JoVE Logo
发表
联系我们

登录

需要订阅 JoVE 才能查看此. 登录或开始免费试用。

本文内容

  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 结果
  • 讨论
  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

我们描述了一个协议，详细说明了小鼠结肠隐窝的分离以开发三维结肠。然后，可以在接受炎症激发或被引导建立上皮单层之前对已建立的结肠样蛋白进行终末分化以反映宿主上皮的细胞组成。

摘要

肠上皮在人体健康中起着至关重要的作用，在宿主和外部环境之间提供了屏障。这种高度动态的细胞层提供了微生物和免疫群体之间的第一道防线，并有助于调节肠道免疫反应。上皮屏障的破坏是炎症性肠病（IBD）的标志，对于治疗靶向具有重要意义。三维结肠培养系统是研究IBD发病机制中肠道干细胞动力学和上皮细胞生理学的非常有用的 体外 模型。理想情况下，从动物发炎的上皮组织中建立结肠样体对于评估遗传和分子对疾病的影响最有益。然而，我们已经表明， 体内 上皮变化不一定保留在由急性炎症小鼠建立的结肠样中。为了解决这一限制，我们开发了一种方案，用通常在IBD期间升高的炎症介质混合物来治疗结肠样。虽然该系统可以普遍应用于各种培养条件，但该方案强调对分化结肠和源自已建立的结肠的二维单层的治疗。在传统培养环境中，结肠富含肠道干细胞，为研究干细胞生态位提供了理想的环境。然而，该系统不允许分析肠道生理学的特征，例如屏障功能。此外，传统的结肠样不能提供研究终末分化上皮细胞对促炎刺激的细胞反应的机会。这里介绍的方法提供了一个替代的实验框架来解决这些限制。二维单层培养系统也为 离体治疗药物筛选提供了机会。这种极化细胞层可以用细胞基底侧的炎症介质处理，并伴有假定的治疗方法，以确定它们在IBD治疗中的效用。

引言

炎症性肠病 （IBD） 是一种慢性、缓解和复发性疾病，其特征是炎症发作和临床静止。IBD 的病因是多因素的，但该疾病的关键特征包括屏障功能缺陷和肠上皮通透性增加，此外还有上皮区间内激活的促炎信号级联反应 1,2。几种体外和体内模型已被用于概括IBD期间的上皮反应，包括炎症的细胞培养和小鼠模型3。然而，所有这些系统都有重要的缺点，限制了它们在IBD4期间概括上皮变化的能力。大多数用于研究IBD的细胞系都是转化的，具有形成单层的能力，并且可以分化3种，但本质上的繁殖方式与宿主中未转化的肠上皮细胞不同。几种不同的小鼠炎症模型用于研究IBD，其中一些包括敲除模型，感染模型，化学炎症模型和T细胞转移模型5,6,7,8。虽然每个人都可以研究IBD的某些病因方面，例如遗传易感性，屏障功能障碍，免疫失调和微生物组，但他们研究疾病的多因素性质的能力有限。

肠道类器官，包括类肠类和结肠类，在过去十年中已被建立为一种有用的体外模型，不仅可以研究肠道干细胞的动力学，还可以研究它们在肠道稳态和疾病中的屏障完整性和功能的作用。这些实体为我们理解IBD9的发病机制做出了重大贡献，并为个性化医疗开辟了新的机会。结肠样或干细胞衍生的自组织组织培养物已经从小鼠和人体组织发展而来，其过程允许位于肠隐窝内的干细胞繁殖并无限期维持10。体内干细胞生态位依赖于细胞外因子来支持其生长，特别是典型的Wnt信号传导和骨形态发生蛋白信号通路11。这些因素的添加促进了结肠样细胞的健康和寿命，但也推动培养物走向干细胞样状态，这种状态不反映体内上皮细胞结构，该结构由自我更新和终末分化的细胞组成12,13。虽然肠上皮的功能取决于干细胞区室和分化细胞之间的持续串扰，但在结肠样培养系统中同时具有两者的能力相当有限。尽管存在这些限制，类器官培养系统仍然是研究体外上皮内在特性的金标准。尽管如此，可能需要考虑替代文化策略来回答手头的科学问题。

