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Résumé

Nous décrivons un protocole détaillant l’isolement des cryptes coliques murines pour le développement de colonoïdes en 3 dimensions. Les colonoïdes établis peuvent ensuite être différenciés en phase terminale pour refléter la composition cellulaire de l’épithélium hôte avant de recevoir un défi inflammatoire ou d’être dirigés vers l’établissement d’une monocouche épithéliale.

Résumé

L’épithélium intestinal joue un rôle essentiel dans la santé humaine, fournissant une barrière entre l’hôte et l’environnement extérieur. Cette couche cellulaire très dynamique fournit la première ligne de défense entre les populations microbiennes et immunitaires et aide à moduler la réponse immunitaire intestinale. La perturbation de la barrière épithéliale est une caractéristique de la maladie inflammatoire de l’intestin (MII) et présente un intérêt pour le ciblage thérapeutique. Le système de culture colonoïde en 3 dimensions est un modèle in vitro extrêmement utile pour étudier la dynamique des cellules souches intestinales et la physiologie des cellules épithéliales dans la pathogenèse des MII. Idéalement, l’établissement de colonoïdes à partir du tissu épithélial enflammé des animaux serait le plus bénéfique pour évaluer les influences génétiques et moléculaires sur la maladie. Cependant, nous avons montré que les changements épithéliaux in vivo ne sont pas nécessairement retenus chez les colonoïdes établis à partir de souris présentant une inflammation aiguë. Pour remédier à cette limitation, nous avons développé un protocole pour traiter les colonoïdes avec un cocktail de médiateurs inflammatoires qui sont généralement élevés pendant les MII. Bien que ce système puisse être appliqué de manière omniprésente à diverses conditions de culture, ce protocole met l’accent sur le traitement à la fois sur les colonoïdes différenciés et sur les monocouches à 2 dimensions dérivées de colonoïdes établis. Dans un environnement de culture traditionnel, les colonoïdes sont enrichis en cellules souches intestinales, offrant un environnement idéal pour étudier la niche des cellules souches. Cependant, ce système ne permet pas une analyse des caractéristiques de la physiologie intestinale, telles que la fonction de barrière. De plus, les colonoïdes traditionnels n’offrent pas la possibilité d’étudier la réponse cellulaire des cellules épithéliales différenciées en phase terminale aux stimuli pro-inflammatoires. Les méthodes présentées ici fournissent un cadre expérimental alternatif pour remédier à ces limitations. Le système de culture monocouche en 2 dimensions offre également la possibilité de cribler des médicaments thérapeutiques ex vivo. Cette couche polarisée de cellules peut être traitée avec des médiateurs inflammatoires sur la face basale de la cellule et en concomitance avec des thérapies putatives apicalement pour déterminer leur utilité dans le traitement des MII.

Introduction

La maladie inflammatoire de l’intestin (MII) est une maladie chronique, rémittente et récurrente caractérisée par des épisodes d’inflammation et de quiescence clinique. L’étiologie de la MII est multifactorielle, mais les principales caractéristiques de la maladie comprennent une fonction de barrière défectueuse et une perméabilité accrue de l’épithélium intestinal, en plus des cascades de signalisation pro-inflammatoires activées dans le compartiment épithélial 1,2. Plusieurs modèles in vitro et in vivo ont été utilisés pour récapituler la réponse épithéliale au cours de la MII, y compris la culture cellulaire et les modèles murins de l’inflammation3. Cependant, tous ces systèmes présentent des lacunes importantes qui limitent leur capacité à récapituler les changements épithéliaux au cours de la MII4. La plupart des lignées cellulaires utilisées pour étudier les MII sont transformées, ont la capacité de former une monocouche et peuvent différencier3 mais se propagent intrinsèquement différemment des cellules épithéliales intestinales non transformées de l’hôte. Plusieurs modèles murins différents de l’inflammation sont utilisés pour étudier les MII, dont certains comprennent des modèles knock-out, des modèles infectieux, des modèles inflammatoires chimiques et des modèles de transfert de lymphocytes T 5,6,7,8. Bien que chacun puisse étudier certains aspects étiologiques des MII, tels que les prédispositions génétiques, le dysfonctionnement de la barrière, la dérégulation immunitaire et le microbiome, ils sont limités dans leur capacité à étudier la nature multifactorielle de la maladie.

