확립된 쥐 콜로노이드에 대한 시험관 내 장 염증의 상피 효과 연구

요약

우리는 3차원 결장류의 발달을 위한 쥐 결장 선와(miline colonic crypt)의 분리를 자세히 설명하는 프로토콜을 설명합니다. 확립된 콜로노이드는 염증성 챌린지를 받거나 상피 단층을 형성하도록 지시되기 전에 숙주 상피의 세포 구성을 반영하도록 최종적으로 분화될 수 있습니다.

초록

장 상피는 인체 건강에 필수적인 역할을 하며 숙주와 외부 환경 사이에 장벽을 제공합니다. 이 매우 역동적인 세포층은 미생물과 면역 집단 사이의 첫 번째 방어선을 제공하고 장 면역 반응을 조절하는 데 도움이 됩니다. 상피 장벽의 파괴는 염증성 장 질환(IBD)의 특징이며 치료 표적화에 관심이 있습니다. 3차원 결장 배양 시스템은 IBD 발병기전에서 장 줄기 세포 역학 및 상피 세포 생리학을 연구하는 데 매우 유용한 시험관 내 모델입니다. 이상적으로는 동물의 염증이 있는 상피 조직에서 콜로노이드를 확립하는 것이 질병에 대한 유전적 및 분자적 영향을 평가하는 데 가장 유익할 것입니다. 그러나, 우리는 생체 내 상피 변화가 급성 염증이 있는 마우스에서 확립된 콜로노이드에서 반드시 유지되는 것은 아니라는 것을 보여주었습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 우리는 IBD 동안 일반적으로 상승하는 염증 매개체의 칵테일로 콜로노이드를 치료하는 프로토콜을 개발했습니다. 이 시스템은 다양한 배양 조건에 유비쿼터스로 적용될 수 있지만, 이 프로토콜은 차별화된 콜로노이드와 확립된 콜로노이드에서 파생된 2차원 단층 모두에 대한 처리를 강조합니다. 전통적인 배양 환경에서 콜로노이드는 장내 줄기 세포가 풍부하여 줄기 세포 틈새를 연구하기에 이상적인 환경을 제공합니다. 그러나 이 시스템은 장벽 기능과 같은 장 생리학의 특징을 분석할 수 없습니다. 또한, 전통적인 콜로노이드는 전염증성 자극에 대한 말단적으로 분화된 상피 세포의 세포 반응을 연구할 기회를 제공하지 않습니다. 여기에 제시된 방법은 이러한 제한 사항을 해결하기 위한 대체 실험 프레임워크를 제공합니다. 2차원 단층 배양 시스템은 또한 생체 외에서 치료 약물 스크리닝을 위한 기회를 제공합니다. 이 편광된 세포층은 세포의 기저부에 있는 염증 매개체로 치료할 수 있으며 IBD 치료에서의 유용성을 결정하기 위해 정점적으로 추정 치료제와 병행할 수 있습니다.

서문

염증성 장 질환(IBD)은 염증 및 임상적 정지 에피소드를 특징으로 하는 만성, 완화 및 재발성 질환입니다. IBD의 병인은 다인성이지만, 이 질환의 주요 특징은 상피 구획 내에서 활성화된 전염증성 신호 캐스케이드 외에도 장벽 기능 결함과 장 상피의 투과성 증가를 포함한다 ^1,2. 염증의 세포 배양 및 쥐 모델을 포함하여 IBD 동안 상피 반응을 요약하기 위해 여러 시험관 내 및 생체 내 모델이 사용되었습니다³. 그러나, 이들 모든 시스템은 IBD⁴ 동안 상피 변화를 요약하는 능력을 제한하는 중요한 단점을 가지고 있다. IBD 연구에 사용되는 대부분의 세포주는 형질전환되고, 단층을 형성할 수 있는 능력을 가지며,³개를 분화시킬 수 있지만 숙주에서 형질전환되지 않은 장 상피 세포와 본질적으로 다르게 증식합니다. 염증의 여러 다른 쥐 모델이 IBD를 연구하는 데 사용되며, 그 중 일부는 녹아웃 모델, 감염성 모델, 화학적 염증 모델 및 T 세포 전달 모델 ^5,6,7,8을 포함합니다. 각각은 유전적 소인, 장벽 기능 장애, 면역 조절 완화 및 미생물군집과 같은 IBD의 특정 병인학적 측면을 연구할 수 있지만 질병의 다인성 특성을 연구하는 능력에는 한계가 있습니다.