已经表明，连续7天葡聚糖硫酸钠（DSS）方案的小鼠发生上皮炎症和屏障功能障碍14。此外，线粒体生物发生失败和肠上皮内的代谢重编程，已被证明在人类IBD中很明显，也已捕获在结肠炎15的DSS模型中。然而，我们的初步数据表明，线粒体生物发生失败的特征并未保留在源自DSS处理动物隐窝的结肠中（补充图1）。因此，在检查小鼠肠道炎症期间炎症如何驱动上皮变化时，必须使用替代培养方法。在这里，我们概述了我们开发的一个协议，该协议描述了1）如何从整个结肠组织中分离隐窝以建立鼠结肠样，2）如何最终分化该细胞群以反映 体内的细胞群，以及3）如何在此 体外 模型中诱导炎症。为了研究发炎上皮内的药物相互作用，我们开发了一种方案，从鼠结肠样体中建立2-二脉（2D）单层，可以用炎症介质进行基础治疗，并用药物治疗进行顶端治疗。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

研究方案

本文描述的所有使用小鼠组织的实验均已获得匹兹堡大学机构审查委员会的批准，并根据匹兹堡大学动物研究和护理委员会和 UPMC 制定的指导方针进行。

1. 培养准备

注意:所有试剂都列在 材料 表部分，所有溶液组成都可以在溶液成分表中找到（表1）。

  1. 如 表1所述制备小鼠洗涤培养基。在 4°C 下储存长达 2 个月。
  2. 如表1所述制备加密隔离缓冲液 1（CIB1）。在 4°C 下储存长达 2 个月。
    注意:二硫苏糖醇 （DTT） 被 OSHA 危害沟通标准认为是危险的，因为摄入可能会产生急性毒性，如果这些区域暴露在它面前，会损害皮肤和眼睛。处理这种化学品时，应使用防护手套、护目镜和面部防护装置。
  3. 如 表1中所述制备加密隔离缓冲液2（CIB2）。在 4°C 下储存长达 2 个月。
  4. 根据先前发表的方案制备L-WRN条件培养基16。
  5. 如 表1所述制备完整的结肠培养基。完整的结肠样生长培养基可在 4°C 下储存长达 5 天而不会损失活性。
  6. 制备分化培养基，如 表1所述。该协议是从先前发表的论文17修改而来的。分化培养基可在 4°C 下储存长达 5 天而不会损失活性。
  7. 制备如 表1中所述的炎症介质培养基。该协议是从先前发表的论文18修改而来的。炎症介质培养基可在 4°C 下储存长达 5 天而不会损失活性。
  8. 准备小鼠单层培养基。用炎症因子和/或药物攻击单层时省略Y-27632。小鼠单层培养基可在4°C下储存长达5天而不会损失活性。
  9. 制备炎症介质单层培养基。炎症介质单层培养基可在 4°C 下储存长达 5 天而不会损失活性。

2. 从小鼠结肠组织中分离隐窝

注意:将组织转移到冰上。从-20°C储存中取出适量的基底膜基质，并在冰上解冻。每个 24 孔接种 15 μL 基底膜基质。如第 1 节所述制备 CIB1、CIB2 和完整的结肠样生长培养基。