Les organoïdes intestinaux, y compris les entéroïdes et les colonoïdes, ont été établis au cours de la dernière décennie comme un modèle in vitro utile pour étudier non seulement la dynamique des cellules souches intestinales, mais aussi leur rôle dans l’intégrité de la barrière et la fonction de l’épithélium intestinal dans l’homéostasie et la maladie intestinales. Ces entités ont contribué de manière significative à notre compréhension de la pathogenèse de la MII9 et ont ouvert de nouvelles possibilités pour la médecine personnalisée. Des colonoïdes, ou des cultures tissulaires auto-organisées dérivées de cellules souches du côlon, ont été développées à partir de tissus murins et humains dans un processus qui permet aux cellules souches situées dans les cryptes intestinales de se propager et d’être maintenues indéfiniment10. La niche des cellules souches in vivo s’appuie sur des facteurs extracellulaires pour soutenir sa croissance, notamment les voies canoniques de signalisation Wnt et de signalisation des protéines morphogéniquesosseuses 11. L’ajout de ces facteurs favorise la santé et la longévité des colonoïdes, mais conduit également la culture vers un état semblable à celui des cellules souches qui ne reflète pas l’architecture cellulaire épithéliale in vivo, qui se compose à la fois de cellules auto-renouvelées et de cellules différenciées en phase terminale12,13. Alors que la fonctionnalité de l’épithélium intestinal dépend de la diaphonie continue entre le compartiment des cellules souches et les cellules différenciées, la capacité d’avoir les deux dans un système de culture colonoïde est assez limitée. Malgré ces limites, le système de culture organoïde reste l’étalon-or pour étudier les propriétés intrinsèques de l’épithélium ex vivo. Néanmoins, il peut être nécessaire d’envisager des stratégies culturales alternatives pour répondre à la question scientifique en question.

Il a été démontré que les souris suivant un régime continu de 7 jours de sulfate de sodium de dextrane (DSS) développent à la fois une inflammation épithéliale et un dysfonctionnement de la barrière14. De plus, l’échec de la biogenèse mitochondriale et la reprogrammation métabolique dans l’épithélium intestinal, qui se sont révélés évidents dans les MII humaines, ont également été capturés dans ce modèle DSS de colite15. Cependant, nos données préliminaires démontrent que les caractéristiques de l’échec de la biogenèse mitochondriale ne sont pas retenues chez les colonoïdes dérivés des cryptes des animaux traités par DSS (Figure supplémentaire 1). Ainsi, des méthodes de culture alternatives doivent être utilisées lors de l’examen de la façon dont l’inflammation entraîne des changements épithéliaux au cours de l’inflammation intestinale murine. Ici, nous décrivons un protocole que nous avons développé qui décrit 1) comment isoler les cryptes du tissu colique entier pour l’établissement de colonoïdes murins, 2) comment différencier définitivement cette population cellulaire pour refléter la population cellulaire telle qu’elle se présente in vivo, et 3) comment induire une inflammation dans ce modèle in vitro . Pour étudier les interactions médicamenteuses au sein de l’épithélium enflammé, nous avons développé un protocole pour établir des monocouches 2-dimensonales (2D) à partir de colonoïdes murins qui peuvent être traités de manière basale avec des médiateurs inflammatoires et traités apiquement avec des thérapies médicamenteuses.

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Protocole

Toutes les expériences utilisant des tissus murins décrites ici ont été approuvées par l’Institutional Review Board de l’Université de Pittsburgh et menées conformément aux directives établies par le Comité de recherche et de soins des animaux de l’Université de Pittsburgh et de l’UPMC.

1. Préparation à la culture

REMARQUE : Tous les réactifs sont répertoriés dans la section Tableau des matériaux et toutes les compositions de solution se trouvent dans le tableau de composition de la solution (Tableau 1).

  1. Préparer le produit de lavage de la souris comme décrit dans le tableau 1. Conserver à 4 °C jusqu’à 2 mois.
  2. Préparez le tampon d’isolation cryptique 1 (CIB1) comme décrit dans le Tableau 1. Conserver à 4 °C jusqu’à 2 mois.
    ATTENTION: Le dithiothréitol (DTT) est considéré comme dangereux par la norme de communication des dangers de l’OSHA en raison de la toxicité aiguë potentielle en cas d’ingestion et des lésions cutanées et oculaires si ces zones y sont exposées. Des gants de protection, une protection oculaire et une protection faciale doivent être utilisés lors de la manipulation de ce produit chimique.
  3. Préparez le tampon d’isolation cryptique 2 (CIB2) comme décrit dans le tableau 1. Conserver à 4 °C jusqu’à 2 mois.
  4. Préparer le milieu conditionné au L-WRN selon un protocole16 publié précédemment.
  5. Préparer un milieu colonoïde complet comme décrit dans le tableau 1. Le milieu de croissance colonoïde complet peut être conservé jusqu’à 5 jours à 4 °C sans perte d’activité.
  6. Préparer le milieu de différenciation comme décrit dans le tableau 1. Ce protocole a été modifié à partir d’un article publié précédemment17. Le milieu de différenciation peut être conservé jusqu’à 5 jours à 4°C sans perte d’activité.
  7. Préparer le milieu médiateur de l’inflammation comme décrit dans le tableau 1. Ce protocole a été modifié à partir d’un article publié précédemment18. Le milieu médiateur de l’inflammation peut être conservé jusqu’à 5 jours à 4°C sans perte d’activité.
  8. Préparer le milieu monocouche murin. Omettre Y-27632 lorsque vous défiez les monocouches avec des facteurs inflammatoires et / ou des médicaments. Le milieu monocouche murin peut être conservé jusqu’à 5 jours à 4°C sans perte d’activité.
  9. Préparer le milieu monocouche médiateur de l’inflammation. Le milieu monocouche médiateur de l’inflammation peut être conservé jusqu’à 5 jours à 4°C sans perte d’activité.

