改良异位腹心移植及新型大鼠主动脉瓣反流模型

摘要

这项研究展示了一种可重复的大鼠异位腹心移植技术，初学者可以学习和执行。此外，通过进行异位腹心移植并在收获后使用导丝破坏供体的主动脉瓣，产生了一种新的大鼠主动脉瓣反流模型。

摘要

在过去的50年中，许多研究人员报告了小鼠和大鼠的异位腹心移植，手术技术存在一些差异。修改移植程序以加强心肌保护可以延长缺血时间，同时保留供体的心脏功能。该技术的关键点如下:在收获前横断供体的腹主动脉以卸载供体的心脏;用冷心脏停搏液灌注供体的冠状动脉;以及在吻合术过程中对供体心脏进行局部冷却。因此，由于该程序延长了可接受的缺血时间，因此初学者可以轻松执行并达到很高的成功率。

此外，在这项工作中使用与现有技术不同的技术建立了一种新的主动脉瓣反流（AR）模型，该技术是通过从右颈动脉插入导管并在连续超声心动图引导下刺穿自主动脉瓣而创建的。使用新型AR模型进行异位腹心移植。在该协议中，在采集供体的心脏后，将一根坚硬的导丝插入供体的头臂动脉并向前推进主动脉根部。即使在感觉到阻力后，也会通过进一步推动导丝刺穿主动脉瓣，从而诱发 AR。与传统AR模型中描述的手术相比，使用这种方法更容易损坏主动脉瓣。此外，这种新颖的AR模型对接受者的流通没有贡献;因此，这种方法有望产生比传统程序更严重的AR模型。

引言

Abbott等人于1964年首次报道了大鼠异位腹心移植1，并已用于研究急性和慢性同种异体移植排斥反应，心脏同种异体移植血管病变，缺血再灌注损伤和心脏重塑²，³，⁴，⁵，⁶，⁷，⁸，⁹，^10，11.在过去的50年中，该程序增加了一些修改。当前程序的基本原理如下。供体的升主动脉和肺动脉 （PA） 分别与受者的腹主动脉和下腔静脉进行端对侧吻合。虽然供体的左心房和心室不接受任何腔内血流，但血液流向供体的冠状动脉系统;因此，供体的心脏在解夹后再次开始跳动。

一些具有数百或数千例手术经验的专家报告说，异位腹心移植的成功率高，缺血时间短2，³，^4，5;但是，初学者很难从一开始就实现短暂的缺血时间。足够的心脏保护是获得供体心脏良好心脏收缩的重要因素。心肌保护不足会使供体的心脏变硬。因此，我们修改了移植程序，以加强对捐赠者心脏的保护。本研究的目的之一是证明一种可重复的异位腹心移植手术，初学者可以轻松进行，因为它延长了可接受的缺血时间。

此外，一些研究人员报告了大鼠的主动脉瓣反流（AR）模型，该模型已被用于检查药物对左心室（LV）重塑的影响¹²，¹³，^14，15。常规手术包括以下内容:（1）麻醉后做右颈外侧切口以暴露右颈动脉;（2）导管从该血管中插管并向主动脉根部推进;（3）AR是在连续超声心动图引导下刺穿自主动脉瓣诱导的。

然而，在握住超声心动图探头的同时刺穿主动脉瓣，并通过超声心动图获得升主动脉、主动脉瓣和导管的良好视野是具有挑战性的。此外，急性AR后的心力衰竭是另一种并发症。因此，在这项工作中建立了一种新颖的AR模型，该模型可以轻松创建并且对接收者的流通没有贡献，以解决这些挑战。本研究的另一个目的是通过使用异位腹心移植并在收获后使用导丝破坏供体的主动脉瓣来创建AR模型。

研究方案

所有动物程序均按照日本政府环境省的"动物福利和管理法大纲"和"关于实验动物护理、饲养和减轻疼痛的标准"以及日本科学委员会的"正确进行动物实验指南"进行^16， 17^，18.动物方案由东京大学机构动物护理和使用委员会（M-P19-065）审查和批准。