엔테로이드 및 콜로노이드를 포함한 장 오가노이드는 지난 10년 동안 장 줄기 세포의 역학뿐만 아니라 장 항상성 및 질병에서 장 상피의 역할, 장벽 무결성 및 기능을 연구하기 위한 유용한 시험관 내 모델로 확립되었습니다. 이러한 실체는 IBD⁹의 발병기전에 대한 우리의 이해에 크게 기여했으며 개인화된 의학을 위한 새로운 기회를 열었습니다. 대장에서 줄기 세포 유래 자가 조직화 배양물인 콜로노이드(Colonoids)는 쥐와 인간 조직 모두에서 개발되어 장 선와(intestinal crypt) 내에 위치한 줄기세포가 번식하고 무기한 유지될 수 있도록 하는 과정이다¹⁰. 생체 내 줄기 세포 틈새는 성장을 지원하기 위해 세포외 인자, 특히 표준 Wnt 신호 전달 및 뼈 형태 형성 단백질 신호 전달 경로에 의존합니다¹¹. 이러한 인자의 추가는 콜로노이드의 건강과 수명을 촉진할 뿐만 아니라 자가 재생 세포와 말단 분화 세포 모두로 구성된 생체 내 상피 세포 구조를 반영하지 않는 줄기 세포와 유사한 상태로 배양을 유도합니다^12,13. 장 상피의 기능은 줄기 세포 구획과 분화된 세포 사이의 지속적인 누화에 의존하지만, 결장 배양 시스템에서 둘 다를 갖는 능력은 상당히 제한적입니다. 이러한 한계에도 불구하고 오가노이드 배양 시스템은 생체 외 상피의 고유 특성을 연구하기 위한 황금 표준으로 남아 있습니다. 그럼에도 불구하고 당면한 과학적 질문에 답하기 위해 대안적 문화 전략을 고려해야 할 수도 있습니다.

덱스트란 황산나트륨(DSS)을 7일 동안 지속적으로 투여한 쥐는 상피 염증과 장벽 기능 장애를 모두 발생시키는 것으로 나타났다¹⁴. 또한, 인간 IBD에서 명백한 것으로 밝혀진 장 상피 내의 미토콘드리아 생물 발생 실패 및 대사 재프로그래밍도 대장염의 DSS 모델에서도 포착되었습니다¹⁵. 그러나 우리의 예비 데이터는 미토콘드리아 생물 발생 실패의 특성이 DSS 처리 동물의 선와에서 파생된 콜로노이드에서 유지되지 않는다는 것을 보여줍니다(보충 그림 1). 따라서 쥐 장 염증 동안 염증이 상피 변화를 유발하는 방법을 조사할 때 대체 배양 방법을 사용해야 합니다. 여기에서 우리는 1) 쥐 콜로노이드의 확립을 위해 전체 결장 조직에서 선와를 분리하는 방법, 2) 생체 내 세포 집단을 반영하기 위해 이 세포 집단을 최종적으로 분화하는 방법, 3) 이 시험관 내 모델에서 염증을 유도하는 방법. 염증이 있는 상피 내에서 약물 상호작용을 연구하기 위해 우리는 염증 매개체로 기저적으로 치료하고 약물 요법으로 정점으로 치료할 수 있는 쥐 결장에서 2-디멘소날(2D) 단층을 설정하는 프로토콜을 개발했습니다.

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프로토콜

본원에 기술된 쥐 조직을 이용한 모든 실험은 피츠버그 대학교의 임상시험심사위원회에 의해 승인되었고, 피츠버그 대학교 및 UPMC의 동물 연구 및 관리 위원회에 의해 제시된 가이드라인에 따라 수행되었다.

1. 문화 준비

참고: 모든 시약은 재료 표 섹션에 나열되어 있으며 모든 용액 조성은 용액 조성 표(표 1)에서 찾을 수 있습니다.

1. 표 1에 기재된 바와 같이 마우스 세척 배지를 준비한다. 4°C에서 최대 2개월까지 보관하세요.
2. 표 1에 설명된 대로 크립트 격리 버퍼 1(CIB1)을 준비합니다. 4°C에서 최대 2개월까지 보관하세요.
   주의 : Dithiothreitol (DTT)은 섭취시 잠재적 인 급성 독성과 해당 부위에 노출되면 피부와 눈이 손상되기 때문에 OSHA 위험 커뮤니케이션 표준에 따라 위험한 것으로 간주됩니다. 이 화학 물질을 취급할 때는 보호 장갑, 보안경 및 안면 보호구를 사용해야 합니다.
3. 표 1에 설명된 대로 크립트 격리 버퍼 2(CIB2)를 준비합니다. 4°C에서 최대 2개월까지 보관하세요.
4. 이전에 발표된 프로토콜¹⁶에 따라 L-WRN 조절 배지를 준비합니다.
5. 표 1에 기재된 바와 같이 완전한 콜로노이드 배지를 준비한다. 완전한 콜로노이드 성장 배지는 활성 손실 없이 4°C에서 최대 5일 동안 보관할 수 있습니다.
6. 표 1에 기재된 바와 같이 분화 배지를 준비한다. 이 프로토콜은 이전에 발표된 논문¹⁷에서 수정되었습니다. 분화 배지는 활성 손실 없이 4°C에서 최대 5일 동안 보관할 수 있습니다.
7. 표 1에 기재된 바와 같이 염증 매개체 배지를 준비한다. 이 프로토콜은 이전에 발표된 논문¹⁸에서 수정되었습니다. 염증 매개체 배지는 활성 손실 없이 4°C에서 최대 5일 동안 보관할 수 있습니다.
8. 쥐 단층 배지를 준비하십시오. Y-27632는 염증 인자 및/또는 약물로 단층에 도전할 때 생략합니다. 쥐 단층 배지는 활성 손실 없이 4°C에서 최대 5일 동안 보관할 수 있습니다.
9. 염증 매개체 단층 배지를 준비합니다. 염증 매개체 단층 배지는 활성 손실 없이 4°C에서 최대 5일 동안 보관할 수 있습니다.

