Transplante Cardíaco Heterotópico Abdominal Modificado e um Novo Modelo de Regurgitação Aórtica em Ratos

Resumo

Este estudo demonstra uma técnica reprodutível de transplante cardíaco abdominal heterotópico em ratos que iniciantes podem aprender e executar. Além disso, um novo modelo de regurgitação aórtica em ratos é gerado pela realização de transplante cardíaco abdominal heterotópico e lesão da valva aórtica do doador usando fio-guia após a coleta.

Resumo

Nos últimos 50 anos, muitos pesquisadores relataram transplante cardíaco abdominal heterotópico em camundongos e ratos, com algumas variações na técnica cirúrgica. A modificação do procedimento de transplante para fortalecer a proteção miocárdica poderia prolongar o tempo de isquemia, preservando a função cardíaca do doador. Os pontos-chave dessa técnica são: transeccionar a aorta abdominal do doador antes da coleta para descarregar o coração do doador; perfundir as artérias coronárias do doador com uma solução cardioplégica fria; e resfriamento tópico do coração do doador durante o procedimento de anastomose. Consequentemente, como este procedimento prolonga o tempo de isquemia aceitável, os iniciantes podem facilmente realizá-lo e alcançar uma alta taxa de sucesso.

Além disso, um novo modelo de regurgitação aórtica (IAp) foi estabelecido neste trabalho utilizando uma técnica diferente da existente, que é criada pela inserção de um cateter da artéria carótida direita e punção da valva aórtica nativa sob orientação ecocardiográfica contínua. Um transplante cardíaco abdominal heterotópico foi realizado usando o novo modelo de RA. No protocolo, após a retirada do coração do doador, um fio-guia rígido é inserido na artéria braquiocefálica do doador e avançado em direção à raiz da aorta. A valva aórtica é puncionada empurrando-se ainda mais o fio-guia mesmo após a resistência ser sentida, induzindo assim o RA. É mais fácil lesar a valva aórtica com esse método do que com o procedimento descrito no modelo convencional de RA. Além disso, esse novo modelo de RA não contribui para a circulação do receptor; portanto, espera-se que esse método produza um modelo de RA mais severo do que o procedimento convencional.

Introdução

O transplante cardíaco abdominal heterotópico em ratos foi relatado pela primeira vez em 1964 por Abbott e ^cols.1 e tem sido usado para estudar a rejeição aguda e crônica do enxerto, a vasculopatia do enxerto cardíaco, a lesão de isquemia-reperfusão e o remodelamento^{cardíaco2,3,4,5,6,7,8,9,10,11} . Algumas modificações foram adicionadas ao procedimento nos últimos 50 anos. Os fundamentos do procedimento atual são os seguintes. A aorta ascendente e a artéria pulmonar (AP) do doador são anastomosadas término-lateralmente à aorta abdominal e à veia cava inferior do receptor, respectivamente. Embora o átrio e o ventrículo esquerdos do doador não recebam fluxo intracavitário, o sangue flui para o sistema coronariano do doador; portanto, o coração do doador volta a bater após o despinçamento.

Alguns especialistas com experiência em centenas ou milhares de operações têm relatado alta taxa de sucesso com curto tempo de isquemia para transplante cardíaco abdominal heterotópico 2,3,4,5; no entanto, é difícil para iniciantes alcançar o curto tempo de isquemia desde o início. A cardioproteção suficiente é um fator importante para a obtenção de uma boa contração cardíaca do coração do doador. A proteção miocárdica insuficiente pode enrijecer o coração do doador. Portanto, modificamos o procedimento de transplante para fortalecer a proteção do coração do doador. Um dos objetivos deste estudo é demonstrar um procedimento de transplante cardíaco abdominal heterotópico reprodutível que os iniciantes podem ser facilmente realizados, uma vez que prolonga o tempo de isquemia aceitável.

Além disso, alguns pesquisadores relataram um modelo de regurgitação aórtica (RA) em ratos, que tem sido utilizado para examinar os efeitos de agentes no remodelamento do ventrículo esquerdo (VE)^12,13,14,15. O procedimento convencional inclui: (1) uma incisão cervical lateral direita é feita para expor a artéria carótida direita após a anestesia; (2) um cateter é canulado desse vaso e avançado em direção à raiz da aorta; e (3) a RA é induzida pela punção da valva aórtica nativa sob orientação ecocardiográfica contínua.

