Trapianto di cuore addominale eterotopico modificato e un nuovo modello di rigurgito aortico nei ratti

Riepilogo

Questo studio dimostra una tecnica di trapianto di cuore addominale eterotopico riproducibile nei ratti che i principianti possono imparare ed eseguire. Inoltre, un nuovo modello di rigurgito aortico nei ratti viene generato eseguendo un trapianto di cuore addominale eterotopico e danneggiando la valvola aortica del donatore utilizzando un filo guida dopo la raccolta.

Abstract

Negli ultimi 50 anni, molti ricercatori hanno riportato trapianti di cuore addominale eterotopico in topi e ratti, con alcune variazioni nella tecnica chirurgica. Modificare la procedura di trapianto per rafforzare la protezione miocardica potrebbe prolungare il tempo di ischemia preservando la funzione cardiaca del donatore. I punti chiave di questa tecnica sono i seguenti: transettare l'aorta addominale del donatore prima della raccolta per scaricare il cuore del donatore; perfondere le arterie coronarie del donatore con una soluzione cardioplegica fredda; e raffreddamento topico del cuore del donatore durante la procedura di anastomosi. Di conseguenza, poiché questa procedura prolunga il tempo di ischemia accettabile, i principianti possono facilmente eseguirlo e ottenere un alto tasso di successo.

Inoltre, un nuovo modello di rigurgito aortico (AR) è stato stabilito in questo lavoro utilizzando una tecnica diversa da quella esistente, che viene creata inserendo un catetere dall'arteria carotide destra e perforando la valvola aortica nativa sotto guida ecocardiografica continua. Un trapianto di cuore addominale eterotopico è stato eseguito utilizzando il nuovo modello AR. Nel protocollo, dopo che il cuore del donatore è stato raccolto, un filo guida rigido viene inserito nell'arteria brachiocefalica del donatore e avanzato verso la radice aortica. La valvola aortica viene perforata spingendo ulteriormente il filo guida anche dopo che la resistenza è stata avvertita, inducendo così AR. È più facile danneggiare la valvola aortica usando questo metodo che con la procedura descritta nel modello AR convenzionale. Inoltre, questo nuovo modello AR non contribuisce alla circolazione del destinatario; pertanto, questo metodo dovrebbe produrre un modello AR più severo rispetto alla procedura convenzionale.

Introduzione

Il trapianto di cuore addominale eterotopico nei ratti è stato riportato per la prima volta nel 1964 da Abbott et ^al.1 ed è stato utilizzato per studiare il rigetto acuto e cronico dell'allotrapianto, la vasculopatia cardiaca allogenica, il danno da ischemia-riperfusione e il rimodellamento cardiaco 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Alcune modifiche sono state aggiunte alla procedura negli ultimi 50 anni. I fondamenti della procedura attuale sono i seguenti. L'aorta ascendente e l'arteria polmonare (PA) del donatore sono anastomosi da un lato terminale all'aorta addominale del ricevente e alla vena cava inferiore, rispettivamente. Sebbene l'atrio sinistro e il ventricolo del donatore non ricevano alcun flusso intracavitario, il sangue scorre al sistema coronarico del donatore; Pertanto, il cuore del donatore riprende a battere dopo il de-serraggio.

Alcuni esperti con esperienza in centinaia o migliaia di operazioni hanno riportato un alto tasso di successo con breve tempo di ischemia per il trapianto di cuore addominale eterotopico 2,3,4,5; Tuttavia, è difficile per i principianti raggiungere il breve tempo di ischemia fin dall'inizio. Una sufficiente cardioprotezione è un fattore importante per ottenere una buona contrazione cardiaca del cuore del donatore. Una protezione miocardica insufficiente può irrigidire il cuore del donatore. Pertanto, abbiamo modificato la procedura di trapianto per rafforzare la protezione del cuore del donatore. Uno degli obiettivi di questo studio è dimostrare una procedura di trapianto di cuore addominale eterotopico riproducibile che i principianti possono facilmente eseguire poiché prolunga il tempo di ischemia accettabile.