2. 쥐 결장 조직에서 선와단 분리

알림: 얼음 위에서 티슈를 옮깁니다. -20°C 보관에서 적절한 양의 기저막 매트릭스를 꺼내 얼음에서 해동합니다. 각 24-웰은 15 μL의 기저막 매트릭스로 도말됩니다. 섹션 1에 설명된 대로 CIB2, CIB1 및 완전한 콜로노이드 성장 배지를 준비합니다.

1. Institutional Animal Care and Use Committee가 승인한 프로토콜에 따라 C57BL/6J 마우스(6-8주령)를 안락사시키고 깨끗한 핀셋과 가위를 사용하여 결장의 말단부(약 5-7cm)를 추출합니다.
   참고: 이 연구에서 피험자는 2-3분 동안 이산화탄소 챔버 배양을 사용하여 안락사시킨 후 경추 탈구를 했습니다.
   1. 이를 위해 마우스를 등에 대고 흉곽 바로 아래에 수평 절개를한 다음 수평 절개 중앙에서 꼬리 바닥을 향해 수직 절개하여 복강을 노출시킵니다.
   2. 핀셋을 사용하여 소장을 들판 밖으로 옮기고 결장을 확인한 다음 꼬리 밑 부분까지 따라갑니다. 필요한 경우 가위로 골반을 부러뜨려 원위 결장을 완전히 노출시킵니다. 가위를 사용하여 결장의 가장 말단 5-7cm를 자릅니다.
2. 결장 조직을 깨끗한 표면에 놓습니다. 결장을 둘러싸고 있는 과도한 장막 지방을 제거하십시오. 18G 1 1/2 바늘에 부착된 주사기를 사용하여 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)로 결장의 내강 내용물을 씻어내어 대변을 제거합니다. 그런 다음 얼음처럼 차가운 DPBS 10mL가 들어 있는 50mL 원뿔형 튜브에 결장을 넣고 얼음 위에 놓습니다.
   참고: 한 마리 이상의 동물로부터 결장을 분리하는 경우 다음 동물로 진행하기 전에 조직을 얼음 위에 놓습니다.
3. 결장 조직을 얼음처럼 차가운 DPBS 10mL가 담긴 페트리 접시에 옮기고 P1,000 피펫을 사용하여 DPBS로 내강을 두 번 관개합니다.
4. 가위를 사용하여 결장을 세로로 열고 DPBS에서 ~30초 동안 핀셋을 사용하여 부드럽게 흔들어 남아 있는 배설물 내용물을 제거합니다.
5. 조직을 얼음처럼 차가운 DPBS 10mL가 담긴 새 페트리 접시에 옮기고 가위를 사용하여 결장을 2cm 조각으로 자르고 7mL의 얼음처럼 차가운 CIB1이 있는 50mL 원뿔형 튜브에 넣기 전에 핀셋을 사용하여 다시 부드럽게 흔듭니다. CIB1의 조직을 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다.
   알림: 나머지 단계는 생물 안전 캐비닛 내부에서 수행됩니다.
6. 핀셋을 사용하여 조직을 7mL의 CIB2가 들어 있는 예열된 50mL 원뿔형 튜브로 옮기고 37°C의 수조에서 5분 동안 배양합니다.
7. 조직이 코니컬 튜브의 바닥에 가라앉도록 한 다음 CIB2를 피펫팅하여 50mL 코니컬 튜브에서 CIB2를 제거합니다. 그런 다음 동일한 원추형 튜브에 얼음처럼 차가운 마우스 세척 배지 10mL를 추가합니다.
8. 새 50mL 원뿔형 튜브를 구하고 열린 튜브 위에 70μm 필터를 놓습니다.
9. 결장 내용물이 있는 튜브를 잡고 손을 약 45° 회전시킵니다. 튜브를 45초 동안 흔들고 세게 흔들어 지하실을 해제합니다. 그런 다음 크립트 현탁액을 70μm 세포 여과기를 통해 새 50mL 원뿔형 튜브에 붓습니다.
10. 핀셋을 사용하여 결장 조직을 빈 50mL 원추형 튜브에 다시 넣고 얼음처럼 차가운 마우스 세척 배지 10mL를 추가합니다. 새로운 70μm 셀 스트레이너를 구하고 이전 여과 용액이 들어 있는 50mL 원뿔형 튜브 위에 놓습니다.
11. 다시, 크립트 조각이 들어있는 50 mL 튜브를 집어 들고 2.9 단계와 동일한 방식으로 흔든다. 70μm 셀 스트레이너를 통해 배지를 50mL 원뿔형 튜브로 여과하여 이전에 여과된 크립트와 결합합니다.