2. Isolement de la crypte à partir du tissu colique murin

REMARQUE : Transférer le tissu sur de la glace. Prélever la quantité appropriée de matrice membranaire basale de l’entreposage à −20 °C et décongeler sur la glace. Chaque puits de 24 est plaqué avec 15 μL de matrice membranaire basale. Préparer CIB1, CIB2 et le milieu de croissance colonoïde complet comme décrit à la rubrique 1.

  1. Euthanasier une souris C57BL/6J (âgée de 6 à 8 semaines) selon le protocole approuvé par le Comité de soin et d’utilisation des animaux en établissement, et extraire l’extrémité distale (environ 5 à 7 cm) du côlon à l’aide d’une pince à épiler et de ciseaux propres.
    REMARQUE: Dans cette étude, les sujets ont été euthanasiés en utilisant une incubation de chambre de dioxyde de carbone pendant 2-3 minutes suivie d’une luxation cervicale.
    1. Pour cela, placez la souris sur son dos, faites une incision horizontale juste en dessous de la cage thoracique, puis une incision verticale du milieu de l’incision horizontale vers la base de la queue pour exposer la cavité abdominale.
    2. Avec une pince à épiler, déplacez l’intestin grêle hors du champ, identifiez le côlon et suivez-le jusqu’à la base de la queue. Cassez le bassin avec des ciseaux pour exposer complètement le côlon distal si nécessaire. Utilisez les ciseaux pour couper les 5-7 cm les plus distaux du côlon.
  2. Placez le tissu du côlon sur une surface propre. Enlevez l’excès de graisse sérosale qui entoure le côlon. Enlevez les matières fécales en rinçant le contenu luminal du côlon avec la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) à l’aide d’une seringue fixée à une aiguille de 18 G 1 1/2. Ensuite, placez le côlon dans un tube conique de 50 mL contenant 10 mL de DPBS glacé et placez-le sur de la glace.
    REMARQUE : Si vous isolez le côlon de plus d’un animal, placez le tissu sur de la glace avant de passer à l’animal suivant.
  3. Transférer le tissu du côlon dans une boîte de Petri avec 10 ml de DPBS glacé et irriguer la lumière deux fois avec DPBS à l’aide d’une pipette P1,000.
  4. Ouvrez le côlon longitudinalement à l’aide de ciseaux et secouez doucement à l’aide d’une pince à épiler pendant ~30 s dans le DPBS pour éliminer tout contenu fécal restant.
  5. Transférer le mouchoir dans une nouvelle boîte de Petri avec 10 ml de DPBS glacé, et agiter doucement à l’aide d’une pince à épiler avant de couper le côlon en morceaux de 2 cm à l’aide de ciseaux et de les placer dans un tube conique de 50 ml contenant 7 ml de CIB1 glacé. Incuber le tissu dans CIB1 sur de la glace pendant 20 min.
    REMARQUE : Les étapes restantes sont effectuées à l’intérieur d’une enceinte de sécurité biologique.
  6. Transférer le tissu à l’aide d’une pince à épiler dans un tube conique préchauffé de 50 mL contenant 7 mL de CIB2 et incuber au bain-marie à 37 °C pendant 5 min.
  7. Retirez le CIB2 du tube conique de 50 ml en laissant le tissu se déposer au fond du tube conique, puis en pipetant le CIB2. Ensuite, ajoutez 10 ml de liquide de lavage de souris glacé dans le même tube conique.
  8. Procurez-vous un nouveau tube conique de 50 ml et placez un filtre de 70 μm sur le tube ouvert.
  9. Tout en tenant le tube avec le contenu du côlon, tournez la main d’environ 45 °. Secouez le tube de manière berçante et vigoureuse pendant 45 s pour libérer les cryptes. Ensuite, versez la suspension cryptique à travers la crépine cellulaire de 70 μm dans un nouveau tube conique de 50 mL.
  10. À l’aide d’une pince à épiler, replacez le tissu du côlon dans le tube conique vide de 50 ml et ajoutez 10 ml de produit de lavage de souris glacé. Procurez-vous une nouvelle crépine cellulaire de 70 μm et placez-la sur le tube conique de 50 mL contenant la solution filtrée précédente.
  11. Encore une fois, prenez le tube de 50 mL contenant les fragments de crypte et secouez-le de la même manière qu’à l’étape 2.9. Filtrer le milieu à travers la crépine cellulaire de 70 μm dans le tube conique de 50 ml pour le combiner avec les cryptes préalablement filtrées.