Inoltre, alcuni ricercatori hanno riportato un modello di rigurgito aortico (AR) nei ratti, che è stato utilizzato per esaminare gli effetti degli agenti sul rimodellamento ventricolare sinistro (LV)^12,13,14,15. La procedura convenzionale include quanto segue: (1) viene praticata un'incisione laterale destra del collo per esporre l'arteria carotide destra dopo l'anestesia; (2) un catetere viene incannulato da questo vaso e avanzato verso la radice aortica; e (3) l'AR è indotta perforando la valvola aortica nativa sotto guida ecocardiografica continua.

Tuttavia, perforare la valvola aortica mentre si tiene la sonda ecocardiografica e ottenere una buona visione dell'aorta ascendente, della valvola aortica e del catetere con un ecocardiogramma è impegnativo. Inoltre, l'insufficienza cardiaca dopo AR acuta è un'altra complicazione. Pertanto, un nuovo modello AR, che può essere facilmente creato e non contribuisce alla circolazione del destinatario, è stato stabilito in questo lavoro per risolvere queste sfide. L'altro scopo di questo studio è quello di creare un modello AR utilizzando il trapianto di cuore addominale eterotopico e danneggiando la valvola aortica del donatore utilizzando un filo guida dopo la raccolta.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state condotte in conformità con "An Outline of the Act on Welfare and Management of Animals" e "Standards Relating to the Care and Keeping and Reducing Pain of Laboratory Animals" del Ministero dell'Ambiente, del Governo del Giappone e le "Linee guida per la corretta condotta della sperimentazione animale" del Consiglio scientifico del Giappone^{16, 17,18}. I protocolli sugli animali sono stati esaminati e approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università di Tokyo (M-P19-065).

1. Trapianto di cuore addominale eterotopico nei ratti

NOTA: I trapianti di cuore addominale eterotopico sono stati condotti in ratti Jcl:Wistar maschi di età compresa tra 7 e 9 settimane. Per eseguire la procedura è stato utilizzato un microscopio con ingrandimento da 6,7x a 45x. Gli strumenti chirurgici sono stati sterilizzati in autoclave per la sterilizzazione.