  1. 根据机构动物护理和使用委员会批准的方案对C57BL / 6J小鼠（6-8周龄）实施安乐死，并使用干净的镊子和剪刀提取结肠的远端（约5-7厘米）。
    注意:在这项研究中，受试者使用二氧化碳室孵育2-3分钟进行安乐死，然后进行颈椎脱位。
    1. 为此，将鼠标放在其背上，在胸腔下方做一个水平切口，然后从水平切口的中间向尾巴底部垂直切口以露出腹腔。
    2. 用镊子将小肠移出视野，识别结肠，然后沿着它向下移动到尾巴的底部。如果需要，用剪刀折断骨盆，以完全暴露远端结肠。用剪刀剪掉结肠最远端的5-7厘米。
  2. 将结肠组织放在干净的表面上。去除结肠周围多余的浆膜脂肪。使用连接到 18 G 1 1/2 针头的注射器，用 Dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 冲洗结肠的腔内内容物，从而去除粪便。然后，将结肠放入含有 10 mL 冰冷 DPBS 的 50 mL 锥形管中，并将其放在冰上。
    注意:如果将结肠与多只动物分离，请将组织放在冰上，然后再继续下一只动物。
  3. 将结肠组织转移到装有 10 mL 冰冷 DPBS 的培养皿中，并使用 P1,000 移液管用 DPBS 冲洗管腔两次。
  4. 用剪刀纵向打开结肠，用镊子在DPBS中轻轻摇晃~30秒，以去除任何残留的粪便内容物。
  5. 将组织转移到装有 10 mL 冰冷 DPBS 的新培养皿中，然后再次用镊子轻轻摇动，然后用剪刀将结肠切成 2 cm 的碎片，并将它们放入含有 7 mL 冰冷 CIB1 的 50 mL 锥形管中。将组织在CIB1中在冰上孵育20分钟。
    注意:其余步骤在生物安全柜内执行。
  6. 使用镊子将组织转移到含有 7 mL CIB2 的预热 50 mL 锥形管中，并在 37°C 的水浴中孵育 5 分钟。
  7. 让组织沉淀在锥形管底部，然后移取 CIB2，从 50 mL 锥形管中取出 CIB2。然后，将 10 mL 冰冷的小鼠洗涤培养基加入同一锥形管中。
  8. 获得一个新的 50 mL 锥形管，并将 70 μm 过滤器放在开管的顶部。
  9. 在握住装有结肠内容物的试管的同时，将手旋转约 45°。以摇晃和剧烈的方式摇动管子45秒以释放隐窝。然后，通过 70 μm 细胞过滤器将隐窝悬浮液倒入新的 50 mL 锥形管中。
  10. 使用镊子将结肠组织放回空的 50 mL 锥形管中，并加入 10 mL 冰冷的小鼠清洗培养基。获得一个新的70μm细胞过滤器，并将其放置在含有先前过滤溶液的50 mL锥形管的顶部。
  11. 再次，拿起含有隐窝碎片的 50 mL 管，并以与步骤 2.9 中相同的方式摇动它。通过70 μm细胞过滤器将培养基过滤到50 mL锥形管中，以与先前过滤的隐窝结合。
    注意:如果隐窝产量低，请将组织放入装有 10 mL 小鼠洗涤培养基的空 50 mL 锥形管中，再摇动结肠组织一次。摇动组织45-50秒以释放隐窝。另外，如果地穴产量低，则增加震动的力度。最后，如果整体隐窝产量较低，则可以用胎牛血清（FBS）涂覆移液管和管子，以防止组织粘附在塑料上。
  12. 将含有过滤隐窝的 50 mL 锥形管在 300 x g 下在 4°C 下离心 5 分钟。
    注意:应在 50 mL 锥形管底部观察颗粒。
  13. 通过移液倒出培养基，用 10 mL 冰冷的小鼠洗涤培养基上下移液重悬隐窝，然后转移到 15 mL 锥形管中。在 4°C 下以 300 x g 离心 5 分钟。
  14. 为了获得更清洁的制剂，用额外的 10 mL 小鼠洗涤培养基清洗隐窝。倒出先前的培养基，并通过在 10 mL 小鼠洗涤培养基中上下移液来重悬隐窝。使用 15 mL 锥形管在 4°C 下以 300 x g 离心 5 分钟。
    注意:移出培养基时应小心，因为有时沉淀没有紧密离心。如果沉淀不紧，请移取大部分培养基，留下 500 μL 至 1 mL。然后，通过将移液到10 mL小鼠洗涤培养基中重悬沉淀，并将溶液转移到15 mL锥形管中。在较小的锥形管中离心可以提高颗粒的密封性。
  15. 倒出培养基，并用 10 mL 冰冷的小鼠洗涤培养基上下移液重新悬浮隐窝。重悬后，立即将 10 μL 培养基移液到载玻片上，在明场显微镜下计数隐窝。
    1. 将两个 10 μL 滴滴放在载玻片的不同末端，并计算每个液滴中的隐窝数量。平均两滴之间的数字以确定每 10 μL 的隐窝数量。将此数字乘以 100 得到 1 mL 中的隐窝数量。
      注意:为了准确计数，重悬后必须立即去除 10 μL 的隐窝悬浮液。否则，地穴将落到管子底部，这将导致计数不准确。
  16. 目标是每孔电镀 300-500 个隐窝，将重悬于小鼠洗涤培养基中的适当体积的隐窝转移到新的 15 mL 锥形管中，并用冰冷的小鼠洗涤培养基加热至 10 mL。在 4°C 下以 300 x g 离心管 5 分钟。 在管子底部应该可以看到一个小颗粒。
  17. 用电动移液管除去上清液。使用 P200 移液管小心地去除任何残留介质，只留下沉淀。
  18. 通过缓慢上下移液，将沉淀重悬于适量的冰冷基底膜基质中。重悬隐窝颗粒时注意不要引入气泡。在板的每个孔中板 300-500 个隐窝/15 μL 基底膜基质。铺板后，倒置组织培养板，并将其置于37°C培养箱中10-20分钟。
  19. 恢复板，并向每个孔中加入 500 μL 完整的小鼠结肠样培养基。每隔一天更换一次培养基，直到它们准备好传代。每3-5天传代一次结肠。