    참고: 선와 수율이 낮으면 10mL의 마우스 세척 배지가 있는 빈 50mL 원뿔형 튜브에 조직을 넣어 결장 조직을 추가로 흔듭니다. 조직을 45-50초 동안 흔들어 지하실을 풀어줍니다. 또한, 지하실 수율이 낮 으면, 흔들림의 격렬함을 증가시킨다. 마지막으로, 전체 crypt 수율이 낮 으면 피펫과 튜브 모두 태아 소 혈청 (FBS)으로 코팅하여 조직이 플라스틱에 부착되는 것을 방지 할 수 있습니다.
12. 300 x g 에서 5°C에서 5분 동안 여과된 크립트가 들어 있는 50mL 원뿔형 튜브를 원심분리합니다.
    알림: 펠릿은 50mL 원뿔형 튜브의 바닥에서 관찰되어야 합니다.
13. 피펫팅으로 배지를 경사 조절하고, 10mL의 얼음처럼 차가운 마우스 세척 배지로 위아래로 피펫팅하여 크립트를 다시 현탁하고, 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 300 x g 에서 5°C에서 4분 동안 원심분리합니다.
14. 더 깨끗한 제제를 얻으려면 추가로 10mL의 마우스 세척 배지로 크립트를 세척하십시오. 이전 배지를 경사 조절하고, 10 mL의 마우스 세척 배지에서 위아래로 피펫팅하여 크립트를 재현탁한다. 15mL 코니컬 튜브를 사용하여 4°C에서 5분 동안 300 x g 에서 원심분리합니다.
    알림: 매체를 피펫팅할 때 주의해야 합니다., 때때로, 펠릿이 단단히 원심분리되지 않기 때문에. 펠릿이 단단하지 않은 경우 대부분의 배지에서 피펫을 제거하고 500μL를 1mL로 남겨둡니다. 그런 다음 10mL의 마우스 세척 배지에 피펫팅하여 펠릿을 재현탁하고 용액을 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 더 작은 원추형 튜브에서 원심분리하면 펠릿의 견고성을 향상시킬 수 있습니다.
15. 배지를 디캔팅하고 10mL의 얼음처럼 차가운 마우스 세척 배지로 위아래로 피펫팅하여 크립트를 다시 중단합니다. 재현탁되면 명시야 현미경으로 10μL의 배지를 유리 슬라이드에 즉시 피펫팅하여 선와를 계수합니다.
    1. 슬라이드의 개별 끝에 두 개의 10μL 방울을 놓고 각 방울의 크립트 수를 계산합니다. 두 방울 사이의 숫자를 평균하여 10μL당 크립트 수를 결정합니다. 이 숫자에 100을 곱하면 1mL의 크립트 수를 얻을 수 있습니다.
       참고: 정확한 계수를 위해 10μL의 크립트 현탁액은 재현탁 후 즉시 제거해야 합니다. 그렇지 않으면 지하실이 튜브 바닥으로 떨어져 계산이 부정확해집니다.
16. 웰당 300-500개의 크립트를 플레이팅하는 것을 목표로 마우스 세척 배지에 재현탁된 적절한 양의 크립트를 새로운 15mL 원뿔형 튜브로 옮기고 얼음처럼 차가운 마우스 세척 배지로 10mL를 가져옵니다. 튜브를 300 x g 에서 5°C에서 4분 동안 원심분리합니다. 튜브 바닥에 작은 펠릿이 보여야 합니다.
17. 파워 피펫으로 상청액을 제거합니다. P200 피펫을 사용하여 펠릿만 남기고 잔류 배지를 조심스럽게 제거합니다.
18. 펠릿을 얼음처럼 차가운 기저막 매트릭스에 적당량 위아래로 천천히 피펫팅하여 재현탁합니다. 크립트 펠릿을 다시 매달아 놓을 때 기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 플레이트의 각 웰에 300-500 crypts/15 μL의 기저막 매트릭스를 플레이트합니다. 도금 후 조직 배양 접시를 뒤집고 37°C 인큐베이터에 10-20분 동안 넣습니다.
19. 플레이트를 되돌리고 500 μL의 완전한 마우스 콜로노이드 배지를 각 웰에 추가합니다. 통과할 준비가 될 때까지 격일로 매체를 교체하십시오. 3-5 일마다 콜로노이드를 통과시킵니다.

