סינתזה של הידרוג'לים מטריצה חוץ-תאית סחוס דה-תאי

Summary

מאמר זה מציג שיטה חדשה לסינתזה של הידרוג'לים חוץ-תאיים של מטריצה חוץ-תאית של סחוס דה-צלולרי (DC-ECM). להידרוג'ל DC-ECM יש תאימות ביולוגית מצוינת והם מספקים מיקרו-סביבה מעולה לצמיחת תאים. לכן, הם יכולים להיות פיגומים תאים אידיאליים ומערכות העברה ביולוגיות.

Abstract

הידרוג'לים של מטריצה חוץ-תאית לסחוס דה-תאי (DC-ECM) הם ביו-חומרים מבטיחים להנדסת רקמות ולרפואה רגנרטיבית בשל התאימות הביולוגית שלהם ויכולתם לחקות תכונות רקמות טבעיות. פרוטוקול זה נועד לייצר הידרוג'לים DC-ECM המחקים באופן הדוק את ה- ECM המקורי של רקמת הסחוס. הפרוטוקול כולל שילוב של שיבוש פיזיקלי וכימי ועיכול אנזימטי לסילוק החומר התאי תוך שמירה על המבנה וההרכב של ה-ECM. DC-ECM מקושר באמצעות חומר כימי ליצירת הידרוג'ל יציב ופעיל ביולוגית. להידרוג'ל DC-ECM פעילות ביולוגית מצוינת, מבנה מרחבי ופונקציית אינדוקציה ביולוגית, כמו גם אימונוגניות נמוכה. מאפיינים אלה מועילים בקידום הידבקות תאים, התרבות, התמיינות ונדידה וליצירת מיקרו-סביבה מעולה לצמיחת תאים. פרוטוקול זה מספק משאב רב ערך לחוקרים וקלינאים בתחום הנדסת הרקמות. הידרוג'לים ביומימטיים יכולים לשפר את הפיתוח של אסטרטגיות יעילות להנדסת רקמות לתיקון והתחדשות סחוס.

Introduction

הנדסת רקמת סחוס היא תחום המתפתח במהירות המבקש לחדש רקמת סחוס פגועה או חולה¹. אחד האתגרים המרכזיים בתחום זה הוא פיתוח פיגומים ביומימטיים שיכולים לתמוך בגדילה ובהתמיינות של כונדרוציטים, התאים האחראים לייצור סחוס². ECM של רקמת הסחוס משחק תפקיד קריטי בוויסות ההתנהגות של chondrocytes. DC-ECM הוא פיגום יעיל ליישומי הנדסת רקמות³.

מספר טכניקות פותחו לייצור DC-ECM מרקמת סחוס, כולל שיטות כימיות, אנזימטיות ופיזיקליות. עם זאת, שיטות אלה גורמות לעתים קרובות לייצור הידרוג'לים ECM שאינם ביומימטיים מספיק, מה שמגביל את הפוטנציאל שלהם לשימוש ביישומי הנדסת רקמות ^4,5. לכן, יש צורך בשיטה יעילה יותר לייצור הידרוג'לים DC-ECM.

הפיתוח של טכניקה זו חשוב מכיוון שהיא יכולה לקדם את תחום הנדסת הרקמות על ידי מתן גישה חדשה ליצירת פיגומים ביומימטיים שיכולים לתמוך בהתחדשות רקמות ותיקונן. יתר על כן, טכניקה זו יכולה להיות מותאמת בקלות לייצור הידרוג'ל ECM מרקמות אחרות, ובכך להרחיב את היישומים הפוטנציאליים שלה.

בגוף הספרות הרחב יותר, יש עניין גובר בשימוש ב- DC-ECM כפיגום ליישומי הנדסת רקמות⁶. מחקרים רבים הוכיחו את יעילותם של הידרוג'לים DC-ECM בקידום גדילת תאים והתמיינותם ברקמות שונות, כולל סחוס ^7,8. לכן, פיתוח פרוטוקול לייצור הידרוג'ל DC-ECM המחקה באופן הדוק את ה-ECM הטבעי של רקמת הסחוס הוא תרומה משמעותית לתחום.