3. 传代结肠

注:根据原井的密度，每口井一般可以1:4至1:6通过。取适量的基底膜基质从-20°C中取出，并将其放在冰上解冻。结肠类化合物可用于两次传代后的实验。传代结肠时，这些步骤在生物安全柜中进行以防止污染。

  1. 从要传代的孔中取出培养基。
    1. 如果基底膜基质内有碎片，这在初始隔离期间可能发生，则可以使用以下方案来清理碎片:
      1. 在每个孔中加入 1 mL 冰冷的 0.1% 牛血清白蛋白 （BSA） 在 DPBS 中不含 Ca 2+ 或 Mg2+。让它在生物安全柜中静置5分钟。
      2. 使用 P1000 移液器上下移液三到七次，以破坏基底膜基质，并将孔的内容物收集在 15 mL 锥形管中。在不含Ca 2+或Mg2+的DPBS中以总共5-10mL的0.1%BSA离心结肠。用0.1%BSA补足适当的体积。
      3. 在 4°C 下以 150 x g 离心 5 分钟以沉淀结肠而不是碎片。
      4. 通过移液倒出DPBS，留下沉淀。加入 1 mL 室温 （RT） 酶解离试剂，移液 3 至 5 次。
      5. 将装有酶解离试剂和破坏结肠的 15 mL 锥形管置于 37°C 水浴中 3-4 分钟。
      6. 从水浴中取出试管，移液3-5次，然后用小鼠洗涤介质至10mL。继续执行步骤 3.6。
  2. 在每个孔中放置 500 μL RT 酶解离试剂，静置约 1 分钟，然后上下移液 3 至 7 次以破坏基底膜基质。
  3. 将板置于37°C培养箱中3-4分钟。
  4. 从培养箱中取出板，并使用 P1000 移液器上下移液 3 到 7 次以解离结肠样蛋白。
  5. 将内容物转移到 15 mL 锥形管中，并用冰冷的小鼠清洗介质补足多达 10 mL。
  6. 将样品在 300 x g 在 4°C 下离心 5 分钟。
  7. 根据需要使用电动移液器和P200移液器取出培养基，使锥形管中仅剩下颗粒。
  8. 根据要接种的孔数轻轻上下移液，重悬于适量的冰冷基底膜基质中。移液时不要引入气泡。将结肠样片段置于每孔 15 μL 基底膜基质滴液中。
  9. 将隐窝铺板，倒置组织培养板，然后将板置于37°C培养箱中10-20分钟。
  10. 最后，恢复板，并向每个孔中加入 500 μL 完整的小鼠结肠样培养基。每隔一天更换一次培养基，直到它们长到足够大，可以在大约 3-5 天内再次传代。

4.结肠样细胞终末分化

  1. 如上所述传代结肠样，并向每个孔中加入 500 μL 完整的小鼠结肠样培养基。
  2. 传代后至少48小时，取出完整的小鼠结肠培养基，并向每个孔中加入500μL分化培养基（参见第1节）。
  3. 将结肠样蛋白与分化培养基孵育48小时，之后可用于实验，包括RNA和蛋白质的收集。
    注意:可以通过收集RNA并通过定量逆转录聚合酶链反应（qPCR）分别评估Lgr5和Ki67（干细胞标志物和细胞增殖标志物）的表达来评估结肠的分化。与在传统结肠培养基中生长的结肠相比，终末分化的细胞应具有相对较低的Lgr5和Ki67表达，其中细胞更像茎样。结肠体需要在分化培养基中孵育的时间可能需要针对每个单独的实验室进行优化。引物列表参见补充表1。

