Synthese von Hydrogelen aus dezellularisiertem Knorpel mit extrazellulärer Matrix

Zusammenfassung

In dieser Arbeit wird eine neue Methode zur Synthese von Hydrogelen aus dezellularisierter extrazellulärer Knorpelmatrix (DC-ECM) vorgestellt. DC-ECM-Hydrogele haben eine ausgezeichnete Biokompatibilität und bieten eine hervorragende Mikroumgebung für das Zellwachstum. Daher können sie ideale Zellgerüste und biologische Verabreichungssysteme sein.

Zusammenfassung

Hydrogele aus dezellularisierter extrazellulärer Matrix (DC-ECM) sind aufgrund ihrer Biokompatibilität und ihrer Fähigkeit, natürliche Gewebeeigenschaften nachzuahmen, vielversprechende Biomaterialien für das Tissue Engineering und die regenerative Medizin. Dieses Protokoll zielt darauf ab, DC-ECM-Hydrogele herzustellen, die die native EZM von Knorpelgewebe genau nachahmen. Das Protokoll beinhaltet eine Kombination aus physikalischem und chemischem Aufschluss und enzymatischer Verdauung, um das Zellmaterial zu entfernen und gleichzeitig die Struktur und Zusammensetzung der EZM zu erhalten. Das DC-ECM wird mit einem chemischen Mittel vernetzt, um ein stabiles und biologisch aktives Hydrogel zu bilden. Das DC-ECM-Hydrogel hat eine ausgezeichnete biologische Aktivität, räumliche Struktur und biologische Induktionsfunktion sowie eine geringe Immunogenität. Diese Eigenschaften sind vorteilhaft bei der Förderung der Zelladhäsion, -proliferation, -differenzierung und -migration und bei der Schaffung einer überlegenen Mikroumgebung für das Zellwachstum. Dieses Protokoll stellt eine wertvolle Ressource für Forscher und Kliniker auf dem Gebiet des Tissue Engineering dar. Biomimetische Hydrogele können potenziell die Entwicklung effektiver Tissue-Engineering-Strategien für die Knorpelreparatur und -regeneration verbessern.

Einleitung

Das Knorpelgewebe-Engineering ist ein sich schnell entwickelndes Gebiet, das darauf abzielt, beschädigtes oder erkranktes Knorpelgewebe zu regenerieren¹. Eine zentrale Herausforderung auf diesem Gebiet ist die Entwicklung biomimetischer Gerüste, die das Wachstum und die Differenzierung von Chondrozyten, den Zellen, die für die Produktion von Knorpel verantwortlich sind, unterstützen können². Die EZM des Knorpelgewebes spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung des Verhaltens von Chondrozyten. DC-ECM ist ein effektives Gerüst für Tissue-Engineering-Anwendungen³.

Es wurde eine Reihe von Techniken entwickelt, um DC-ECM aus Knorpelgewebe herzustellen, einschließlich chemischer, enzymatischer und physikalischer Methoden. Diese Methoden führen jedoch häufig zur Erzeugung von EZM-Hydrogelen, die nicht ausreichend biomimetisch sind, was ihr Potenzial für den Einsatz in Tissue-Engineering-Anwendungen einschränkt ^4,5. Daher besteht ein Bedarf an einer effektiveren Methode zur Herstellung von DC-ECM-Hydrogelen.

Die Entwicklung dieser Technik ist wichtig, weil sie das Gebiet des Tissue Engineering voranbringen kann, indem sie einen neuen Ansatz für die Herstellung biomimetischer Gerüste bietet, die die Regeneration und Reparatur von Gewebe unterstützen können. Darüber hinaus könnte diese Technik leicht angepasst werden, um ECM-Hydrogele aus anderen Geweben herzustellen und damit ihre Anwendungsmöglichkeiten zu erweitern.

In der breiteren Literatur besteht ein wachsendes Interesse an der Verwendung von DC-ECM als Gerüst für Tissue-Engineering-Anwendungen⁶. Zahlreiche Studien haben die Wirksamkeit von DC-ECM-Hydrogelen bei der Förderung des Zellwachstums und der Zelldifferenzierung in verschiedenen Geweben, einschließlich Knorpel, nachgewiesen ^7,8. Daher ist die Entwicklung eines Protokolls zur Herstellung von DC-ECM-Hydrogelen, die die natürliche EZM von Knorpelgewebe genau nachahmen, ein wichtiger Beitrag auf diesem Gebiet.