1. Prelievo di cuore del donatore
   1. Anestetizzare il ratto donatore tramite un'iniezione intraperitoneale di medetomidina (0,15 mg/kg), midazolam (2,0 mg/kg) e butorfanolo (2,5 mg/kg).
   2. Posizionare il topo in posizione supina su una piastra riscaldante sopra la scheda operatoria e fissare gli arti usando elastici. Rimuovere quanta più pelliccia possibile con un rasoio elettrico e crema depilatoria. Successivamente, pulire l'area operativa con iodio e uno scrub alcolico al 70% tre volte per la disinfezione.
   3. Fare una piccola incisione di circa 1 cm con le forbici, seguita dalla somministrazione di eparina all'addome (100 U).
   4. Estendere l'incisione addominale longitudinalmente da sopra il meato uretrale esterno al processo subxifoideo con le forbici.
   5. Esporre l'aorta addominale con tamponi di cotone sterilizzati e transetto con le forbici per scaricare il cuore del donatore.
   6. Incidi il diaframma lungo la parete toracica anteriore e apri la parete toracica con un'incisione a forma di V usando le forbici. Sollevare la parete toracica anteriore accanto alla testa e fissarla con perni.
   7. Avviare il raffreddamento topico del cuore utilizzando ghiaccio slushed.
   8. Fissare la vena cava inferiore con una sutura di seta 5-0.
   9. Rimuovere il timo con le forbici e successivamente identificare l'aorta ascendente e la PA provenienti dal cuore. L'aorta ascendente e PA sono rispettivamente a destra e a sinistra.
   10. Transetto l'arteria brachiocefalica proveniente dall'arco aortico con forbici Potts per ulteriore dissanguamento.
   11. Inserire un ago da 23 G nella vena cava inferiore e somministrare 2-3 ml di soluzione cardioplegica di Krebs-Henseleit modificata a freddo. Dopo la somministrazione, il cuore smette gradualmente di battere. Allo stesso tempo, assicurarsi che il sangue all'interno del cuore sia drenato il più possibile.
   12. Legare la vena cava inferiore con seta 5-0 e dividerla distalmente alla legatura usando le forbici Potts.
   13. Dopo aver sezionato il tessuto connettivo tra il polmone destro e l'esofago con le forbici, legare l'ilo del polmone destro con seta 5-0 e dividerlo distalmente alla legatura con le forbici.
   14. Ligare la vena cava superiore destra con seta 5-0 e dividerla distalmente alla legatura con le forbici Potts.
   15. Inserire una lama delle forbici Potts nel seno trasverso e dividere l'aorta ascendente e il PA in blocco nel modo più distale possibile.
   16. Legare la vena cava superiore sinistra con una sutura di seta 5-0 e dividerla distalmente alla legatura e prossimalmente alla vena azygos con le forbici Potts.
   17. Dopo aver sezionato il tessuto connettivo tra il polmone sinistro e l'esofago con le forbici, legare l'ilo del polmone sinistro con una sutura di seta 5-0 e dividerlo distalmente alla legatura con le forbici.
   18. Ligare la base del cuore con una sutura di seta 5-0 e dividerla distalmente alla legatura con le forbici. Questa seta viene utilizzata per ritrarre il cuore del donatore durante l'anastomosi del cuore del donatore. In questo momento, rimuovere il cuore del donatore dalla cavità pericardica.
   19. Dopo aver posizionato il cuore del donatore sulla piastra piena di ghiaccio e soluzione salina normale fredda, sezionare il tessuto connettivo tra l'aorta ascendente e il PA usando micro pinzette.
   20. Perfondere 2-3 ml di soluzione cardioplegica di Krebs-Henseleit modificata a freddo dall'aorta ascendente nelle arterie coronarie bloccando l'ostio dell'aorta ascendente con una pinzetta fino a quando il colore rosso delle arterie coronarie è diminuito.
   21. Conservare il cuore del donatore in una soluzione cardioplegica di Krebs-Henseleit modificata a freddo.
2. Preparazione del destinatario
   NOTA: Prima di raccogliere il cuore del donatore, completare la preparazione del ricevente.
   1. Anestetizzare il ratto ricevente tramite un'iniezione intraperitoneale di medetomidina (0,15 mg/kg), midazolam (2,0 mg/kg) e butorfanolo (2,5 mg/kg). Dopo l'intubazione endotracheale con catetere endovenoso da 16 G, mantenere l'anestesia tramite inalazione di sevoflurano (induzione al 5,0% e mantenimento al 2,5% con una portata di O₂ di 0,3 L/min).
   2. Posizionare il topo in posizione supina su una piastra elettrica posata sopra la scheda operatoria e fissare gli arti usando elastici. Rimuovere quanta più pelliccia possibile con un rasoio elettrico e crema depilatoria. Inoltre, pulire il sito chirurgico con iodio e uno scrub alcolico al 70% tre volte per la disinfezione.
   3. Usando le forbici, praticare un'incisione addominale mediana di circa 6-7 cm sopra il meato uretrale esterno al processo subxifoideo.
   4. Ritrarre l'intestino tenue verso il lato superiore destro del destinatario con tamponi di cotone sterilizzati e avvolgerlo con una garza imbevuta di soluzione salina normale calda.
