 6M盐酸酸化5mg脱细胞软骨20分钟，然后用5mL 6M氢氧化钠溶液中和。
   2. 通过用分光光度计测量样品在570nm处的吸光度来计算羟脯氨酸的含量。使用标准羟脯氨酸样品获得浓度吸收线性回归。
3. 脱细胞软骨中的GAG含量检测
   注:使用组织 GAG 比色定量检测试剂盒检测 DC-ECM 软骨中的 GAG 含量。试剂盒中提供了以下所有试剂。
   1. 取 200 mg DC-ECM 软骨粉，涡旋振荡加入试剂 A 500 μL。将样品在4°C孵育16小时，然后以14,000× g 离心10分钟。
   2. 取试样溶液50 mL，涡旋振荡加高盐溶液（试剂B）50 μL和酸溶液（试剂C）50 μL。将样品孵育 10 分钟。
   3. 通过涡旋振荡加入 750 μL 染料溶液（试剂 D），并将样品在黑暗条件下孵育 30 分钟。将样品以14,000× g 离心10分钟，然后弃去上清液。
   4. 加入 1 μL 清洗液（试剂 E），并充分混合。将样品以14,000× g 离心10分钟，弃去上清液。
   5. 向样品中加入 1 μL 解离溶液（试剂 F），并充分混合。在黑暗条件下孵育样品30分钟。最后，使用600nm的分光光度计测定GAG含量。
4. 扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）分析脱细胞软骨
   1. 比较脱细胞软骨和正常软骨组织。将样品置于2.5%戊二醛溶液中，在4°C下孵育过夜，然后用PBS洗涤三次。
   2. 将样品在1%OsO 4中固定1小时，然后用PBS洗涤3次。
   3. 通过依次浸入50%，70%，90%和100%乙醇以及100%丙酮中脱水15分钟。将样品置于六甲基二硅氮烷和乙醇（1:1）的混合溶液中15分钟，然后浸入纯六甲基二硅氮烷中15分钟。
   4. 将样品放入HCP-2干燥器中，然后使用液氮干燥。然后，使用溅射涂层在完全干燥的试样上涂上一层薄薄的金钯，并使用SEM成像。溅射镀膜以 120 W 的功率进行 5 min。实验在以下条件下进行:工作电压为15 kV，真空度低于5 x 10⁻⁵ Pa。
   5. 对于TEM分析，将样品置于无水丙酮和树脂（1:1）的混合物中1小时，然后将无水丙酮和树脂（1:3）的混合物中放置3小时。然后，将样品放入树脂中过夜。
      1. 将样品置于包埋的培养基填充胶囊中，并在70°C下加热9小时。
      2. 包埋后，使用超细切片机将标本切成70nm薄片，并放置在铜网上。
      3. 将 20 μL 醋酸铀酰染色溶液移液到铜网上，并在室温下染色 15 分钟，用蒸馏水轻轻洗涤网片两次，除去染色溶液。
      4. 然后，将 20 μL 柠檬酸铅染色溶液移液到铜网上，并在室温下染色 15 分钟，用蒸馏水洗涤网片 3 次。
      5. 将铜网放在衬有滤纸的干净培养皿上。风干后，使用TEM拍摄切片。探头向下施加500 nN的力，以1 Hz的速率扫描，弹性常数（k值）为40 ^Nm-1。测得探针尖端的半径为8 nm。

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结果

为了制备更好的DC-ECM软骨水凝胶，我们研究并回顾了以前的文献，并在脱细胞率、免疫原性和机械功能方面比较了各种脱细胞方案⁹。

在此基础上，我们制备了DC-ECM软骨水凝胶，并探讨了径向取向提取基质/间充质干细胞外泌体生物墨水治疗骨软骨缺损的效果。结果表明，DC-ECM软骨水凝胶具有较低的免疫原性，可以增强细胞迁移，促进软骨修复^10<...

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讨论

该方案为制备脱细胞软骨细胞外基质水凝胶提供了一种系统的方法，其紧密模拟软骨组织的天然ECM。该方案涉及物理、化学和酶促破坏的组合，以去除细胞物质，同时保留 ECM 的结构和组成。该协议的关键步骤包括调整脱细胞时间和方法，并确保完全脱细胞。

与其他现有的组织工程和再生医学方法相比，该协议具有几个优点。DC-ECM水凝胶具有优异的生物活性、空间结构和生物...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M Tris-HCl, pH7.6	Beyotime	ST776-100 mL
1 M Tris-HCl, pH8.0	Beyotime	ST780-500 mL
-80 °C Freezer	Eppendorf	F440340034
Deoxyribonuclease	Aladdin	D128600-80KU
DNEasy Blood &Tissue Kit	Qiagen	No. 69506
GAG colorimetric quantitative detection kit	Shanghai Haling	HL19236.2
HCP-2 dryer	Hitachi	N/A
Nanodrop8000	Thermo Fisher	N/A	Spectrophotometer
PBS (10x)	Gibco	70011044
Ribonuclease	Aladdin	R341325-100 mg
Sigma500	ZIESS	N/A	Scanning electron microscope
Spectra S	Thermo Fisher	N/A	Transmission electron microscope
Stainless steel sieve	SHXB-Z-1	Shanghai Xinbu
Triton X-100	Beyotime	P0096-500 mL
Trypsin	Gibco	15050065
Ultraviolet lamp	Omnicure 2000	N/A
Vitamin B2	Gibco	R4500-5G
Vortex mixer	Shanghai Qiasen	78HW-1