3. 콜로노이드 통과

참고: 각 우물은 일반적으로 원래 우물의 밀도에 따라 1:4에서 1:6으로 통과할 수 있습니다. -20°C에서 적절한 양의 기저막 매트릭스를 꺼내 얼음 위에 올려 해동합니다. 콜로노이드는 두 번의 통과 후 실험에 사용할 수 있습니다. 콜로노이드를 통과시킬 때 오염을 방지하기 위해 생물학적 안전 캐비닛에서 단계를 수행합니다.

1. 통과할 웰에서 배지를 제거합니다.
   1. 초기 격리 중에 발생할 수 있는 기저막 매트릭스 내에 파편이 있는 경우 다음 프로토콜을 사용하여 파편을 청소할 수 있습니다.
      1. Ca²⁺ 또는 Mg²⁺ 가 없는 DPBS에 얼음처럼 차가운 0.1% 소 혈청 알부민(BSA) 1mL를 각 웰에 추가합니다. 생물 안전 캐비닛에 5분 동안 그대로 두십시오.
      2. P1000 피펫을 사용하여 3 내지 7회 상하로 피펫팅하여 기저막 매트릭스를 파괴하고, 웰의 내용물을 15 mL 코니컬 튜브에 수집하였다. Ca 2+ 또는 Mg²⁺ 없이 DPBS에서 총 5-10mL의 0.1% BSA로 콜로노이드를 원심분리합니다. 0.1% BSA로 적절한 부피를 만드십시오.
      3. 150°C에서 5분 동안 4 x g 에서 원심분리하여 콜로노이드를 펠릿화하지만 파편은 펠릿화하지 않습니다.
      4. 피펫팅으로 DPBS를 디캔팅하고 펠릿을 남깁니다. 실온(RT) 효소 해리 시약 1mL를 넣고 3-5회 피펫팅합니다.
      5. 효소 해리 시약과 파쇄된 결장노이드가 포함된 15mL 원뿔형 튜브를 37°C 수조에 3-4분 동안 넣습니다.
      6. 수조에서 튜브를 꺼내 3-5회 피펫팅한 다음 마우스 세척 배지로 10mL를 가져옵니다. 3.6단계로 진행합니다.
2. 500 μL의 RT 효소 해리 시약을 각 웰에 넣고 약 1분 동안 그대로 두었다가 3-7회 위아래로 피펫팅하여 기저막 매트릭스를 파괴합니다.
3. 플레이트를 37°C 인큐베이터에 3-4분 동안 넣습니다.
4. 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 P1000 피펫을 사용하여 3-7회 위아래로 피펫하여 콜로노이드를 해리합니다.
5. 내용물을 15mL 원뿔형 튜브에 옮기고 얼음처럼 차가운 마우스 세척 배지로 최대 10mL를 만듭니다.
6. 4°C에서 5분 동안 300 x g 에서 샘플을 원심분리합니다.
7. 필요에 따라 파워 피펫과 P200 피펫을 사용하여 배지를 제거하여 원뿔형 튜브에 펠릿만 남도록 합니다.
8. 얼마나 많은 웰을 도금해야 하는지에 따라 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 적절한 양의 얼음처럼 차가운 기저막 매트릭스에 재현탁합니다. 피펫팅할 때 기포가 생기지 않도록 하십시오. 웰당 15 μL의 기저막 매트릭스 방울에 콜로노이드 단편을 배치합니다.
9. 크립트를 플레이트하고 조직 배양 플레이트를 뒤집은 다음 플레이트를 37°C 인큐베이터에 10-20분 동안 넣습니다.
10. 마지막으로, 플레이트를 되돌리고, 500 μL의 완전한 마우스 콜로노이드 배지를 각 웰에 추가한다. 약 3-5일 후에 다시 통과할 수 있을 만큼 커질 때까지 격일로 배지를 교체하십시오.

4. 대장 세포의 최종 분화

1. 위와 같이 콜로노이드를 계대배양하고, 500 μL의 완전한 마우스 콜로노이드 배지를 각 웰에 첨가한다.
2. 계대배양 후 최소 48시간 후에 완전한 마우스 결장막 배지를 제거하고 분화 배지 500μL를 각 웰에 추가합니다(섹션 1 참조).
3. 분화 배지로 콜로노이드를 48시간 동안 배양한 후 RNA 및 단백질 수집을 포함한 실험에 사용할 수 있습니다.
   참고: 콜로노이드는 RNA를 수집하고 정량적 역전사효소-중합효소 연쇄 반응(qPCR)을 통해 줄기 세포 마커 및 세포 증식 마커인 Lgr5 및 Ki67의 발현을 각각 평가하여 분화를 평가할 수 있습니다. 말기 분화된 세포는 세포가 줄기와 더 유사한 전통적인 콜로노이드 배지에서 성장한 콜로노이드에 비해 상대적으로 낮은 Lgr5 및 Ki67의 발현을 가져야 합니다. 콜로노이드가 분화 배지에서 배양해야 하는 시간은 각 개별 실험실에 맞게 최적화해야 할 수 있습니다. 프라이머 목록에 대해서는 보충 표 1을 참조하십시오.

5. 염증매개체로 분화된 대장균에 염증 유도

1. 분화 배지와 함께 2-3일 동안 배양한 후 기존 배지를 제거하고 염증 매개체 배지 500μL를 각 웰에 추가합니다.
2. RNA와 단백질을 수집하기 전에(또는 다른 다운스트림 매개변수를 평가하기 전에) 웰을 24-72시간 동안 배양합니다. 매일 매체를 변경하십시오.

6. 확립된 쥐 콜로노이드에서 파생된 장 상피 단층

참고: 쥐 장 상피 단층은 최소 2회 계대된 쥐 결장에서 파생됩니다. 3-5 일 안에 성공적인 단층 형성을 허용하려면 콜로노이드를 단일 세포로 분리하지 않는 것이 중요합니다. 효소에 의해 세포 클러스터로 해리된 단편화된 오가노이드는 성장에 이상적입니다.