Das in dieser Arbeit vorgestellte Protokoll adressiert diesen Bedarf, indem es eine neuartige Methode zur Herstellung von DC-ECM-Hydrogelen bereitstellt, die die natürliche EZM von Knorpelgewebe genau nachahmen. Das Protokoll beinhaltet die Dezellularisierung von Knorpelgewebe, die Isolierung der resultierenden EZM und die Herstellung eines Hydrogels durch Vernetzung der EZM mit einem biokompatiblen Polymer. Das resultierende Hydrogel hat vielversprechende Ergebnisse bei der Unterstützung des Wachstums und der Differenzierung von Chondrozyten gezeigt.

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Protokoll

Diese Studie wurde von der Ethikkommission des Tongde-Krankenhauses in der Provinz Zhejiang genehmigt.

1. Herstellung des DC-ECM-Hydrogels

HINWEIS: In dieser Studie wurde der Knorpel aus den Kniegelenken von 12 Monate alten Bama-Minischweinen gewonnen, wodurch die Ansammlung von Knochengewebe vermieden wurde.

1. Nehmen Sie den gesammelten Knorpel, blockieren Sie ihn und hacken Sie ihn mit einem Skalpell in 1-2 mm³ Stücke.
2. Geben Sie 20 g des gehackten Knorpels in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen und fügen Sie 20 ml hypotonen Tris-HCl-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0) hinzu, um das Gewebe vollständig einzutauchen. Das Zentrifugenröhrchen für 3 h in einen Gefrierschrank von −80 °C und anschließend für 3 h in einen 37 °C heißen Ofen stellen. Wiederholen Sie den Schritt zum Einfrieren und Erhitzen sechsmal. In diesem Schritt muss der hypotone Tris-HCl-Puffer nicht ausgetauscht werden.
3. Das Zentrifugenröhrchen mit einem Vortex-Mischer bei einer Drehzahl von 1.000 U/min 30 s schütteln. Ein Edelstahlsieb (Porengröße: ~250 μm) auf ein neues 50-ml-Zentrifugenröhrchen legen.
4. Dekantieren Sie den dezellularisierten Knorpel langsam in das Edelstahlsieb, waschen Sie das Gewebe dreimal mit sterilem PBS und sammeln Sie den Knorpel.
5. Fügen Sie 10 ml Trypsinlösung (0,25 % Trypsin in PBS) hinzu und stellen Sie das Röhrchen 24 Stunden lang bei 37 °C auf einen Schüttler. Während dieser Zeit sollte das Trypsin alle 4 Stunden ausgetauscht werden. Filtrieren Sie die Suspension mit dem Edelstahlsieb und konservieren Sie das Gewebe. Das Trypsin kann während eines der Verdauungsprozesse über Nacht behandelt werden, ohne dass dies die endgültige Verdauung beeinträchtigt.
6. Waschen Sie das trypsinisierte Gewebe mit hypertonem Puffer (1,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,6).
7. Geben Sie 10 ml Nukleaselösung (50 U/ml Desoxyribonuklease und 1 U/ml Ribonuklease in 10 mM Tris-HCl, pH 7,5) hinzu und stellen Sie das Röhrchen 4 h lang bei 37 °C auf einen Schüttler.
8. Entfernen Sie die Nukleaselösung, waschen Sie den Knorpel dreimal mit sterilem PBS und fügen Sie hypotone Tris-HCl-Lösung hinzu. Stellen Sie das Zentrifugenröhrchen auf einen Schüttler und spülen Sie es 20 Stunden lang bei Raumtemperatur (RT).
9. Entfernen Sie die hypotone Tris-HCl-Lösung, waschen Sie den Knorpel dreimal mit sterilem PBS und fügen Sie 1% Triton X-100-Lösung hinzu, um das Gewebe 24 Stunden lang einzutauchen.
10. Entfernen Sie die Triton X-100-Lösung und spülen Sie den dezellularisierten Knorpel 3 Tage lang gründlich mit destilliertem Wasser ab, wobei das destillierte Wasser alle 12 Stunden gewechselt wird.
11. Weichen Sie den Knorpel 4 h lang in Peressigsäurelösung (0,1 % PAA in 4 % Ethanol) ein. Entfernen Sie die Peressigsäurelösung und waschen Sie den Knorpel dreimal mit sterilem destilliertem Wasser.
12. Platzieren Sie das Edelstahlsieb (Porengröße: ~250 μm) auf ein 50 mL Zentrifugenröhrchen. Den dezellularisierten Knorpel langsam in das Edelstahlsieb umfüllen und den Knorpel auffangen. Testen Sie den Grad der Dezellularisierung und die Matrixretention des Knorpels, indem Sie den DNA-, Kollagen- und Glykosaminoglykangehalt (GAG) abschätzen.
13. Geben Sie den dezellularisierten Knorpel in eine Mahlschüssel, fügen Sie flüssigen Stickstoff hinzu und mahlen Sie den dezellularisierten Knorpel zu einem Pulver. Nehmen Sie 2 g des dezellularisierten Knorpelpulvers, fügen Sie 80 ml 0,5 M Essigsäure und 20 mg Pepsin hinzu und verdauen Sie es 24 Stunden lang. Zentrifugieren bei 400 x g für 10 min; Verwerfen Sie das Sediment und sammeln Sie die überstehende Lösung (DC-ECM-Lösung).
14. 1 ml DC-ECM-Lösung pro Well in 6-Well-Platten dekantieren. Legen Sie die 6-Well-Platten in einen Gefriertrockner. Frieren Sie die DC-ECM-Lösung ein. Sobald die Temperatur im Gefriertrockner auf −40 °C gesunken ist, schalten Sie die Vakuumpumpe ein und halten Sie das Vakuum 22 Stunden lang bei 10 Pa.
15. Nehmen Sie die gefriergetrocknete DC-ECM-Lösung heraus, geben Sie sie in Zentrifugenröhrchen und lagern Sie sie bei −20 °C. Die Mindestlagerdauer der gefriergetrockneten DC-ECM-Lösung beträgt mehr als ein halbes Jahr.
16. Fügen Sie 1 ml steriles destilliertes Wasser hinzu, um 20 mg gefriergetrocknete DC-ECM-Lösung im Zentrifugenröhrchen aufzulösen. 1 Minute lang mit einem Vortex-Mischer bei einer Drehzahl von 1.000 U/min bei RT schütteln. 1 mg Vitamin B2 (0,1 % w/v) zur DC-ECM-Lösung geben, 60 min bei 37 °C inkubieren und 3 min lang mit UV-Licht (370 nm, 3,5 mW/^cm2) bestrahlen, um ein Hydrogel (DC-ECM-Hydrogel) zu bilden.