1.大鼠异位腹心移植

注意:异位腹心移植在7-9周龄的雄性Jcl:Wistar大鼠中进行。使用6.7倍至45倍放大倍率的显微镜来执行该程序。手术器械被高压灭菌以进行灭菌。

1. 供体心脏收获
   1. 通过腹膜内注射美托咪定（0.15mg / kg），咪达唑仑（2.0mg / kg）和布托芬诺（2.5mg / kg） 麻醉 供体大鼠。
   2. 将大鼠仰卧在手术板上的加热垫上，并使用松紧带固定四肢。用电动剃须刀和脱毛膏尽可能多地去除皮毛。随后，用碘和70%酒精擦洗膏清洁操作区域三次以进行消毒。
   3. 用剪刀做一个约1厘米的小切口，然后在腹部施用肝素（100U）。
   4. 用剪刀将腹部切口从尿道外道上方纵向延伸至剑突下突。
   5. 用无菌棉签露出腹主动脉，并用剪刀横断面以卸下供体的心脏。
   6. 沿前胸壁切开横膈膜，用剪刀用V形切口打开胸壁。抬高头部旁边的前胸壁，并用别针固定。
   7. 使用冰泥开始局部冷却心脏。
   8. 用 5-0 丝线粘住下腔静脉。
   9. 用剪刀取出胸腺，随后识别源自心脏的升主动脉和 PA。升主动脉和 PA 分别位于右侧和左侧。
   10. 用 Potts 剪刀横断源自主动脉弓的头臂动脉，以进一步放血。
   11. 将 23 G 针插入下腔静脉，并给予 2-3 mL 冷改性克雷布斯-亨赛丽特心脏停搏溶液。给药后，心脏逐渐停止跳动。同时，确保尽可能多地排出心脏内的血液。
   12. 用 5-0 丝绸结扎下腔静脉，并用 Potts 剪刀将其远端分割到结扎处。
   13. 用剪刀解剖右肺和食道之间的结缔组织后，用5-0丝结扎右肺门，用剪刀将其远端分开到结扎处。
   14. 用 5-0 丝绸结扎右上腔静脉，并用 Potts 剪刀将其远端分开到结扎处。
   15. 将 Potts 剪刀的一个刀片插入横窦，并尽可能远地将升主动脉和 PA 整体 分开。
   16. 用 5-0 丝线缝合左上腔静脉，并用 Potts 剪刀将其远端分开到结扎处，在近端与颧静脉分开。
   17. 用剪刀解剖左肺和食道之间的结缔组织后，用5-0丝线连接左肺门，并用剪刀将其远端分开到结扎处。
   18. 用5-0丝线结扎心脏底部，并用剪刀将其远端分开到结扎处。这种丝绸用于在捐赠者心脏吻合术期间缩回供体的心脏。此时，将供体的心脏从心包腔中取出。
   19. 将供体的心脏放在装满冰泥和冷生理盐水的板上后，使用微型镊子解剖升主动脉和 PA 之间的结缔组织。
   20. 用镊子夹住升主动脉的开口，将升主动脉的 2-3 mL 冷改性 Krebs-Henseleit 心脏停搏溶液灌注到冠状动脉中，直到冠状动脉的红色减弱。
   21. 将供体的心脏储存在冷改性的克雷布斯-亨塞莱特心脏停搏溶液中。
2. 收件人准备
   注意:在采集捐赠者的心脏之前，请完成接受者的准备工作。
   1. 通过腹膜内注射美托咪定（0.15mg / kg），咪达唑仑（2.0mg / kg）和布托酚（2.5mg / kg） 麻醉 受体大鼠。使用16 G静脉导管气管插管后，通过七氟烷吸入维持麻醉（诱导率为5.0%， 维持 率为2.5%，O₂ 流速为0.3 L/min）。
   2. 将大鼠仰卧在铺在手术板上的加热垫上，并使用松紧带固定四肢。用电动剃须刀和脱毛膏尽可能多地去除皮毛。此外，用碘和70%酒精擦洗膏清洁手术部位三次以进行消毒。