5. 用炎症介质诱导分化结肠炎症

  1. 将结肠样与分化培养基孵育2-3天后，除去现有培养基，并向每个孔中加入500μL炎症介质培养基。
  2. 在收集RNA和蛋白质（或评估其他下游参数）之前，让孔孵育24-72小时。每天更换培养基。

6. 源自已建立的鼠结肠样的肠上皮单层

注意:小鼠肠上皮单层来源于至少传代两次的鼠结肠。为了在3-5天内成功形成单层，必须不要将结肠样分离成单细胞。经过酶促解离成细胞簇的碎片化类器官是生长的理想选择。

  1. 在开始实验之前准备所有试剂。在冰上解冻基底膜基质。如第1节所述制备小鼠单层培养基。用冷鼠单层培养基1:20稀释解冻的基底膜。继续在冰上。
  2. 使用无菌镊子将0.4μm透明细胞培养插入物放入24孔组织培养板的单个孔中（材料表）。抓住刀片的角爪，然后将其转移到孔中。重复上述步骤，直到有适当数量的细胞培养插入物可用于培养。
    注意:确保仅用基底膜基质涂覆额外的对照孔。该细胞培养插入片段将用于测量没有细胞的细胞培养插入物的背景电阻，如后续步骤（步骤6.3）所述。
  3. 使用 P200 移液管，用 150 μL 稀释的基底膜基质覆盖每个细胞培养插入物的顶端（顶部）表面。将移液器尖端放在插入物的中心，不要接触插入物的膜，然后轻轻排出溶液。将板置于含有5%CO2 的无菌37°C培养箱中至少1小时。
  4. 使用前轻轻除去基底膜基质，让细胞培养插入物在生物安全柜中干燥至少10分钟。
    1. 要去除基底膜基质，请将 24 孔板以 45° 角旋转。将一根手指放在插脚的一角以稳定插入物，并使用P200移液器将移液器尖端沿着插入物的底部轻轻放置并取出基质。
    2. 用不含Ca 2 +或Mg2+的150μL无菌DPBS洗涤每个细胞培养插入物，去除任何多余的残留物。
  5. 干燥 10 分钟后，将 400 μL 小鼠单层培养基加入细胞培养插入物底部，在顶部加入 75 μL。重复直到所有细胞培养插入物浸入。将板留在生物安全柜中，或将其放回培养箱中，直到需要为止。
  6. 从 37°C、5% CO2 培养箱中取出成熟（生长第 3-5 天的类器官）肠结肠样的 24 孔板，并将其置于生物安全柜下。使用无菌吸头取出培养基，并用 1 mL RT 无菌 DPBS（不含 Ca 2+ 或 Mg2+）洗涤每个孔。
    注意:75-125个成熟结肠的单个孔以1:4的比例分裂。
  7. 使用无菌吸头去除不含Ca 2+或Mg2+的DPBS，并通过在每个待传代孔中放置500μLRT酶解离试剂来消化基底膜基质的每个塞子。
  8. 上下移液每个孔约 6-10 次以打破塞子。不要刮擦板的底部以取下插头。相反，以 45° 角旋转 24 孔板，将移液器的尖端放在塞子的边缘，然后轻轻地将其移开。
  9. 将 24 孔板放回无菌 37°C、5% CO2 培养箱中 3-4 分钟。
  10. 取出板，并在生物安全柜下为每个孔上下移液酶解离试剂五到七次。将每个孔中的分离结肠转移到无菌的 15 mL 锥形管中。用冰冷的小鼠清洗介质加热至 10 mL 的体积。
  11. 在4°C下以300× g 离心部分消化的结肠样蛋白5分钟。
  12. 在生物安全柜下，使用 10 mL 移液管从沉淀中取出上清液。使用 P200 移液管去除任何剩余的培养基。将结肠样沉淀重悬于小鼠单层培养基中。每个要铺板的片段化结肠样蛋白的细胞培养插入物中加入 75 μL 培养基。
  13. 在每个细胞培养插入物的中心加入 75 μL 结肠样悬浮液。在将结肠悬浮液添加到每个孔中之前，在取出 75 μL 之前轻轻上下移液一次或两次，这样可以使铺板更均匀。
  14. 将带有细胞培养插入物的24孔板放在旋转平台上10分钟，以进一步均匀分散在细胞培养物上。
  15. 将板置于无菌 37°C、5% CO2 培养箱中。
  16. 第二天（第 1 天），用 P200 移液管上下移液培养基三到五次，以去除未附着的结肠碎片。轻轻地将尖端放在细胞培养插入物的内部，以免破坏附着的肠细胞。不要将气泡引入介质中，因为这会阻止去除所有未附着的碎片。
  17. 立即取出培养基和结肠混合物。重复上述步骤，直到清洁完所有细胞培养插入物。
  18. 将 150 μL 预热的鼠单层培养基轻轻添加到每个细胞培养插页的顶端侧。向新的 24 孔板的每个孔中加入 400 μL 加热的鼠单层培养基。使用无菌镊子抓住细胞培养物的插脚，将细胞培养插入物转移到新板上。每隔一天更换培养基，直到汇合。
    注意:结肠样碎片应在接种后3-5天形成融合的单层。