2. Nachweis von dezellularisiertem Knorpel

1. Nachweis des DNA-Gehalts von dezellularisiertem Knorpel
   HINWEIS: Extrahieren Sie die DNA mit dem DNEasy Blood & Tissue Kit.
   1. Nehmen Sie zunächst 20 mg DC-ECM-Knorpel in ein Zentrifugenröhrchen ein. Fügen Sie 180 μl Buffer GTL und 20 μl Proteinase K durch Vortex-Oszillation hinzu und inkubieren Sie den Knorpel bei 56 °C für 4 Stunden, bis er vollständig aufgelöst ist.
   2. Schütteln Sie das Zentrifugenröhrchen 15 s lang mit einem Vortex-Mischer bei einer Drehzahl von 1.000 U/min bei RT. Als nächstes fügen Sie 200 μl Buffer GL und wasserfreies Ethanol hinzu und mischen Sie es gründlich durch Vortex-Vibration. Die Proben werden 1 min bei einer Geschwindigkeit von 6.000 x g bei 4 °C zentrifugiert.
   3. Geben Sie 500 μl Puffer GW1 in die Adsorptionssäule und zentrifugieren Sie die Proben 1 Minute lang bei einer Geschwindigkeit von 12.000 x g bei 4 °C. 500 μl Puffer GW2 in die Adsorptionssäule geben und bei 20.000 x g bei 4 °C 1 min zentrifugieren. Zum Schluss werden 50 μl sterilisiertes Wasser in die Adsorptionssäule gegeben und 1 min lang bei einer Geschwindigkeit von 6.000 x g bei 4 °C zentrifugiert, um die DNA-Lösung zu sammeln. Bestimmen Sie den DNA-Gehalt mit einem Spektralphotometer.
2. Nachweis des Kollagengehalts im dezellularisierten Knorpel
   1. Um den Kollagengehalt im dezellularisierten Knorpel nachzuweisen, verwenden Sie Hydroxyprolin als Kollagenaminosäuremarker. 5 mg dezellularisierter Knorpel mit 5 ml 6 M Salzsäure bei 100 °C für 20 min angesäuert und dann mit 5 ml einer 6 M Natronlauge neutralisiert.
   2. Berechnen Sie den Gehalt an Hydroxyprolin, indem Sie die Absorption der Probe bei 570 nm mit einem Spektralphotometer messen. Erhalten Sie eine lineare Konzentrations-Absorptions-Regression mit der Standard-Hydroxyprolin-Probe.
3. Nachweis des GAG-Gehalts im dezellularisierten Knorpel
   HINWEIS: Der GAG-Gehalt im DC-ECM-Knorpel wurde mit einem kolorimetrischen quantitativen GAG-Nachweiskit für Gewebe nachgewiesen. Alle unten aufgeführten Reagenzien sind im Kit enthalten.
   1. Nehmen Sie 200 mg DC-ECM-Knorpelpulver und fügen Sie 500 μl Reagenz A durch Wirbeloszillation hinzu. Die Probe wird 16 h lang bei 4 °C inkubiert und dann 10 min lang bei 14.000 x g zentrifugiert.
   2. Nehmen Sie 50 ml Probenlösung und fügen Sie 50 μl salzreiche Lösung (Reagenz B) und 50 μl Säurelösung (Reagenz C) durch Vortex-Oszillation hinzu. Inkubieren Sie die Probe 10 Minuten lang.
   3. Geben Sie 750 μl Farbstofflösung (Reagenz D) durch Wirbeloszillation hinzu und inkubieren Sie die Probe 30 Minuten lang unter dunklen Bedingungen. Die Probe wird 10 min lang bei 14.000 x g zentrifugiert und dann der Überstand verworfen.