    REMARQUE: Si le rendement en crypte est faible, secouez le tissu du côlon une fois de plus en plaçant le tissu dans un tube conique vide de 50 ml avec 10 ml de produit de lavage de souris. Secouez le tissu pendant 45-50 s pour libérer les cryptes. De plus, si le rendement de la crypte est faible, augmentez la vigueur de la secousse. Enfin, si le rendement global de la crypte est faible, les pipets et les tubes peuvent être recouverts de sérum bovin fœtal (FBS) pour empêcher l’adhérence du tissu au plastique.
  12. Centrifuger le tube conique de 50 mL contenant les cryptes filtrées à 300 x g pendant 5 min à 4°C.
    REMARQUE : Une pastille doit être observée au fond du tube conique de 50 mL.
  13. Décanter le milieu par pipetage, remettre en suspension les cryptes en pipetant de haut en bas avec 10 ml de produit de lavage de souris glacé et transférer dans un tube conique de 15 mL. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4°C.
  14. Pour obtenir une préparation plus propre, lavez les cryptes avec 10 ml supplémentaires de produit de lavage de souris. Décanter le milieu précédent et remettre en suspension les cryptes en tuytant de haut en bas dans 10 ml de produit de lavage de souris. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4°C à l’aide d’un tube conique de 15 mL.
    NOTE: Des précautions doivent être prises lors du pipetage du milieu car, parfois, la pastille n’est pas centrifugée hermétiquement. Si la pastille n’est pas serrée, pipeter la majeure partie du milieu, en laissant 500 μL à 1 mL. Ensuite, remettre la pastille en suspension en pipetant dans 10 mL de produit de lavage de souris et transférer la solution dans un tube conique de 15 mL. La centrifugation dans un tube conique plus petit peut améliorer l’étanchéité de la pastille.
  15. Décanter le milieu et remettre en suspension les cryptes en tuyautant de haut en bas avec 10 ml de produit de lavage de souris glacé. Une fois remise en suspension, comptez les cryptes au microscope à fond clair en pipetant immédiatement 10 μL du milieu sur une lame de verre.
    1. Placez deux gouttes de 10 μL aux extrémités séparées de la lame et comptez le nombre de cryptes dans chaque gouttelette. Faites la moyenne des nombres entre les deux gouttes pour déterminer le nombre de cryptes par 10 μL. Multipliez ce nombre par 100 pour obtenir le nombre de cryptes dans 1 mL.
      REMARQUE: Pour un comptage précis, 10 μL de la suspension cryptique doivent être immédiatement retirés après la remise en suspension. Sinon, les cryptes tomberont au fond du tube, ce qui entraînera un décompte inexact.
  16. Dans le but de placer 300 à 500 cryptes par puits, transférer le volume approprié de cryptes remises en suspension dans le produit de lavage de souris dans un nouveau tube conique de 15 ml et porter à 10 ml avec un produit de lavage de souris glacé. Centrifuger le tube à 300 x g pendant 5 min à 4°C. Une petite pastille doit être visible au fond du tube.
  17. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette d’alimentation. Utilisez une pipette P200 pour éliminer soigneusement tout milieu résiduel, ne laissant que la pastille.
  18. Remettez la pastille en suspension dans la quantité appropriée de matrice membranaire basale glacée en pipitant lentement de haut en bas. Attention à ne pas introduire de bulles lors de la remise en suspension de la pastille de crypte. Plaque 300-500 cryptes/15 μL de matrice membranaire basale dans chaque puits d’une plaque. Après le placage, retourner la plaque de culture tissulaire et la placer dans un incubateur à 37 °C pendant 10 à 20 minutes.
  19. Retournez la plaque et ajoutez 500 μL du milieu colonoïde complet de la souris à chaque puits. Changez le support tous les deux jours jusqu’à ce qu’il soit prêt à passer. Passage des colonoïdes tous les 3-5 jours.