7.在单层培养的第3-5天使用伏欧表测量上皮单层的净电阻

注意:筷子电极类似于镊子，长度不对称。探针的较长臂是基底外侧电极，较短的臂是顶端电极。探针可能难以插入细胞培养插入物的内部和外部之间。插入时将探头以轻微的角度放置，然后垂直拉直探头，将防止探头卡住。确保以相似的角度读取每个细胞培养插入片段的净电阻，因为这会影响值。

  1. 将伏欧表和所有试剂放在生物安全柜内。
    1. 将伏欧表插入最近的交流电源插座，然后将电极探头的塑料模块化连接器插入前面板显示屏上的 输入 插孔。
    2. 要将伏欧表以 45° 角放置，请将设备背面的金属臂向外摆动，直到其锁定到位。
    3. 现在，通过向上翻转前面板显示屏上的电源开关来打开伏特表。最后，将开关向上翻转至欧姆以显示此指标中的读数。
  2. 从 37°C、5% CO2 培养箱中取出 24 孔板，并将板平放在生物安全柜中。跨上皮电阻 （TEER） 对温度敏感。仅在读取 TEER 之前立即取下板。
  3. 在预热的70%乙醇中对电极探针灭菌30秒至1分钟。取下探针，倒置并轻弹一到两次以去除多余的乙醇。让探头风干约30秒。
  4. 用预热的小鼠洗涤介质洗涤探针上残留的任何乙醇。
    注意:不要让探针上任何剩余的乙醇液滴落入细胞培养插入物中。用培养基洗掉乙醇时，不要让培养基高于无菌乙醇场。这可能导致受污染的培养基进入细胞培养插入物。
  5. 将探针垂直于细胞培养插入物。将基底外侧电极（探针的较长端）插入细胞培养插入物的外部，直到它接触 24 孔板的底部。将顶端电极（探针的较短端）滑入细胞培养插入物中。不要改变两个电极在孔之间的距离。这将影响TEER测量。
  6. 在读取TEER之前，验证顶端电极没有接触细胞培养插入物的底部。从背景对照细胞培养插入片段开始，并记录值。该值将自动以数字方式显示在伏欧表的正面。
  7. 对每个细胞培养插入片段重复步骤7.5-7.6。
    注意:如果细胞培养插入物之间存在不同的实验条件，请在每个新条件之间对探针进行灭菌。从步骤 7.1 开始，然后按数字方式完成这些步骤。
  8. 记录所有TEER测量值后，将24孔板放回培养箱中。
  9. 350 Ω或更高的净值表明单层形成。在接下来的几天里再次重复，直到形成单层。
    注意:通常，第 3 天可以捕获 1,000 Ω或更大的值，但随着时间的推移，它们都将收敛在 350 Ω左右的较低数字上。

8. 使用伏欧表的净电阻测量值计算TEER

注意:结肠体的成功单层形成将使TEER测量值大于115 Ω·cm2。

  1. 取单个净电阻值，并从背景孔中减去净电阻。涂有基底基质膜的细胞培养插入物的净读数约为100 Ω。
  2. 进行背景减去的净电阻测量值，并将其乘以细胞培养插入物的表面积。24孔细胞培养插入物的表面积为0.33cm2。
  3. 如果值为115 Ω·cm2 或更大，则进行下游实验测定。