הפרוטוקול המוצג במאמר זה עונה על צורך זה על ידי מתן שיטה חדשנית לייצור הידרוג'לים DC-ECM המחקים באופן הדוק את ה- ECM הטבעי של רקמת הסחוס. הפרוטוקול כולל דה-צלולריזציה של רקמת הסחוס, בידוד ה-ECM המתקבל ויצירת הידרוג'ל על ידי קישור צולב של ה-ECM עם פולימר תואם ביולוגית. ההידרוג'ל שהתקבל הראה תוצאות מבטיחות בתמיכה בצמיחה ובהתמיינות של כונדרוציטים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים טונגדה במחוז ג'ג'יאנג.

1. הכנת הידרוג'ל DC-ECM

הערה: במחקר זה, הסחוס התקבל מפרקי הברכיים של חזירי באמה מיניאטוריים בני 12 חודשים, תוך הימנעות מאיסוף רקמת עצם.

1. קח את הסחוס שנאסף, לחסום ולקצוץ אותו לתוך 1-2 מ"מ³ חתיכות עם אזמל.
2. מניחים 20 גרם של הסחוס הטחון בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל, ומוסיפים 20 מ"ל של חיץ Tris-HCl היפוטוני (10 mM Tris-HCl, pH 8.0) כדי לטבול את הרקמה לחלוטין. מכניסים את צינור הצנטריפוגה למקפיא של -80°C למשך 3 שעות ולאחר מכן לתנור של 37°C למשך 3 שעות. חזרו על שלב ההקפאה והחימום שש פעמים. בשלב זה, מאגר Tris-HCl היפוטוני אינו זקוק להחלפה.
3. נערו את צינור הצנטריפוגה למשך 30 שניות באמצעות מערבל מערבולות במהירות של 1,000 סל"ד. הניחו מסננת נירוסטה (גודל נקבוביות: ~ 250 מיקרומטר) על צינור צנטריפוגה חדש של 50 מ"ל.
4. מרוקנים באיטיות את הסחוס נטול התאים לתוך מסננת הנירוסטה, שוטפים את הרקמה שלוש פעמים עם PBS סטרילי, ואוספים את הסחוס.
5. הוסף 10 מ"ל של תמיסת טריפסין (0.25% טריפסין ב- PBS), והנח את הצינור על שייקר ב 37 ° C למשך 24 שעות. במהלך תקופה זו, להחליף את טריפסין כל 4 שעות. מסננים את המתלה באמצעות מסננת הנירוסטה, ושומרים על הרקמה. טריפסין ניתן לטפל בן לילה במהלך אחד מתהליכי העיכול, וזה לא ישפיע על העיכול הסופי.
6. לשטוף את הרקמה טריפסינית עם חיץ hypertonic (1.5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.6).
7. הוסף 10 מ"ל של תמיסת נוקלאז (50 U/mL deoxyribonuclease ו-1 U/mL ribonuclease ב-10 mM Tris-HCl, pH 7.5), והנח את הצינור על שייקר ב-37°C למשך 4 שעות.
8. הסר את תמיסת הנוקלאז, שטוף את הסחוס שלוש פעמים עם PBS סטרילי, והוסף תמיסת Tris-HCl היפוטונית. הניחו את צינור הצנטריפוגה על שייקר, ושטפו במשך 20 שעות בטמפרטורת החדר (RT).
9. הסר את תמיסת Tris-HCl ההיפוטונית, שטוף את הסחוס שלוש פעמים עם PBS סטרילי, והוסף תמיסת טריטון X-100 1% כדי לטבול את הרקמה למשך 24 שעות.
10. הסר את תמיסת Triton X-100, ושטוף ביסודיות את הסחוס decellularized עם מים מזוקקים במשך 3 ימים, החלפת המים המזוקקים כל 12 שעות.
11. השרו את הסחוס בתמיסת חומצה פראצטית (0.1% PAA ב-4% אתנול) למשך 4 שעות. מוציאים את תמיסת החומצה הפרצטית ושוטפים את הסחוס שלוש פעמים במים מזוקקים סטריליים.
12. הניחו את מסננת הנירוסטה (גודל נקבוביות: ~ 250 מיקרומטר) על צינור צנטריפוגה של 50 מ"ל. מרוקנים לאט לאט את הסחוס הדה-צלולרי לתוך מסננת הנירוסטה, ואוספים את הסחוס. בדוק את מידת הדה-צלולריזציה ואת שימור המטריצה של הסחוס על ידי הערכת תכולת ה- DNA, הקולגן והגליקוזאמינוגליקן (GAG).
13. הכניסו את הסחוס נטול התאים לקערת שחיקה, הוסיפו חנקן נוזלי וטחנו את הסחוס נטול התאים ליצירת אבקה. קח 2 גרם של אבקת סחוס decellularized, להוסיף 80 מ"ל של 0.5 M חומצה אצטית ו 20 מ"ג של pepsin, ולעכל במשך 24 שעות. צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 10 דקות; השליכו את המשקעים, ואספו את תמיסת הסופרנאטנט (תמיסת DC-ECM).
14. דקנט 1 מ"ל של פתרון DC-ECM לכל באר לתוך לוחות 6 באר. מניחים את צלחות 6 באר בליופיליזר. הקפיא את פתרון DC-ECM. ברגע שהטמפרטורה במייבש ההקפאה יורדת ל -40 מעלות צלזיוס, הפעל את משאבת הוואקום, ושמור על מידת הוואקום ב -10 Pa למשך 22 שעות.
15. הוציאו את תמיסת DC-ECM המיובשת בהקפאה, הניחו אותה בצינורות צנטריפוגות ואחסנו בטמפרטורה של -20°C. תקופת האחסון המינימלית של פתרון DC-ECM מיובש בהקפאה עולה על חצי שנה.
16. הוסף 1 מ"ל של מים מזוקקים סטריליים כדי להמיס 20 מ"ג של תמיסת DC-ECM מיובשת בהקפאה בצינור הצנטריפוגה. נערו במשך דקה אחת באמצעות מערבול מערבולת במהירות של 1,000 סל"ד ב-RT. הוסיפו 1 מ"ג ויטמין B2 (0.1% w/v) לתמיסת DC-ECM, דגרו ב-37°C למשך 60 דקות, והקרינו באור UV (370 ננומטר, 3.5 mW/cm²) למשך 3 דקות ליצירת הידרוג'ל (DC-ECM hydrogel).