1. 실험을 시작하기 전에 모든 시약을 준비하십시오. 기저막 매트릭스를 얼음 위에서 해동합니다. 섹션 1에 설명된 대로 쥐 단층 배지를 준비합니다. 해동된 기저막을 차가운 쥐 단층 배지로 1:20으로 희석합니다. 얼음 위에 보관하십시오.
2. 멸균 겸자를 사용하여 0.4μm 투명 세포 배양 삽입물을 24웰 조직 배양 플레이트의 단일 웰에 넣습니다(표 재료). 삽입물의 모서리 갈래를 잡고 우물로 옮깁니다. 적절한 수의 세포 배양 삽입물을 배양에 사용할 수 있을 때까지 반복합니다.
   알림: 기저막 매트릭스로만 추가 제어 웰을 코팅해야 합니다. 이러한 세포 배양 삽입물은 후속 단계(단계 6.3)에 기술된 바와 같이, 세포가 존재하지 않는 세포 배양 삽입물의 배경 저항성을 측정하기 위해 사용될 것이다.
3. P200 피펫을 사용하여 각 세포 배양 삽입물의 정점(상단) 표면을 150μL의 희석된 기저막 매트릭스로 덮습니다. 인서트의 멤브레인을 건드리지 않고 인서트 중앙에 피펫 팁을 놓고 용액을 부드럽게 배출합니다. 플레이트를 5%_CO2 가 포함된 멸균된 37°C 인큐베이터에 최소 1시간 동안 놓습니다.
4. 사용하기 전에 기저막 매트릭스를 부드럽게 제거하고 세포 배양 삽입물을 생물학적 안전 캐비닛에서 최소 10분 동안 건조시킵니다.
   1. 기저막 매트릭스를 제거하려면 24웰 플레이트를 45° 각도로 회전합니다. 한 손가락을 프롱 모서리에 대고 인서트를 고정하고 P200 피펫을 사용하여 인서트 바닥면을 따라 피펫 팁을 부드럽게 놓고 매트릭스를 제거합니다.
   2. 각각의 세포 배양 삽입물을 Ca²⁺ 또는 Mg²⁺ 없이 150 μL의 멸균 DPBS로 세척하여 임의의 과잉 잔류물을 제거한다.
5. 10분 건조 후, 쥐 단층 배지 400 μL를 세포 배양 삽입물의 하단에 첨가하고 75 μL를 상단에 첨가한다. 모든 세포 배양 삽입물이 잠길 때까지 반복합니다. 플레이트를 생물학적 안전 캐비닛에 그대로 두거나 필요할 때까지 인큐베이터에 다시 넣으십시오.
6. 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 성숙한(성장 3-5일차에 오가노이드) 장 콜로노이드의 24웰 플레이트를 제거하고 생물학적 안전 캐비닛 아래에 놓습니다. 멸균 팁을 사용하여 배지를 제거하고 1mL의 RT 멸균 DPBS(Ca 2+ 또는 Mg²⁺ 없음)로 각 웰을 세척합니다.
   참고: 75-125개의 성숙한 콜로노이드의 개별 웰을 1:4의 비율로 분할합니다.
7. 멸균 팁을 사용하여 Ca2+ 또는^Mg2+ 없이 DPBS를 제거하고, 계대할 각 웰에 500μL의 RT 효소 해리 시약을 배치하여 기저막 매트릭스의 각 플러그를 분해합니다.
8. 각 웰을 위아래로 약 6-10회 피펫하여 플러그를 끊습니다. 플러그를 제거하기 위해 플레이트 바닥을 긁지 마십시오. 대신 24웰 플레이트를 45° 각도로 회전하고 피펫 끝을 플러그 가장자리에 놓고 부드럽게 빼냅니다.
9. 24웰 플레이트를 멸균된 37°C, 5%_CO2 인큐베이터에 3-4분 동안 다시 놓습니다.
10. 플레이트를 제거하고, 생물학적 안전 캐비닛 아래의 각 웰에 대해 효소 해리 시약을 5-7회 위아래로 피펫팅합니다. 분리된 콜로노이드를 각 웰에서 멸균된 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 얼음처럼 차가운 마우스 세척 배지로 최대 10mL의 용량을 가져옵니다.
11. 스윙 버킷 원심분리기에서 4°C에서 300 x g 의 5분 동안 부분적으로 분해된 콜로노이드를 원심분리합니다.
12. 생물학적 안전 캐비닛 아래에서 10mL 피펫을 사용하여 펠릿에서 상청액을 제거합니다. P200 피펫을 사용하여 남아 있는 배지를 제거합니다. 쥐 단층 배지에 콜로노이드 펠릿을 재현탁합니다. 플레이팅할 단편화된 콜로노이드의 각 세포 배양 삽입물당 75μL의 배지를 추가합니다.
13. 75 μL의 콜로노이드 현탁액을 각 세포 배양 삽입물의 중앙에 추가합니다. 콜로노이드 현탁액을 각 웰에 추가하기 전에 75μL를 제거하기 전에 한두 번 위아래로 부드럽게 피펫하여 보다 균일한 도금을 가능하게 합니다.
14. 세포 배양 삽입물이 있는 24웰 플레이트를 회전 플랫폼에 10분 동안 놓아 세포 배양 삽입물 전체에 균일한 분산을 추가로 허용합니다.
15. 플레이트를 멸균된 37°C, 5%_CO2 인큐베이터에 넣습니다.
16. 다음날(Day 1), P200 피펫으로 배지를 3-5회 위아래로 피펫팅하여 부착되지 않은 콜로노이드 단편을 제거합니다. 부착된 장 세포를 방해하지 않도록 팁을 세포 배양 삽입물 내부와 함께 부드럽게 놓습니다. 부착되지 않은 모든 조각이 제거되는 것을 방지하므로 매체에 기포를 넣지 마십시오.
17. 배지와 콜로노이드 혼합물을 즉시 제거하십시오. 모든 세포 배양 삽입물이 세척될 때까지 반복합니다.
18. 150 μL의 미리 데워진 쥐 단층 배지를 각 세포 배양 삽입물의 정점 쪽에 부드럽게 추가합니다. 400 μL의 따뜻해진 쥐 단층 배지를 새로운 24-웰 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 멸균 집게를 사용하여 갈래를 잡고 세포 배양 삽입물을 새 플레이트로 옮깁니다. 합류 할 때까지 격일로 매체를 변경하십시오.
    참고: 콜로노이드 조각은 도금 후 3-5일 후에 합류 단층을 형성해야 합니다.