3. Passage des colonoïdes

NOTE: Chaque puits peut généralement être passé de 1:4 à 1:6 selon la densité du puits d’origine. Prélevez la quantité appropriée de matrice membranaire basale de −20 °C et placez-la sur de la glace pour la décongeler. Les colonoïdes peuvent être utilisés pour des expériences après deux passages. Lors du passage de colonoïdes, les étapes sont effectuées dans une armoire de sécurité biologique pour éviter la contamination.

  1. Retirer le milieu des puits à traverser.
    1. S’il y a des débris dans la matrice de la membrane basale, ce qui peut se produire lors de l’isolement initial, le protocole suivant peut être utilisé pour nettoyer les débris:
      1. Ajouter 1 mL d’albumine sérique bovine (BSA) glacée à 0,1 % dans la DPBS sans Ca 2+ ou Mg2+ à chaque puits. Laissez-le reposer pendant 5 minutes dans l’enceinte de sécurité biologique.
      2. Monter et descendre la pipette trois à sept fois à l’aide d’une pipette P1000 pour perturber la matrice de membrane basale et recueillir le contenu des puits dans un tube conique de 15 mL. Centrifuger les colonoïdes dans un total de 5 à 10 mL de BSA à 0,1 % dans la DPBS sans Ca 2+ ou Mg2+. Compléter au volume approprié avec 0,1% de BSA.
      3. Centrifuger à 150 x g pendant 5 min à 4°C pour enduire les colonoïdes mais pas les débris.
      4. Décanter le DPBS en le pipetant, en laissant le granulé. Ajouter 1 mL de réactif de dissociation enzymatique à température ambiante (RT) et pipeter trois à cinq fois.
      5. Placer le tube conique de 15 mL avec le réactif de dissociation enzymatique et les colonoïdes perturbés dans un bain-marie à 37 °C pendant 3-4 min.
      6. Retirer le tube du bain-marie, pipeter 3 à 5 fois, puis porter à 10 ml avec un produit de lavage à la souris. Passez à l’étape 3.6.
  2. Placez 500 μL de réactif de dissociation enzymatique RT dans chaque puits et laissez-le reposer pendant environ 1 min avant de monter et descendre trois à sept fois pour perturber la matrice de la membrane basale.
  3. Placez la plaque dans un incubateur à 37°C pendant 3-4 min.
  4. Retirez la plaque de l’incubateur et pipette de haut en bas trois à sept fois à l’aide d’une pipette P1000 pour dissocier les colonoïdes.
  5. Transférer le contenu dans un tube conique de 15 ml et compléter jusqu’à 10 ml avec un produit de lavage de souris glacé.
  6. Centrifuger l’échantillon à 300 x g pendant 5 min à 4°C.
  7. Retirez le fluide à l’aide d’une pipette d’alimentation et d’une pipette P200 au besoin afin qu’il ne reste qu’une pastille dans le tube conique.
  8. Remettez en suspension dans une quantité appropriée de matrice membranaire de base glacée en pipetant doucement de haut en bas en fonction du nombre de puits à plaquer. N’introduisez pas de bulles lors du pipetage. Placer les fragments de colonoïdes dans 15 μL de gouttes de matrice membranaire basale par puits.
  9. Plaquez les cryptes, inversez la plaque de culture tissulaire, puis placez la plaque dans un incubateur à 37 °C pendant 10-20 min.
  10. Enfin, retournez la plaque et ajoutez 500 μL de milieu colonoïde de souris complet à chaque puits. Changez le milieu tous les deux jours jusqu’à ce qu’il soit devenu assez grand pour être passé à nouveau dans environ 3-5 jours.

4. Différenciation terminale des cellules colonoïdes

  1. Passez les colonoïdes comme ci-dessus, et ajoutez 500 μL du milieu colonoïde complet de souris à chaque puits.
  2. Au moins 48 h après le passage, retirer le milieu colonoïde complet de la souris et ajouter 500 μL du milieu différenciant à chaque puits (voir rubrique 1).
  3. Incuber les colonoïdes avec des milieux de différenciation pendant 48 h, après quoi ils peuvent être utilisés dans des expériences, y compris la collecte d’ARN et de protéines.
    NOTE: Les colonoïdes peuvent être évalués pour la différenciation en collectant de l’ARN et en évaluant l’expression de Lgr5 et Ki67, un marqueur de cellules souches et un marqueur de prolifération cellulaire, respectivement, via la transcription inverse quantitative en chaîne polymérase (qPCR). Les cellules différenciées en phase terminale devraient avoir une expression relativement faible de Lgr5 et Ki67 par rapport aux colonoïdes cultivés dans un milieu colonoïde traditionnel, où les cellules ressemblent davantage à des souches. La durée pendant laquelle les colonoïdes doivent incuber dans le milieu de différenciation peut devoir être optimisée pour chaque laboratoire. Voir le tableau supplémentaire 1 pour la liste des amorces.

5. Induire l’inflammation chez les colonoïdes différenciés avec des médiateurs inflammatoires

  1. Une fois que les colonoïdes ont été incubés pendant 2-3 jours avec le milieu de différenciation, retirez le milieu existant et ajoutez 500 μL du milieu médiateur de l’inflammation à chaque puits.
  2. Laisser les puits incuber pendant 24 à 72 heures avant de recueillir l’ARN et la protéine (ou d’évaluer d’autres paramètres en aval). Changez le support tous les jours.

6. Monocouches épithéliales intestinales dérivées de colonoïdes murins établis

REMARQUE: Les monocouches épithéliales intestinales murines sont dérivées de colonoïdes murins qui ont été passés au moins deux fois. Pour permettre une formation monocouche réussie en 3-5 jours, il est impératif de ne pas séparer les colonoïdes en cellules individuelles. Les organoïdes fragmentés qui ont été dissociés enzymatiquement en amas cellulaires sont idéaux pour la croissance.