   3. 用剪刀在剑突外尿道上方约6-7厘米处做一个中线腹部切口。
   4. 用无菌棉签将小肠向接受者的右上方缩回，并用浸有温热生理盐水的纱布包裹。
   5. 用剪刀解剖小肠和结肠之间的结缔组织。
   6. 用剪刀解剖结肠的无血管区域，并用两条条状纱布片用胶带将结肠向左缩回。
   7. 用无菌棉签暴露腹主动脉和下腔静脉。用9-0尼龙连接两个容器的相对较大的分支，并分开。
3. 异位心脏移植
   1. 在开始供体心脏移植之前，将肝素施用于受体的腹部（100 U）。
   2. 用侧咬 钳钳整体 夹住腹主动脉和下腔静脉。
   3. 用 90° 弯曲的 23 G 针刺穿腹主动脉，并用 Potts 剪刀纵向延伸孔至至少供体升主动脉的直径。随后，用肝素化生理盐水 （10 U/mL） 冲洗管腔以去除凝块。
   4. 将灭菌的小板放在受者的腹主动脉和下腔静脉的右侧。将供体的心脏放在装满冰泥和冷生理盐水的板上，应每5分钟补充一次。
   5. 在 12 点钟和 6 点钟位置用两条 9-0 尼龙保持缝合线将供体的升主动脉绑在接受者的腹主动脉上。
   6. 顺时针旋转操作板 90°。
   7. 使用从尾部到颅骨方向的9-0尼龙缝合线对受者腹主动脉的左侧和供体的上升主动脉进行吻合，并在12点钟位置用9-0尼龙保持缝合线（总共7至8条缝合线）进行吻合。
   8. 将操作板逆时针旋转 180°。将供体的心脏转移到受者的腹主动脉和下腔静脉的左侧。使用结扎供体心脏底部时使用的5-0丝线（步骤1.1.18）很容易将供体的心脏向左侧缩回。
   9. 使用从颅骨到尾部方向的9-0尼龙缝合线吻合受者腹主动脉的右侧和供体的升主动脉，并在6点钟位置用9-0尼龙保持缝合线绑扎（共7至8条缝合线）。
   10. 使用90°弯曲的23 G针刺穿下腔静脉，远端与供体升主动脉和受体腹主动脉之间的吻合口，并用Potts剪刀纵向延伸孔至大于供体PA的直径。随后，用肝素化的生理盐水冲洗管腔以消除凝块。
   11. 在6点钟位置使用9-0尼龙保持缝合线将供体的PA绑在接受者的下腔静脉上。
   12. 吻合受者下腔静脉和供体PA的左侧，从尾部到颅方向（总共7至8条缝合线）的9-0尼龙缝合线。
   13. 在 12 点钟位置用 9-0 尼龙保持缝合线将供体的 PA 绑在接受者的下腔静脉上。此外，将此保持缝合线绑在供体的PA和受体的下腔静脉之间的吻合口左侧的9-0尼龙上。
   14. 使用从颅骨到尾部方向的9-0尼龙缝合线对接受者的下腔静脉和供体的PA的右侧进行吻合，并与6点钟的保持缝合线（共10-12条缝合线）进行吻合。
   15. 在吻合口上涂抹止血剂，并在吻合口周围放置纱布。
   16. 松开侧咬钳钳后，用无菌棉签轻轻压缩吻合口，以促进止血。随后，将温热的生理盐水涂抹在捐赠者的心脏上以提供温暖。供体的心脏在几十秒内开始颤动，几分钟后恢复到窦性心律。
   17. 使用无菌棉签将小肠放回接受者的腹部。应注意防止压迫供体的心脏或扭曲小肠。
   18. 使用运行 4-0 丝线缝合腹壁。将阿替美唑（0.75mg / kg）施用到腹部后，用4-0丝线缝合皮肤。
   19. 停止吸入麻醉，并在切口下注射1mL 1%利多卡因。此外，皮下注射 2 mL 温热生理盐水以补偿失血。
   20. 使用发光二极管灯加热受体大鼠。受体大鼠恢复意识，并且可以在停止吸入麻醉后约30-40分钟拔管。