9.用炎症介质诱导上皮单层炎症

  1. 一旦形成成功的单层，在培养物的基底侧向培养物中添加炎症介质。如步骤1.9中所述制备炎症介质单层培养基，并在新的24孔板中向每个孔中加入400μL。
  2. 从细胞培养插入物的顶端取出培养基，加入150μL不含Y-27632的鼠单层培养基。不要用炎症介质补充这一侧。但是，如果细胞死亡似乎过多，请将Y-27632留在培养基中。这必须由最终用户确定。
  3. 将细胞培养插入物转移到新的24孔板中，并将它们放入补充有炎症介质单层培养基的孔中。
  4. 用炎症介质刺激单层24-72小时，具体取决于实验。
  5. 为了使用该炎症模型测试药物反应，请用所选药物补充细胞培养插入物顶端侧的单层培养基。药物可以在实验中的任何一点添加，具体取决于药物的作用机制和要评估的下游参数。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

结果

3D肠结肠样培养系统是研究上皮对肠粘膜稳态的内在贡献的宝贵工具。所描述的协议提供了有关如何在8周龄时从C57BL / 6J（WT）小鼠中分离隐窝并建立可用于多个下游应用的长期结肠样培养系统的详细说明。在基底膜基质中分离和电镀隐窝后，当通过明场显微镜观察时，隐窝在结构上显得致密和多细胞。它们可以是球形的，也可以是细长的圆柱形，类似于通常在 体内 肠道结构中观察到的单?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

讨论

类器官的发展彻底改变了科学界在 体外 研究器官系统的方式，能够在培养皿中部分概括动物或人类的细胞结构和功能。此外，源自患有疾病的人类的类器官系统为个性化医疗提供了一种有前途的工具，可以指导治疗决策。在这里，我们描述了一种运行良好的加密隔离协议，并介绍了允许在电镀前清理隔离中多余碎屑的关键步骤。此外，我们还解释了一个在这个过程中经常被忽视的关键细?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

披露声明

贡献作者没有什么可透露的。

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款R01DK120986（KPM）的支持。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.4-μM transparent transwell, 24-wellGreiner Bio-one662-641
15-mL conical tubesThermo Fisher 12-565-269
50-mL conical tubesThermo Fisher 12-565-271
70-μM cell strainerVWR76327-100
Advanced DMEM/F12Invitrogen12634-010Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
B-27 supplement Invitrogen12587-010Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x)
Chopsticks Electrode Set for EVOWorld Precision InstrumentsSTX2
Corning Matrigel GFR Membrane MixCorning354-230Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%)
Dithiothreitol (DTT)Sigma-AldrichD0632-5GStock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water)
DMEM high glucoseThermo Fisher11960-069Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and MagnesiumGibco 14190-144Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA)Sigma-AldrichE7889Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM)
Fetal Bovine SerumBio-TechneS11150HStock Concentration (100%); Final Concentration (1%)
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mmThermo Fisher 12-550-15
G418InvivoGenant-ga-1Final Concentration (400 µg/µL)
Gentamicin ReagentGibco/Fisher15750-060Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL)
GlutaMAX-1Fisher Scientific35050-061Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
HEPES 1 MGibco15630-080Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM)
hIFNγR&D Systems285-IFStock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hIL-1βR&D Systems201-LBStock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hTNFαR&D Systems210-TAStock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
Hydrogen Peroxide SigmaH1009Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media)
Hygromycin B GoldInvivoGenant-hg-1Final Concentration (400 µg/µL)
L-WRN Cell LineATCCCRL-3276
mEGFNovusNBP2-35176Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
N-2 supplementInvitrogen17502-048Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
N-Acetyl-L-cysteineSigma A9165-5GStock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water)
NogginPeprotech250-38Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher15140-122Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposableVWR25384-342
Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterileGreiner Bio-one5666-2160
R-SpondinR&D Systems3474-RS-050Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
Tryp LE ExpressThermo Fisher12604-013Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA)
UltraPure Water Invitrogen10977-023Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Y-27632 dihyddrochloride Abcamab120129Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water)