No entanto, puncionar a valva aórtica com a sonda ecocardiográfica e obter uma boa visão da aorta ascendente, da valva aórtica e do cateter com um ecocardiograma é um desafio. Além disso, a insuficiência cardíaca após RA aguda é outra complicação. Portanto, um novo modelo de RA, que pode ser facilmente criado e não contribui para a circulação do receptor, foi estabelecido neste trabalho para resolver esses desafios. O outro objetivo deste estudo é criar um modelo de RA utilizando transplante cardíaco abdominal heterotópico e lesando a valva aórtica do doador com fio-guia após a coleta.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram conduzidos de acordo com "An Outline of the Act on Welfare and Management of Animals" e "Standards Related to the Care and Keeping and Reducing Pain of Laboratory Animals" pelo Ministério do Meio Ambiente, Governo do Japão e as "Diretrizes para Conduta Adequada de Experimentação Animal" pelo Conselho Científico do Japão^{16, 17,18}. Os protocolos com animais foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Tóquio (M-P19-065).

1. Transplante cardíaco abdominal heterotópico em ratos

NOTA: Transplantes cardíacos abdominais heterotópicos foram realizados em ratos Jcl:Wistar machos com idade entre 7-9 semanas de idade. Um microscópio com aumento de 6,7x a 45x foi utilizado para realizar o procedimento. Os instrumentais cirúrgicos foram autoclavados para esterilização.