2. 异位腹心移植大鼠AR模型

注意:使用7-9周龄的雄性Jcl:Wistar大鼠生成了使用异位腹心移植的新型AR模型。使用6.7倍至45倍放大倍率的显微镜来执行该程序。手术器械被高压灭菌以进行灭菌。

1. 供体心脏收获
   注意:需要修改的培养皿，中间有一个孔，钳子和刚性导丝来创建新的AR模型（图1）。
   1. 如上所述，使用与大鼠正常移植类似的程序收获供体的心脏，除了有关升主动脉和PA横断的步骤（1.1.1-1.1.14，1.1.16-1.1.17）
   2. 在横断升主动脉和 PA 之前，使用 Potts 剪刀去除两条血管前部的脂肪组织。随后，使用镊子解剖两个血管之间的结缔组织。
   3. 将波茨剪刀的一个刀片插入横窦。将 Potts 剪刀拉向操作员，然后将刀片插入升主动脉和 PA 之间。随后，仅横断PA（图2A），然后使用Potts剪刀将主动脉远端横断至头臂动脉（图2B）。
   4. 使用5-0丝缝线结扎心脏底部并用剪刀将其远端分开结扎后，解剖升主动脉和PA之间的结缔组织，并使用与正常移植类似的程序将冷改性的Krebs-Henseleit心脏停搏溶液灌注到冠状动脉中（步骤1.1.18-1.1.20）。
   5. 用钳子固定捐赠者的心脏（图2C）。随后，用中心有一个孔的改良培养皿覆盖供体的心脏，并用血管夹固定升主动脉。
   6. 将坚硬的导丝插入头臂动脉（图2D）。即使在遇到阻力后，也要进一步推动导丝，如果确认阻力丧失，则刺穿主动脉瓣。如果要创建严重的AR模型，请执行多次穿刺。
   7. 将主动脉近端横断头臂，以去除用血管夹夹的部分（图2E）。随后，使用类似于正常移植的程序将供体的心脏储存在冷改性的克雷布斯-亨塞莱特心脏停搏溶液中（步骤1.1.21）。
2. 收件人准备
   注意:在采集捐赠者的心脏之前，请完成接受者的准备工作。
   1. 如上所述，受者准备程序与正常移植程序相似（步骤1.2.1-1.2.7）。
3. 异位心脏移植
   1. 如上所述，供体的心脏移植程序与正常移植相似（步骤1.3.1-1.3.20）。

结果

关于正常模型，解钳后成功建立了良好的左心室收缩。移植心脏的缺血时间和受者的麻醉时间分别约为60分钟和130分钟（表1）。

在新的AR模型中解钳后也获得了良好的左心室收缩。AR模型中移植心脏的缺血时间和受体的麻醉时间比正常模型的时间长约5分钟和10分钟（表2）。AR模型显示的左心室尺寸明显大于正常模型，左心室壁更薄（表3）...

讨论

发现了防止供体心脏在植入过程中变硬的关键步骤。首先，在收获之前横断供体的腹主动脉以卸载供体的心脏至关重要^4，7.如果供体的外科手术在没有气管插管的情况下进行，则开胸术后呼吸停止，这会阻碍供体的肺循环。因此，供体的心脏超负荷，阻止供体心脏在解夹后良好收缩。其次，用心脏停搏液灌注供体的冠状动脉至关重要⁸?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antisedan (atipamezole)	Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.
Domitor (medetomidine)	Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.
Dormicum (midazolam)	Maruishi Pharmaceutical Co., Ltd.
heparin	AY Pharmaceuticals Co.,Ltd.
Jcl:Wistar rats	CLEA Japan, Inc.
microscope	Orinpas Co., Ltd.	SZ61
modified Krebs-Henseleit cardioplegic solution	Merck KGaA
sevoflurane	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation
SURGICEL FIBRILLAR	Johnson & Johnson K.K.
Vetorphale (butorphanol)	Meiji Animal Health Co., Ltd.