7. 단층 배양 3 - 5일에 전압저항계를 사용하여 상피 단층의 순 저항 측정

알림: 젓가락 전극은 집게와 비슷하며 길이가 비대칭입니다. 프로브의 긴 팔은 기저측 전극이고 짧은 팔은 정점 전극입니다. 상기 프로브는 세포 배양 삽입물의 내부와 외부 사이에 삽입하기 어려울 수 있다. 삽입 시 프로브를 약간의 각도로 배치한 다음 프로브를 수직으로 곧게 펴면 프로브가 고착되는 것을 방지할 수 있습니다. 각 세포 배양 삽입물의 순 저항은 값에 영향을 줄 수 있으므로 유사한 각도로 읽어야 합니다.

1. 전압계와 모든 시약을 생물학적 안전 캐비닛 안에 넣습니다.
   1. 전압저항계를 가장 가까운 AC 콘센트에 꽂고 전극 프로브의 플라스틱 모듈식 커넥터를 전면 디스플레이의 INPUT 잭에 꽂습니다.
   2. 전압저항계를 45° 각도로 배치하려면 장비 뒷면에 있는 금속 암이 제자리에 고정될 때까지 바깥쪽으로 돌립니다.
   3. 이제 전면 디스플레이의 전원 스위치를 위로 돌려 전압계를 켭니다. 마지막으로 스위치를 OHMS 쪽으로 뒤집어 이 메트릭에 판독값을 표시합니다.
2. 37°C, 5%_CO2 인큐베이터에서 24웰 플레이트를 제거하고 플레이트를 생물학적 안전 캐비닛에 평평하게 놓습니다. 경상피 전기 저항(TEER)은 온도에 민감합니다. TEER을 읽기 직전에만 플레이트를 제거하십시오.
3. 전극 프로브를 예열된 70% 에탄올로 30초에서 1분 동안 멸균합니다. 프로브를 제거하고 뒤집어서 1-2회 튕겨 과도한 에탄올을 제거합니다. 프로브를 약 30초 동안 자연 건조시킵니다.
4. 프로브에 남아 있는 에탄올은 미리 데워진 마우스 세척 배지로 세척합니다.
   주의: 프로브의 위쪽에 남아 있는 에탄올 방울이 세포 배양 삽입물에 떨어지지 않도록 하십시오. 에탄올을 배지로 세척 할 때 배지가 멸균 에탄올 필드 위로 올라가지 않도록하십시오. 이로 인해 오염된 배지가 세포 배양 삽입물에 들어갈 수 있습니다.
5. 프로브를 세포 배양 삽입물에 수직으로 잡습니다. 기저측 전극(프로브의 긴 끝)이 24웰 플레이트의 바닥에 닿을 때까지 세포 배양 삽입물의 바깥쪽에 삽입합니다. 정점 전극(프로브의 짧은 끝)을 세포 배양 삽입물에 밀어 넣습니다. 두 전극의 거리를 우물에서 우물로 바꾸지 마십시오. 이것은 TEER 측정에 영향을 미칩니다.
6. TEER을 읽기 전에 정점 전극이 세포 배양 삽입물의 베이스에 닿지 않는지 확인하십시오. 백그라운드 컨트롤 세포 배양 삽입물로 시작하고 값을 기록합니다. 값은 전압계 전면에 자동으로 디지털 방식으로 표시됩니다.
7. 각 세포 배양 삽입물에 대해 7.5-7.6단계를 반복합니다.
   참고: 세포 배양 삽입물 사이에 다른 실험 조건이 존재하는 경우 각각의 새로운 조건 사이에 프로브를 멸균합니다. 7.1 단계에서 시작하여 단계를 숫자로 진행합니다.
8. 모든 TEER 측정이 기록되면 24웰 플레이트를 다시 인큐베이터에 넣습니다.
9. 350 Ω 이상의 순 값은 단층 형성을 나타냅니다. 단층 형성이 이루어질 때까지 다음 날에 다시 반복하십시오.
   참고: 일반적으로 1,000 Ω 이상의 값은 3일차에 캡처할 수 있지만 시간이 지남에 따라 모두 약 350 Ω 더 낮은 숫자로 수렴됩니다.