   5. Sezionare il tessuto connettivo tra l'intestino tenue e il colon con le forbici.
   6. Sezionare l'area avascolare del colon con le forbici e nastro adesivo con due pezzi di garza simili a strisce per ritrarre il colon a sinistra.
   7. Esporre l'aorta addominale e la vena cava inferiore con tamponi di cotone sterilizzati. Legare i rami relativamente grandi di entrambe le navi con 9-0 nylon e dividere.
3. Trapianto di cuore eterotopico
   1. Somministrare l'eparina all'addome del ricevente (100 U) prima di iniziare il trapianto di cuore del donatore.
   2. Morseggiare l'aorta addominale e la vena cava inferiore in blocco con una pinza a morsetto laterale.
   3. Forare l'aorta addominale con un ago piegato di 90° da 23 G ed estendere il foro longitudinalmente con le forbici Potts almeno fino al diametro dell'aorta ascendente del donatore. Successivamente, lavare il lume con soluzione salina normale eparinizzata (10 U / ml) per rimuovere i coaguli.
   4. Posizionare la piccola piastra sterilizzata sul lato destro dell'aorta addominale del ricevente e della vena cava inferiore. Posizionare il cuore del donatore sulla piastra piena di ghiaccio slushed e soluzione salina normale fredda, che deve essere reintegrata ogni 5 minuti.
   5. Legare l'aorta ascendente del donatore all'aorta addominale del ricevente con due suture di sospensione in nylon 9-0 a ore 12 e ore 6.
   6. Ruotare la scheda operativa in senso orario di 90°.
   7. Anastomosi il lato sinistro dell'aorta addominale del ricevente e l'aorta ascendente del donatore usando una sutura di nylon 9-0 dalla direzione caudale a quella cranica e legare con una sutura di nylon 9-0 a ore 12 (totale da sette a otto suture).
   8. Ruotare la scheda operativa in senso antiorario di 180°. Traslocare il cuore del donatore a sinistra dell'aorta addominale del ricevente e della vena cava inferiore. È facile ritrarre il cuore del donatore verso il lato sinistro con la sutura di seta 5-0 che è stata utilizzata per legare la base del cuore del donatore (passo 1.1.18).
   9. Anastomosi il lato destro dell'aorta addominale del ricevente e l'aorta ascendente del donatore usando una sutura di nylon 9-0 dalla direzione cranica a quella caudale e legare con una sutura di nylon 9-0 a ore 6 (totale da sette a otto suture).
   10. Forare la vena cava inferiore usando un ago piegato a 90° da 23 G distalmente fino all'anastomosi tra l'aorta ascendente del donatore e l'aorta addominale del ricevente ed estendere il foro longitudinalmente con le forbici Potts a più del diametro del PA del donatore. Successivamente, lavare il lume con soluzione salina normale eparinizzata per eliminare i coaguli.
   11. Legare il PA del donatore alla vena cava inferiore del ricevente usando una sutura di nylon 9-0 a ore 6.
   12. Anastomosi il lato sinistro della vena cava inferiore del ricevente e il PA del donatore con una sutura di nylon 9-0 dalla direzione caudale a quella cranica (totale da sette a otto suture).
   13. Legare il PA del donatore alla vena cava inferiore del ricevente con una sutura di sospensione in nylon 9-0 a ore 12. Inoltre, legare questa sutura di sospensione al nylon 9-0 sul lato sinistro dell'anastomosi tra il PA del donatore e la vena cava inferiore del ricevente.
   14. Anastomosi il lato destro della vena cava inferiore del ricevente e il PA del donatore usando una sutura di nylon 9-0 dalla direzione cranica a quella caudale e legare con la sutura di soggiorno a ore 6 (totale di 10-12 suture).
   15. Applicare agenti emostatici su entrambe le anastomosi e posizionare una garza intorno a loro.
   16. Dopo aver rilasciato la pinza a morsetto laterale, comprimere delicatamente le anastomosi con tamponi di cotone sterilizzati per facilitare l'emostasi. Successivamente, applicare soluzione salina normale calda sul cuore del donatore per fornire calore. Il cuore del donatore inizia a fibrillare in poche decine di secondi e recupera al ritmo sinusale dopo pochi minuti.
   17. Restituire l'intestino tenue all'addome del destinatario utilizzando tamponi di cotone sterilizzati. Bisogna fare attenzione per evitare di comprimere il cuore del donatore o torcere l'intestino tenue.
   18. Chiudere la parete addominale usando una sutura di seta 4-0 in esecuzione. Dopo aver somministrato atipamezolo (0,75 mg/kg) nell'addome, chiudere la pelle con una sutura di seta 4-0.
   19. Interrompere l'anestesia per inalazione e iniettare 1 ml di lidocaina all'1% sotto l'incisione. Inoltre, iniettare 2 ml di soluzione salina normale calda per via sottocutanea per compensare la perdita di sangue.
   20. Riscaldare il ratto ricevente usando una lampada a diodi emettitori di luce. Il ratto ricevente riprende conoscenza e può essere estubato a circa 30-40 minuti dopo l'interruzione dell'anestesia per inalazione.