参考文献

  1. Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. Mend your fences: The epithelial barrier and its relationship with mucosal immunity in inflammatory bowel disease. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).
  2. McGuckin, M. A., Rajaraman, E., Simms, L. A., Florin, T. H. J., Radford-Smith, G. Intestinal barrier dysfunction in inflammatory bowel diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 15 (1), 100-113 (2009).
  3. Joshi, A., Soni, A., Acharya, S. In vitro models and ex vivo systems used in inflammatory bowel disease. In Vitro Models. 1 (3), 213-227 (2022).
  4. Goyal, N., Rana, A., Ahlawat, A., Bijjem, K. R., Kumar, P. Animal models of inflammatory bowel disease: A review. Inflammopharmacology. 22 (4), 219-233 (2014).
  5. Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: Concepts, considerations, and tricks of the trade. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 296 (2), 135-146 (2009).
  6. Bhinder, G., et al. The Citrobacter rodentium mouse model: Studying pathogen and host contributions to infectious colitis. Journal of Visualized Experiments. (72), e50222(2013).
  7. Bhan, A. K., Mizoguchi, E., Smith, R. N., Mizoguchi, A. Colitis in transgenic and knockout animals as models of human inflammatory bowel disease. Immunological Reviews. 169, 195-207 (1999).
  8. Okayasu, I., et al. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
  9. Dotti, I., Salas, A. Potential use of human stem cell-derived intestinal organoids to study inflammatory bowel diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 24 (12), 2501-2509 (2018).
  10. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  11. Santos, A. J. M., Lo, Y. H., Mah, A. T., Kuo, C. J. The intestinal stem cell niche: Homeostasis and adaptations. Trends in Cell Biology. 28 (12), 1062-1078 (2018).
  12. Yin, X., et al. Niche-independent high-purity cultures of Lgr5+ intestinal stem cells and their progeny. Nature Methods. 11 (1), 106-112 (2014).
  13. Wilson, S. S., et al. Optimized culture conditions for improved growth and functional differentiation of mouse and human colon organoids. Frontiers in Immunology. 11, 547102(2021).
  14. Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating intestinal inflammation in DSS-induced model of IBD. Journal of Visualized Experiments. (60), e3678(2012).
  15. Cunningham, K. E., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator 1-α (PGC1α) protects against experimental murine colitis. Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10184-10200 (2016).
  16. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2481 (2013).
  17. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  18. Julian, M. W., et al. Intestinal epithelium is more susceptible to cytopathic injury and altered permeability than the lung epithelium in the context of acute sepsis. International Journal of Experimental Pathology. 92 (5), 366-376 (2011).
  19. Haberman, Y., et al. Ulcerative colitis mucosal transcriptomes reveal mitochondriopathy and personalized mechanisms underlying disease severity and treatment response. Nature Communications. 10, 38(2019).
  20. Yang, S., et al. Mitochondrial transcription factor A plays opposite roles in the initiation and progression of colitis-associated cancer. Cancer Communications. 41 (8), 695-714 (2021).
  21. Maidji, E., Somsouk, M., Rivera, J. M., Hunt, P. W., Stoddart, C. A. Replication of CMV in the gut of HIV-infected individuals and epithelial barrier dysfunction. PLoS Pathogen. 13, 1006202(2017).
  22. Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Scientific Reports. 7, 452-470 (2017).
  23. Grondin, J., Kwon, Y., Far, P., Haq, S., Khan, W. Mucins in Intestinal mucosal defense and inflammation: Learning from clinical and experimental studies. Frontiers in Immunology. 11, 2054(2020).
  24. Metcalfe, C., Kljavin, N. M., Ybarra, R., de Sauvage, F. J. Lgr5+ stem cells are indispensable for radiation-induced intestinal regeneration. Cell Stem Cell. 14 (2), 149-159 (2014).
  25. Yui, S., et al. YAP/TAZ-Dependent reprogramming of colonic epithelium links ECM remodeling to tissue regeneration. Cell Stem Cell. 22 (1), 35-49 (2018).
  26. Komiya, Y., Habas, R. Wnt signal transduction pathways. Organogenesis. 4 (2), 68-75 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

转载和许可

请求许可使用此 JoVE 文章的文本或图形

请求许可

探索更多文章

196

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

政策

使用条款

隐私

联系我们

向图书馆推荐

JoVE 新闻简报

科研

教育

发表

图书馆员

关于 JoVE

版权所属 © 2025 MyJoVE 公司版权所有，本公司不涉及任何医疗业务和医疗服务。