  1. Préparez tous les réactifs avant de commencer l’expérience. Décongeler la matrice de la membrane basale sur la glace. Préparer le milieu monocouche murin comme décrit à la rubrique 1. Diluer la membrane basale décongelée 1:20 avec le milieu monocouche murin froid. Restez sur la glace.
  2. Utilisez des pinces stériles pour placer un insert de culture cellulaire transparent de 0,4 μm dans un seul puits d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits (Tableau des matériaux). Prenez une broche d’angle de l’insert et transférez-la dans le puits. Répétez l’opération jusqu’à ce que le nombre approprié d’inserts de culture cellulaire soit disponible pour la culture.
    REMARQUE: Assurez-vous d’enduire un puits de contrôle supplémentaire avec la matrice de membrane basale seulement. Cet insert de culture cellulaire sera utilisé pour mesurer la résistance de fond de l’insert de culture cellulaire sans cellules présentes, comme décrit à l’étape suivante (étape 6.3).
  3. À l’aide d’une pipette P200, couvrir la surface apicale (supérieure) de chaque insert de culture cellulaire avec 150 μL de matrice membranaire basale diluée. Placez l’embout de la pipette au centre de l’insert sans toucher la membrane de l’insert et expulsez doucement la solution. Placer la plaque dans un incubateur stérile à 37°C avec 5% de CO2 pendant au moins 1 h.
  4. Retirez délicatement la matrice membranaire basale avant utilisation et laissez sécher les inserts de culture cellulaire dans une enceinte de sécurité biologique pendant au moins 10 minutes.
    1. Pour retirer la matrice de membrane basale, faites pivoter la plaque à 24 puits à un angle de 45°. Placez un seul doigt sur le coin de la broche pour stabiliser l’insert et, à l’aide d’une pipette P200, placez doucement l’embout de la pipette le long de la face inférieure de l’insert et retirez la matrice.
    2. Éliminer tout résidu en excès en lavant chaque insert de culture cellulaire avec 150 μL de DPBS stérile sans Ca 2+ ou Mg2+.
  5. Après 10 min de séchage, ajouter 400 μL du milieu monocouche murin au bas de l’insert de culture cellulaire et 75 μL sur le dessus. Répétez l’opération jusqu’à ce que tous les inserts de culture cellulaire soient immergés. Laissez l’assiette dans l’armoire de sécurité biologique ou replacez-la dans l’incubateur jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
  6. Retirer la plaque de 24 puits de colonoïdes intestinaux matures (organoïdes aux jours 3 à 5 de croissance) de l’incubateur à 37 °C, 5 % de CO2, et placez-la sous l’enceinte de sécurité biologique. Retirer le milieu à l’aide d’embouts stériles et bien laver chaque avec 1 mL de DPBS stérile RT (sans Ca 2+ ou Mg2+).
    NOTE: Un puits individuel de 75-125 colonoïdes matures est divisé à un rapport de 1:4.
  7. Retirer le DPBS sans Ca 2+ ou Mg2+ à l’aide d’embouts stériles et digérer chaque bouchon de la matrice membranaire basale en plaçant 500 μL de réactif de dissociation enzymatique RT dans chaque puits à passager.
  8. Tuyau chaque puits de haut en bas environ 6-10 fois pour briser le bouchon. Ne grattez pas le bas de la plaque pour retirer le bouchon. Au lieu de cela, faites pivoter la plaque de 24 puits à un angle de 45°, placez l’extrémité de la pipette au bord du bouchon et délogez-la doucement.
  9. Replacez la plaque de 24 puits dans un incubateur stérile à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 3-4 min.
  10. Retirer la plaque et pipeter le réactif de dissociation enzymatique de haut en bas cinq à sept fois pour chaque puits sous une enceinte de sécurité biologique. Transférer les colonoïdes dissociés de chaque puits dans un tube conique stérile de 15 mL. Porter jusqu’à un volume de 10 ml avec un produit de lavage de souris glacé.
  11. Centrifuger les colonoïdes partiellement digérés à 300 x g à 4°C pendant 5 min dans une centrifugeuse à godet oscillant.
  12. Sous l’enceinte de sécurité biologique, retirer le surnageant de la pastille à l’aide d’une pipette de 10 mL. Retirez tout milieu restant à l’aide d’une pipette P200. Remettez en suspension la pastille de côloïde dans un milieu monocouche murin. Ajouter 75 μL de milieu par insert de culture cellulaire de colonoïdes fragmentés à plaquer.
  13. Ajouter 75 μL de suspension colonoïde au centre de chaque insert de culture cellulaire. Avant d’ajouter la suspension colonoïde à chaque puits, montez et descendez doucement une ou deux fois avant de retirer les 75 μL, ce qui permet un placage plus uniforme.
  14. Placez la plaque de 24 puits avec des inserts de culture cellulaire sur une plate-forme rotative pendant 10 minutes pour permettre une dispersion uniforme à travers l’insert de culture cellulaire.
  15. Placer la plaque dans un incubateur stérile à 37 °C, 5 % de CO2 .
  16. Le lendemain (Jour 1), délogez les fragments de colonoïdes non attachés en pipetant le milieu de haut en bas trois à cinq fois avec une pipette P200. Placez doucement l’embout à côté de l’intérieur de l’insert de culture cellulaire afin de ne pas perturber les cellules intestinales attachées. N’introduisez pas de bulles dans le milieu, car cela empêche l’élimination de tous les fragments non attachés.
  17. Retirer immédiatement le mélange milieu et colonoïde. Répétez l’opération jusqu’à ce que tous les inserts de culture cellulaire aient été nettoyés.
  18. Ajouter doucement 150 μL de milieu monocouche murin préchauffé sur la face apicale de chaque insert de culture cellulaire. Ajouter 400 μL de milieu monocouche murin chauffé à chaque puits d’une nouvelle plaque de 24 puits. Transférer l’insert de culture cellulaire sur la nouvelle plaque en saisissant sa broche à l’aide d’une pince stérile. Changez le milieu tous les deux jours jusqu’à confluence.
    NOTE: Les fragments de colonoïde doivent former une monocouche confluente 3-5 jours après le placage.