2. איתור סחוס דה-צלולרי

1. זיהוי תכולת DNA של סחוס דה-סלולרי
   הערה: חלץ את הדנ"א באמצעות ערכת הדם והרקמות של DNEasy.
   1. ראשית, יש ליטול 20 מ"ג סחוס DC-ECM בצינור צנטריפוגה. הוסף 180 μL של Buffer GTL ו 20 μL של Proteinase K על ידי תנודת מערבולת, ודגר על הסחוס ב 56 ° C במשך 4 שעות עד שהוא מומס לחלוטין.
   2. נערו את צינור הצנטריפוגה למשך 15 שניות באמצעות מערבל מערבולות במהירות של 1,000 סל"ד ב-RT. לאחר מכן, להוסיף 200 μL של Buffer GL ואתנול נטול מים, ולערבב היטב על ידי רטט מערבולת. צנטריפוגה את הדגימות במשך דקה אחת במהירות של 6,000 x גרם ב 4 ° C.
   3. הוסף 500 μL של Buffer GW1 לעמודת הספיחה, וצנטריפוגה את הדגימות למשך דקה אחת במהירות של 12,000 x גרם ב 4 ° C. הוסף 500 μL של Buffer GW2 לעמודת הספיחה, וצנטריפוגה ב- 20,000 x g ב- 4 ° C למשך דקה אחת. לבסוף, הוסף 50 μL של מים מעוקרים לעמודת הספיחה, וצנטריפוגה למשך דקה אחת במהירות של 6,000 x גרם ב 4 ° C כדי לאסוף את תמיסת ה- DNA. קבע את תכולת ה- DNA באמצעות ספקטרופוטומטר.
2. זיהוי תכולת קולגן בסחוס נטול תאים
   1. כדי לזהות את תכולת הקולגן בסחוס נטול תאים, השתמשו בהידרוקסיפרולין כסמן חומצת אמינו של קולגן. להחמיץ, 5 מ"ג של סחוס decellularized עם 5 מ"ל של 6 M חומצה הידרוכלורית ב 100 ° C במשך 20 דקות, ולאחר מכן לנטרל אותו עם 5 מ"ל של 6 M תמיסת נתרן הידרוקסיד.
   2. חשב את התוכן של hydroxyproline על ידי מדידת ספיגת המדגם ב 570 ננומטר עם ספקטרופוטומטר. קבל רגרסיה ליניארית של ספיגת ריכוז באמצעות דגימת הידרוקסיפרולין סטנדרטית.
3. זיהוי תוכן GAG בסחוס הדה-תאי
   הערה: תוכן ה- GAG בסחוס DC-ECM זוהה באמצעות ערכת זיהוי כמותי קולורימטרי של GAG רקמות. כל הריאגנטים להלן זמינים בערכה.
   1. קח 200 מ"ג של אבקת סחוס DC-ECM, ולהוסיף 500 μL של מגיב A על ידי תנודת מערבולת. לדגור את הדגימה ב 4 ° C במשך 16 שעות, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 14,000 x גרם במשך 10 דקות.
   2. קח 50 מ"ל של תמיסת דגימה, והוסף 50 μL של תמיסת מלח גבוהה (מגיב B) ו 50 μL של תמיסת חומצה (מגיב C) על ידי תנודת מערבולת. לדגור על הדגימה במשך 10 דקות.
   3. הוסף 750 μL של תמיסת צבע (מגיב D) על ידי תנודת מערבולת, ודגר על הדגימה במשך 30 דקות בתנאים חשוכים. צנטריפוגה את הדגימה ב 14,000 x גרם במשך 10 דקות, ולאחר מכן להשליך את supernatant.