   4. Fügen Sie 1 μl Reinigungslösung (Reagenz E) hinzu und mischen Sie es gut. Die Probe wird 10 min lang bei 14.000 x g zentrifugiert und der Überstand verworfen.
   5. 1 μl Dissoziationslösung (Reagenz F) zur Probe geben und gut mischen. Die Probe wird 30 Minuten lang unter dunklen Bedingungen inkubiert. Zum Schluss wird der GAG-Gehalt mit einem Spektralphotometer bei 600 nm bestimmt.
4. Rasterelektronenmikroskopische (REM) und transmissionselektronenmikroskopische (TEM) Analyse des dezellularisierten Knorpels
   1. Vergleichen Sie den dezellularisierten Knorpel mit dem normalen Knorpelgewebe. Die Probe wird in eine 2,5%ige Glutaraldehydlösung gegeben, über Nacht bei 4 °C inkubiert und dann dreimal mit PBS gewaschen.
   2. Die Probe wird 1 h lang in 1 % OsO4 fixiert und dann dreimal mit PBS gewaschen.
   3. Dehydrieren Sie die Probe durch sequentielles Eintauchen in 50 %, 70 %, 90 % und 100 % Ethanol sowie 100 % Aceton für jeweils 15 Minuten. Die Probe wird 15 Minuten lang in eine gemischte Lösung aus Hexamethyldisilazan und Ethanol (1:1) gegeben, gefolgt von einem 15-minütigen Eintauchen in reines Hexamethyldisilazan.
   4. Geben Sie die Probe in einen HCP-2-Trockner und trocknen Sie sie dann mit flüssigem Stickstoff. Beschichten Sie dann die vollständig getrocknete Probe mit einer dünnen Schicht Gold-Palladium mit Sputterbeschichtung und bestücken Sie sie mit REM. Die Sputterbeschichtung wurde bei einer Leistung von 120 W für 5 min durchgeführt. Das Experiment wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt: einer Arbeitsspannung von 15 kV und einem Vakuumgrad von weniger als 5 x 10⁻⁵ Pa.
   5. Für die TEM-Analyse wird die Probe 1 h lang in eine Mischung aus wasserfreiem Aceton und Harz (1:1) gegeben, gefolgt von einer Mischung aus wasserfreiem Aceton und Harz (1:3) für 3 h. Legen Sie die Probe dann über Nacht in Harz.
      1. Die Probe wird in mit Medium gefüllte Kapseln gegeben und 9 h lang bei 70 °C erhitzt.
      2. Nach dem Einbetten wird die Probe mit einem ultrafeinen Mikrotom in 70 nm dünne Scheiben geschnitten und auf ein Kupfergitter gelegt.
      3. Pitrieren Sie 20 μl Uranylacetat-Färbelösung auf das Kupfergewebe und färben Sie es 15 Minuten lang bei RT. Entfernen Sie die Färbelösung, indem Sie das Netz zweimal vorsichtig mit destilliertem Wasser waschen.
      4. Dann pipetiert man 20 μl Bleicitrat-Färbelösung auf das Kupfergewebe und färbt es 15 Minuten lang bei RT. Waschen Sie das Netz dreimal mit destilliertem Wasser.
      5. Legen Sie das Kupfergeflecht auf eine saubere, mit Filterpapier ausgelegte Petrischale. Nach dem Trocknen an der Luft fotografieren Sie die Abschnitte mit TEM. Die Sonde wurde mit einer Abwärtskraft von 500 nN angelegt, mit einer Rate von 1 Hz abgetastet und hatte eine elastische Konstante (^k-Wert) von 40 Nm-1. Der Radius der Sondenspitze wurde mit 8 nm gemessen.