7. Mesure de la résistance nette des monocouches épithéliales à l’aide d’un voltohmmètre les jours 3 à 5 de culture monocouche

REMARQUE: Les électrodes de baguette ressemblent à des pinces et sont de longueur asymétrique. Le bras le plus long de la sonde est l’électrode basolatérale et le bras le plus court est l’électrode apicale. La sonde peut être difficile à insérer entre l’intérieur et l’extérieur de l’insert de culture cellulaire. Placer la sonde à un léger angle lors de l’insertion, suivi d’un redressement vertical de la sonde, empêchera la sonde de se coincer. Assurez-vous de lire la résistance nette de chaque insert de culture cellulaire sous un angle similaire, car cela peut avoir un impact sur les valeurs.

  1. Placez le voltohmmètre et tous les réactifs à l’intérieur d’une enceinte de sécurité biologique.
    1. Branchez le voltohmmètre sur la prise secteur la plus proche et branchez le connecteur modulaire en plastique de la sonde d’électrode dans la prise INPUT de l’écran avant.
    2. Pour placer le voltohmmètre à un angle de 45°, balancez le bras métallique à l’arrière de l’équipement jusqu’à ce qu’il se verrouille en place.
    3. Maintenant, allumez le voltohmmètre en tournant l’interrupteur d’alimentation vers le haut sur l’écran avant. Enfin, basculez l’interrupteur vers OHMS pour afficher la lecture dans cette mesure.
  2. Retirez la plaque à 24 puits de l’incubateur à 5 % de CO2 à 37 °C et posez-la à plat dans l’enceinte de sécurité biologique. La résistance électrique transépithéliale (TEER) est sensible à la température. Ne retirez la plaque qu’immédiatement avant la lecture du TEER.
  3. Stériliser la sonde électrode dans de l’éthanol préchauffé à 70% pendant 30 s à 1 min. Retirez la sonde, inversez-la et faites-la glisser une à deux fois pour éliminer l’excès d’éthanol. Laisser sécher la sonde à l’air pendant environ 30 s.
  4. Lavez tout éthanol restant sur la sonde avec un produit de lavage de souris préchauffé.
    ATTENTION : Ne laissez aucune des gouttelettes d’éthanol restantes plus haut sur la sonde tomber dans l’insert de culture cellulaire. Lorsque vous lavez l’éthanol avec un milieu, ne laissez pas le milieu dépasser le champ d’éthanol stérile. Cela pourrait entraîner la pénétration d’un milieu contaminé dans l’insert de culture cellulaire.
  5. Tenez la sonde perpendiculairement à l’insert de culture cellulaire. Insérez l’électrode basolatérale (extrémité la plus longue de la sonde) à l’extérieur de l’insert de culture cellulaire jusqu’à ce qu’elle touche la base de la plaque à 24 puits. Faites glisser l’électrode apicale (extrémité la plus courte de la sonde) dans l’insert de culture cellulaire. Ne faites pas varier la distance des deux électrodes de puits à puits. Cela aura un impact sur la mesure TEER.
  6. Vérifiez que l’électrode apicale ne touche pas la base de l’insert de culture cellulaire avant de lire le TEER. Commencez par l’insertion de culture cellulaire de contrôle en arrière-plan et enregistrez la valeur. La valeur sera automatiquement affichée numériquement à l’avant du voltohmmètre.
  7. Répétez les étapes 7.5 à 7.6 pour chaque insert de culture cellulaire.
    REMARQUE: Si différentes conditions expérimentales existent entre les inserts de culture cellulaire, stériliser la sonde entre chaque nouvelle condition. Commencez à l’étape 7.1 et passez numériquement par les étapes.
  8. Replacez la plaque de 24 puits dans l’incubateur une fois que toutes les mesures TEER ont été enregistrées.
  9. Les valeurs nettes à 350 Ω ou plus indiquent la formation de monocouches. Répéter à nouveau les jours suivants jusqu’à ce que la formation de monocouches ait été obtenue.
    REMARQUE: Généralement, les valeurs de 1 000 Ω ou plus peuvent être capturées le jour 3, mais au fil du temps, elles convergeront toutes vers un nombre inférieur autour de 350 Ω.

8. Calcul du TEER à l’aide de mesures de résistance nette à partir du voltohmmètre

NOTE: La formation monocouche réussie des colonoïdes donnera des mesures TEER supérieures à 115 Ω·cm2.