2. Nuovo modello AR che utilizza il trapianto di cuore addominale eterotopico nei ratti

NOTA: Un nuovo modello AR utilizzando il trapianto di cuore addominale eterotopico è stato generato utilizzando ratti Jcl: Wistar maschi di età compresa tra 7 e 9 settimane. Per eseguire la procedura è stato utilizzato un microscopio con ingrandimento da 6,7x a 45x. Gli strumenti chirurgici sono stati sterilizzati in autoclave per la sterilizzazione.

1. Prelievo di cuore del donatore
   NOTA: per creare il nuovo modello AR sono necessari una piastra di Petri modificata con un foro al centro, una pinza e un filo guida rigido (Figura 1).
   1. Come descritto sopra, prelevare il cuore del donatore utilizzando una procedura simile al normale trapianto nei ratti, ad eccezione delle fasi riguardanti l'aorta ascendente e la transezione PA (1.1.1-1.1.14, 1.1.16-1.1.17)
   2. Prima di transettare l'aorta ascendente e la PA, rimuovere il tessuto adiposo sulla parte anteriore di entrambi i vasi usando le forbici Potts. Successivamente, sezionare il tessuto connettivo tra i due vasi usando una pinzetta.
   3. Inserire una lama delle forbici Potts nel seno trasversale. Tirare le forbici Potts verso l'operatore e inserire la lama tra l'aorta ascendente e il PA. Successivamente, transettare solo il PA (Figura 2A), seguito dal transetto dell'aorta distalmente all'arteria brachiocefalica usando le forbici Potts (Figura 2B).
   4. Dopo aver legato la base del cuore usando una sutura di seta 5-0 e dividendola distalmente alla legatura con le forbici, sezionare il tessuto connettivo tra l'aorta ascendente e la PA e perfondere la soluzione cardioplegica di Krebs-Henseleit modificata a freddo nelle arterie coronarie usando una procedura simile al normale trapianto (passaggi 1.1.18-1.1.20).
   5. Fissare il cuore del donatore con una pinza (Figura 2C). Successivamente, coprire il cuore del donatore con una capsula di Petri modificata con un foro al centro e immobilizzare l'aorta ascendente con una clip vascolare.
   6. Inserire un filo guida rigido nell'arteria brachiocefalica (Figura 2D). Spingere ulteriormente il filo guida anche dopo aver raggiunto la resistenza e perforare la valvola aortica se viene confermata una perdita di resistenza. Esegui più forature se deve essere creato un modello AR grave.
   7. Transettare l'aorta prossimalmente all'arteria brachiocefalica per rimuovere la porzione bloccata con la clip vascolare (Figura 2E). Successivamente, conservare il cuore del donatore in soluzione cardioplegica di Krebs-Henseleit modificata a freddo utilizzando una procedura simile al normale trapianto (fase 1.1.21).
2. Preparazione del destinatario
   NOTA: Prima di raccogliere il cuore del donatore, completare la preparazione del ricevente.
   1. Come descritto sopra, la procedura di preparazione del ricevente è simile a quella del trapianto normale (fasi 1.2.1-1.2.7).
3. Trapianto di cuore eterotopico
   1. Come descritto sopra, la procedura di trapianto di cuore del donatore è simile al normale trapianto (fasi 1.3.1-1.3.20).

Risultati

Per quanto riguarda il modello normale, una buona contrazione LV è stata stabilita con successo dopo il de-serraggio. Il tempo di ischemia del cuore trapiantato e il tempo di anestesia del ricevente erano rispettivamente di circa 60 minuti e 130 minuti (Tabella 1).

Una buona contrazione LV è stata ottenuta anche dopo il de-serraggio nel nuovo modello AR. Il tempo ischemico del cuore trapiantato e il tempo di anestesia del ricevente nel modello AR sono stati circa 5 minuti e ...

Discussione

Sono stati scoperti passaggi chiave per evitare che il cuore del donatore si irrigidisca durante l'impianto. In primo luogo, è fondamentale transettare l'aorta addominale del donatore prima della raccolta per scaricare il cuore del donatore ^4,7. Se la procedura chirurgica del donatore viene eseguita senza intubazione endotracheale, la respirazione cessa dopo la toracotomia, che ostruisce la circolazione polmonare del donatore. Di conseguenza, il cuore del donato...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antisedan (atipamezole)	Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.
Domitor (medetomidine)	Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.
Dormicum (midazolam)	Maruishi Pharmaceutical Co., Ltd.
heparin	AY Pharmaceuticals Co.,Ltd.
Jcl:Wistar rats	CLEA Japan, Inc.
microscope	Orinpas Co., Ltd.	SZ61
modified Krebs-Henseleit cardioplegic solution	Merck KGaA
sevoflurane	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation
SURGICEL FIBRILLAR	Johnson & Johnson K.K.
Vetorphale (butorphanol)	Meiji Animal Health Co., Ltd.