   4. מוסיפים 1 μL של תמיסת ניקוי (מגיב E), ומערבבים היטב. צנטריפוגו את הדגימה במהירות של 14,000 x גרם למשך 10 דקות, והשליכו את הסופרנטנט.
   5. מוסיפים 1 μL של תמיסת דיסוציאציה (מגיב F) לדגימה, ומערבבים היטב. יש לדגור על הדגימה במשך 30 דקות בתנאי חושך. לבסוף, לקבוע את תוכן GAG באמצעות ספקטרופוטומטר ב 600 ננומטר.
4. ניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM) של הסחוס הדה-תאי
   1. השווה בין הסחוס הדה-צלולרי לבין רקמת הסחוס הרגילה. יש להניח את הדגימה בתמיסת גלוטראלדהיד 2.5%, לדגור בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה ולאחר מכן לשטוף עם PBS שלוש פעמים.
   2. תקן את הדגימה ב- 1% OsO4 למשך שעה ולאחר מכן שטוף שלוש פעמים עם PBS.
   3. יש לייבש את הדגימה על ידי טבילה רציפה באתנול 50%, 70%, 90% ו-100%, כמו גם 100% אצטון למשך 15 דקות כל אחד. הניחו את הדגימה בתמיסה מעורבת של הקסמתילדיסילאזאן ואתנול (1:1) למשך 15 דקות, ולאחר מכן טבלו בהקסמתילדיסילאזאן טהור למשך 15 דקות.
   4. הניחו את הדגימה במייבש HCP-2, ולאחר מכן יבשו באמצעות חנקן נוזלי. לאחר מכן, צפו את הדגימה המיובשת במלואה בשכבה דקה של פלדיום זהב באמצעות ציפוי מרזב, וצפו באמצעות SEM. ציפוי המרזב בוצע בהספק של 120 W למשך 5 דקות. הניסוי בוצע בתנאים הבאים: מתח עבודה של 15 קילו וולט, ודרגת ואקום נמוכה מ-5 x ^10-5 Pa.
   5. עבור ניתוח TEM, מקם את הדגימה בתערובת של אצטון נטול מים ושרף (1: 1) במשך 1 שעות, ואחריו תערובת של אצטון נטול מים ושרף (1: 3) במשך 3 שעות. לאחר מכן, הניחו את הדגימה בשרף למשך הלילה.
      1. מניחים את הדגימה בכמוסות מלאות בינוניות, ומחממים ב-70°C למשך 9 שעות.
      2. לאחר ההטבעה, חותכים את הדגימה לפרוסות דקות של 70 ננומטר באמצעות מיקרוטום דק במיוחד, ומניחים על רשת נחושת.
      3. יש למרוח 20 μL של תמיסת צביעת אורניל אצטט על רשת הנחושת, ולהכתים למשך 15 דקות ב-RT. הסירו את תמיסת הכתמים על ידי שטיפה עדינה של הרשת פעמיים במים מזוקקים.
      4. לאחר מכן, שפכו 20 μL של תמיסת צביעת עופרת ציטראט על רשת הנחושת, והכתימו למשך 15 דקות ב- RT. שטפו את הרשת שלוש פעמים במים מזוקקים.
      5. הניחו את רשת הנחושת על צלחת פטרי נקייה מרופדת בנייר פילטר. לאחר הייבוש באוויר, צלמו את המקטעים באמצעות TEM. הגשושית הופעלה בכוח יורד של 500 nN, נסרק בקצב של 1 הרץ, והיה לה קבוע אלסטי (ערך k) של 40 ^Nm-1. רדיוס קצה הגשושית נמדד כ-8 ננומטר.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