8. 전압저항계의 순 저항 측정을 사용하여 TEER 계산

참고: 콜로노이드의 성공적인 단층 형성은 115 Ω·^cm2보다 큰 TEER 측정값을 제공합니다.

1. 개별 순 저항 값을 취하고 배경에서 순 저항을 뺍니다. 기저 매트릭스 멤브레인으로 코팅된 세포 배양 삽입물은 약 100 Ω의 순 판독값을 제공합니다.
2. 배경에서 뺀 순 저항 측정값에 세포 배양 삽입물의 표면적을 곱합니다. 24-웰 세포 배양 삽입물은 0.33^cm2의 표면적을 갖는다.
3. 값이 115 Ω·^cm2 이상인 경우 다운스트림 실험 분석으로 진행합니다.

9. 염증 매개체로 상피 단층에서 염증 유도

1. 성공적인 단층이 형성되면 배양의 기초 쪽에 있는 배양에 염증 매개체를 추가합니다. 단계 1.9에 설명된 대로 염증 매개체 단층 배지를 준비하고 새로운 24웰 플레이트의 각 웰에 400μL를 추가합니다.
2. 세포 배양 삽입물의 정점 쪽에서 배지를 제거하고, Y-27632가 없는 뮤린 단층 배지 150 μL를 첨가한다. 이 쪽에 염증 매개체를 보충하지 마십시오. 그러나 세포 사멸이 과도하다고 생각되면 Y-27632를 미디어에 그대로 두십시오. 이는 최종 사용자가 결정해야 합니다.
3. 세포 배양 삽입물을 새로운 24-웰 플레이트로 옮기고, 염증 매개체 단층 배지가 보충된 웰에 넣는다.
4. 실험에 따라 24-72 시간 동안 염증 매개체로 단층을 자극하십시오.
5. 이 염증 모델을 사용하여 약물 반응을 테스트하려면 세포 배양 삽입물의 정점 쪽에 있는 단층 배지에 선택한 약물을 보충합니다. 약물은 약물의 작용 메커니즘 및 평가할 다운스트림 매개변수에 따라 실험의 어느 지점에서나 추가할 수 있습니다.

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결과

3D 장 결장 배양 시스템은 장 점막 항상성에 대한 상피의 본질적인 기여를 연구하는 데 매우 중요한 도구입니다. 설명된 프로토콜은 8주령에 C57BL/6J(WT) 마우스에서 크립트를 분리하고 여러 다운스트림 애플리케이션을 위해 조작할 수 있는 장기 콜로노이드 배양 시스템을 구축하는 방법에 대한 자세한 지침을 제공합니다. 기저막 매트릭스에서 크립트를 분리하고 도금할 때, 크립드는 명시야 현미경...

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토론

오가노이드 개발은 과학계가 접시에 담긴 동물이나 인간의 세포 구조와 기능을 부분적으로 요약할 수 있는 능력으로 체외에서 장기 시스템을 연구하는 방식에 혁명을 일으켰습니다. 또한, 질병이 있는 인간에게서 파생된 오가노이드 시스템은 치료 의사 결정을 안내할 수 있는 개인화된 의학을 위한 유망한 도구를 제공합니다. 여기에서는 잘 작동하는 크립트 격리 프로토콜에 대해 설명하?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4-μM transparent transwell, 24-well	Greiner Bio-one	662-641
15-mL conical tubes	Thermo Fisher	12-565-269
50-mL conical tubes	Thermo Fisher	12-565-271
70-μM cell strainer	VWR	76327-100
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
B-27 supplement	Invitrogen	12587-010	Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x)
Chopsticks Electrode Set for EVO	World Precision Instruments	STX2
Corning Matrigel GFR Membrane Mix	Corning	354-230	Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%)
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D0632-5G	Stock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water)
DMEM high glucose	Thermo Fisher	11960-069	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and Magnesium	Gibco	14190-144	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA)	Sigma-Aldrich	E7889	Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM)
Fetal Bovine Serum	Bio-Techne	S11150H	Stock Concentration (100%); Final Concentration (1%)
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mm	Thermo Fisher	12-550-15
G418	InvivoGen	ant-ga-1	Final Concentration (400 µg/µL)
Gentamicin Reagent	Gibco/Fisher	15750-060	Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL)
GlutaMAX-1	Fisher Scientific	35050-061	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
HEPES 1 M	Gibco	15630-080	Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM)
hIFNγ	R&D Systems	285-IF	Stock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hIL-1β	R&D Systems	201-LB	Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hTNFα	R&D Systems	210-TA	Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
Hydrogen Peroxide	Sigma	H1009	Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media)
Hygromycin B Gold	InvivoGen	ant-hg-1	Final Concentration (400 µg/µL)
L-WRN Cell Line	ATCC	CRL-3276
mEGF	Novus	NBP2-35176	Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
N-2 supplement	Invitrogen	17502-048	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma	A9165-5G	Stock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water)
Noggin	Peprotech	250-38	Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher	15140-122	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposable	VWR	25384-342
Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterile	Greiner Bio-one	5666-2160
R-Spondin	R&D Systems	3474-RS-050	Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
Tryp LE Express	Thermo Fisher	12604-013	Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA)
UltraPure Water	Invitrogen	10977-023	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Y-27632 dihyddrochloride	Abcam	ab120129	Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water)