  1. Prenez les valeurs de résistance nette individuelles et soustrayez la résistance nette du puits de fond. Les inserts de culture cellulaire recouverts de la membrane de la matrice basale donneront une lecture nette d’environ 100 Ω.
  2. Prenez les mesures de résistance nette soustraites de fond et multipliez-les par la surface de l’insert de culture cellulaire. Un insert de culture cellulaire à 24 puits a une surface de 0,33 cm2.
  3. Si les valeurs sont égales ou supérieures à 115 Ω·cm2 , procéder aux essais expérimentaux en aval.

9. Induire une inflammation dans les monocouches épithéliales avec des médiateurs inflammatoires

  1. Une fois que les monocouches réussies se sont formées, ajoutez des médiateurs inflammatoires à la culture du côté basal de la culture. Préparer le milieu monocouche médiateur de l’inflammation, tel que décrit à l’étape 1.9, et ajouter 400 μL à chaque puits dans une nouvelle plaque de 24 puits.
  2. Retirer le milieu de la face apicale de l’insert de culture cellulaire et ajouter 150 μL du milieu monocouche murin sans Y-27632. Ne complétez pas ce côté avec des médiateurs inflammatoires. Cependant, si la mort cellulaire semble excessive, laissez le Y-27632 dans les médias. Cela doit être déterminé par l’utilisateur final.
  3. Transférer les inserts de culture cellulaire dans une nouvelle plaque de 24 puits et les placer dans les puits complétés par le milieu monocouche médiateur de l’inflammation.
  4. Stimuler les monocouches avec des médiateurs inflammatoires pendant 24-72 h, selon l’expérience.
  5. Pour tester les réponses médicamenteuses à l’aide de ce modèle inflammatoire, complétez le milieu monocouche sur la face apicale de l’insert de culture cellulaire avec le médicament de votre choix. Le médicament peut être ajouté à n’importe quel moment de l’expérience, en fonction du mécanisme d’action du médicament et des paramètres en aval à évaluer.

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Résultats

Le système de culture colonoïde intestinale 3D est un outil précieux pour étudier la contribution intrinsèque de l’épithélium à l’homéostasie de la muqueuse intestinale. Le protocole décrit fournit des instructions détaillées sur la façon d’isoler les cryptes des souris C57BL / 6J (WT) à l’âge de 8 semaines et d’établir un système de culture de colonoïdes à long terme qui peut être manipulé pour plusieurs applications en aval. Lors de l’isolement et du placage des cryptes dans la matrice ...

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Discussion

Le développement organoïde a révolutionné la façon dont la communauté scientifique étudie les systèmes d’organes in vitro avec la capacité de récapituler partiellement la structure cellulaire et la fonction d’un animal ou d’un humain dans une boîte. De plus, les systèmes organoïdes dérivés de maladies humaines offrent un outil prometteur pour la médecine personnalisée qui pourrait guider la prise de décision thérapeutique. Ici, nous décrivons un protocole d’isolation de crypte qui fon...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs contributeurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health Grants R01DK120986 (à K.P.M.).

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
0.4-μM transparent transwell, 24-wellGreiner Bio-one662-641
15-mL conical tubesThermo Fisher 12-565-269
50-mL conical tubesThermo Fisher 12-565-271
70-μM cell strainerVWR76327-100
Advanced DMEM/F12Invitrogen12634-010Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
B-27 supplement Invitrogen12587-010Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x)
Chopsticks Electrode Set for EVOWorld Precision InstrumentsSTX2
Corning Matrigel GFR Membrane MixCorning354-230Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%)
Dithiothreitol (DTT)Sigma-AldrichD0632-5GStock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water)
DMEM high glucoseThermo Fisher11960-069Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and MagnesiumGibco 14190-144Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA)Sigma-AldrichE7889Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM)
Fetal Bovine SerumBio-TechneS11150HStock Concentration (100%); Final Concentration (1%)
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mmThermo Fisher 12-550-15
G418InvivoGenant-ga-1Final Concentration (400 µg/µL)
Gentamicin ReagentGibco/Fisher15750-060Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL)
GlutaMAX-1Fisher Scientific35050-061Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
HEPES 1 MGibco15630-080Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM)
hIFNγR&D Systems285-IFStock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hIL-1βR&D Systems201-LBStock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hTNFαR&D Systems210-TAStock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
Hydrogen Peroxide SigmaH1009Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media)
Hygromycin B GoldInvivoGenant-hg-1Final Concentration (400 µg/µL)
L-WRN Cell LineATCCCRL-3276
mEGFNovusNBP2-35176Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
N-2 supplementInvitrogen17502-048Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
N-Acetyl-L-cysteineSigma A9165-5GStock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water)
NogginPeprotech250-38Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher15140-122Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposableVWR25384-342
Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterileGreiner Bio-one5666-2160
R-SpondinR&D Systems3474-RS-050Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
Tryp LE ExpressThermo Fisher12604-013Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA)
UltraPure Water Invitrogen10977-023Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Y-27632 dihyddrochloride Abcamab120129Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water)

Références

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