כדי להכין הידרוג'ל סחוס DC-ECM טוב יותר, למדנו וסקרנו את הספרות הקודמת והשווינו את פרוטוקולי הדה-צלולריזציה השונים במונחים של יחס דה-צלולריזציה, אימונוגניות ופונקציונליות מכנית⁹.

על בסיס זה, הכנו את הידרוג'ל הסחוס DC-ECM וחקרנו את ההשפעה של ביו-דיו אקסוזום אקסוזום של ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

פרוטוקול זה מספק גישה שיטתית להכנת הידרוג'לים מטריקס חוץ-תאיים של סחוס דה-צלולרי המחקים באופן הדוק את ה-ECM המקורי של רקמת הסחוס. הפרוטוקול כולל שילוב של הפרעה פיזיקלית, כימית ואנזימטית לסילוק חומר תאי תוך שמירה על המבנה וההרכב של ECM. השלבים הקריטיים של הפרוטוקול כוללים התאמת זמן ושיטות הדה-?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M Tris-HCl, pH7.6	Beyotime	ST776-100 mL
1 M Tris-HCl, pH8.0	Beyotime	ST780-500 mL
-80 °C Freezer	Eppendorf	F440340034
Deoxyribonuclease	Aladdin	D128600-80KU
DNEasy Blood &Tissue Kit	Qiagen	No. 69506
GAG colorimetric quantitative detection kit	Shanghai Haling	HL19236.2
HCP-2 dryer	Hitachi	N/A
Nanodrop8000	Thermo Fisher	N/A	Spectrophotometer
PBS (10x)	Gibco	70011044
Ribonuclease	Aladdin	R341325-100 mg
Sigma500	ZIESS	N/A	Scanning electron microscope
Spectra S	Thermo Fisher	N/A	Transmission electron microscope
Stainless steel sieve	SHXB-Z-1	Shanghai Xinbu
Triton X-100	Beyotime	P0096-500 mL
Trypsin	Gibco	15050065
Ultraviolet lamp	Omnicure 2000	N/A
Vitamin B2	Gibco	R4500-5G
Vortex mixer	Shanghai Qiasen	78HW-1