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Ergebnisse

Um ein besseres DC-ECM-Knorpelhydrogel herzustellen, haben wir die bisherige Literatur studiert und überprüft und die verschiedenen Dezellularisierungsprotokolle in Bezug auf das Dezellularisierungsverhältnis, die Immunogenität und die mechanische Funktionalität verglichen⁹.

Auf dieser Basis stellten wir das DC-ECM-Knorpelhydrogel her und untersuchten die Wirkung einer radial orientierten extraktiven Matrix/mesenchymalen Stammzell-Bio-Tinte bei der Behandlung osteo...

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Diskussion

Dieses Protokoll bietet einen systematischen Ansatz für die Herstellung von hydrogelen aus dezellularisiertem Knorpel mit extrazellulärer Matrix, die die native EZM von Knorpelgewebe genau nachahmen. Das Protokoll beinhaltet eine Kombination aus physikalischer, chemischer und enzymatischer Störung, um zelluläres Material zu entfernen und gleichzeitig die Struktur und Zusammensetzung der EZM zu erhalten. Zu den kritischen Schritten des Protokolls gehören die Anpassung der Dezellularisierungszeit und -methoden sowie d...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M Tris-HCl, pH7.6	Beyotime	ST776-100 mL
1 M Tris-HCl, pH8.0	Beyotime	ST780-500 mL
-80 °C Freezer	Eppendorf	F440340034
Deoxyribonuclease	Aladdin	D128600-80KU
DNEasy Blood &Tissue Kit	Qiagen	No. 69506
GAG colorimetric quantitative detection kit	Shanghai Haling	HL19236.2
HCP-2 dryer	Hitachi	N/A
Nanodrop8000	Thermo Fisher	N/A	Spectrophotometer
PBS (10x)	Gibco	70011044
Ribonuclease	Aladdin	R341325-100 mg
Sigma500	ZIESS	N/A	Scanning electron microscope
Spectra S	Thermo Fisher	N/A	Transmission electron microscope
Stainless steel sieve	SHXB-Z-1	Shanghai Xinbu
Triton X-100	Beyotime	P0096-500 mL
Trypsin	Gibco	15050065
Ultraviolet lamp	Omnicure 2000	N/A
Vitamin B2	Gibco	R4500-5G
Vortex mixer	Shanghai Qiasen	78HW-1