1. Colheita do coração do doador
   1. Anestesiar o rato doador através de uma injeção intraperitoneal de medetomidina (0,15 mg/kg), midazolam (2,0 mg/kg) e butorfanol (2,5 mg/kg).
   2. Coloque o rato em decúbito dorsal em uma almofada de aquecimento sobre a prancha operatória e fixe os membros usando faixas elásticas. Retire o máximo de pelos possível com um barbeador elétrico e creme depilatório. Em seguida, limpar a área cirúrgica com iodo e uma esfoliação com álcool a 70% três vezes para desinfecção.
   3. Fazer uma pequena incisão de aproximadamente 1 cm com tesoura, seguida da administração de heparina no abdome (100 U).
   4. Estender a incisão abdominal longitudinalmente de cima do meato uretral externo até o processo subxifóide com tesoura.
   5. Expor a aorta abdominal com cotonetes esterilizados e transeccionar com tesoura para descarregar o coração do doador.
   6. Incisar o diafragma ao longo da parede torácica anterior e abrir a parede torácica com uma incisão em forma de V com tesoura. Eleve a parede torácica anterior ao lado da cabeça e fixe-a com pinos.
   7. Inicie o resfriamento tópico do coração usando gelo derramado.
   8. Colocar fita adesiva na veia cava inferior com fio de seda 5-0.
   9. Retirar o timo com tesoura e, posteriormente, identificar a aorta ascendente e a AP originárias do coração. A aorta ascendente e a AP estão à direita e à esquerda, respectivamente.
   10. Transeccionar a artéria braquiocefálica originada do arco aórtico com tesoura de Potts para exsanguinação adicional.
   11. Inserir uma agulha 23 G na veia cava inferior e administrar 2-3 mL de solução cardioplégica Krebs-Henseleit modificada a frio. Após a administração, o coração gradualmente para de bater. Simultaneamente, certifique-se de que o sangue dentro do coração é drenado tanto quanto possível.
   12. Ligate a veia cava inferior com seda 5-0 e divida-a distalmente à ligadura com tesoura de Potts.
   13. Após dissecar o tecido conjuntivo entre o pulmão direito e o esôfago com tesoura, ligar o hilo do pulmão direito com seda 5-0 e dividi-lo distalmente à ligadura com tesoura.
   14. Ligate a veia cava superior direita com seda 5-0 e divida distalmente à ligadura com tesoura de Potts.
   15. Inserir uma lâmina da tesoura de Potts no seio transverso e dividir a aorta ascendente e o AP em bloco o mais distalmente possível.
   16. Amarrar a veia cava superior esquerda com fio de seda 5-0 e dividi-la distalmente à ligadura e proximalmente à veia ázigos com tesoura de Potts.
   17. Após dissecar o tecido conjuntivo entre o pulmão esquerdo e o esôfago com tesoura, ligadura do hilo do pulmão esquerdo com fio de seda 5-0 e dividi-lo distalmente à ligadura com tesoura.
   18. Ligate a base do coração com uma sutura de seda 5-0 e divida distalmente à ligadura com tesoura. Esta seda é usada para retrair o coração do doador durante a anastomose do coração do doador. Neste momento, remova o coração do doador da cavidade pericárdica.
   19. Após a colocação do coração do doador sobre a placa preenchida com gelo viscoso e soro fisiológico gelado, dissecar o tecido conjuntivo entre a aorta ascendente e a AP com micropinças.
   20. Perfundir 2-3 mL de solução cardioplégica de Krebs-Henseleit modificada a frio da aorta ascendente para as artérias coronárias pinçando o óstio da aorta ascendente com uma pinça até que a cor vermelha das artérias coronárias seja diminuída.
   21. Armazenar o coração do doador em uma solução cardioplégica Krebs-Henseleit modificada a frio.
2. Preparação do destinatário
   OBS: Antes de colher o coração do doador, complete o preparo do receptor.
   1. Anestesiar o rato receptor através de uma injeção intraperitoneal de medetomidina (0,15 mg/kg), midazolam (2,0 mg/kg) e butorfanol (2,5 mg/kg). Após a intubação endotraqueal com cateter venoso 16G, manter a anestesia por inalação de sevoflurano (indução a 5,0% e manutenção a 2,5% com fluxo de O₂ de 0,3 L/min).
   2. Coloque o rato em decúbito dorsal sobre uma almofada de aquecimento colocada sobre a prancha operatória e fixe os membros com faixas elásticas. Retire o máximo de pelos possível com um barbeador elétrico e creme depilatório. Além disso, limpar o sítio cirúrgico com iodo e aboração com álcool a 70% três vezes para desinfecção.
   3. Com tesoura, fazer uma incisão abdominal mediana de aproximadamente 6-7 cm acima do meato uretral externo até o processo subxifóide.
   4. Retraia o intestino delgado em direção ao lado superior direito do recipiente com cotonetes esterilizados e envolva-o com gaze embebida com soro fisiológico normal quente.
   5. Disseque o tecido conjuntivo entre o intestino delgado e o cólon com uma tesoura.
   6. Dissecar a área avascular do cólon com tesoura e fita com dois pedaços de gaze em forma de tira para retrair o cólon para a esquerda.
   7. Expor a aorta abdominal e a veia cava inferior com cotonetes esterilizados. Ligate os ramos relativamente grandes de ambos os vasos com nylon 9-0, e dividir.
3. Transplante cardíaco heterotópico
   1. Administrar heparina no abdome do receptor (100 U) antes de iniciar o transplante cardíaco do doador.
   2. Apertar a aorta abdominal e a veia cava inferior em bloco com pinça de pinça de mordida lateral.
   3. Puncionar a aorta abdominal com agulha 23G dobrada a 90° e estender longitudinalmente o orifício com tesoura de Potts até, pelo menos, o diâmetro da aorta ascendente do doador. Em seguida, lavar o lúmen com soro fisiológico heparinizado (10 U/mL) para remover coágulos.
   4. Posicionar a pequena placa esterilizada no lado direito da aorta abdominal e da veia cava inferior do receptor. Coloque o coração do doador na placa cheia de gelo e soro fisiológico gelado, que deve ser reabastecido a cada 5 min.
   5. Amarrar a aorta ascendente do doador à aorta abdominal do receptor com duas suturas de nylon 9-0 nas posições 12 horas e 6 horas.
   6. Gire a placa de operação no sentido horário em 90°.
   7. Anastomosar o lado esquerdo da aorta abdominal do receptor e a aorta ascendente do doador com fio de náilon 9-0 do sentido caudal para o crânio e amarrar com fio de náilon 9-0 às 12 horas (total de sete a oito suturas).
   8. Gire a placa de operação no sentido anti-horário em 180°. Translocar o coração do doador para a esquerda da aorta abdominal e da veia cava inferior do receptor. É fácil retrair o coração do doador para o lado esquerdo com a sutura de seda 5-0 que foi usada na ligadura da base do coração do doador (passo 1.1.18).
   9. Anastomosar o lado direito da aorta abdominal do receptor e a aorta ascendente do doador com fio de náilon 9-0 do sentido cranial para o caudal e amarrar com ponto de permanência de náilon 9-0 na posição das 6 horas (total de sete a oito suturas).
   10. Puncionar a veia cava inferior com agulha 23G dobrada de 90° distalmente à anastomose entre a aorta ascendente do doador e a aorta abdominal do receptor e estender longitudinalmente o orifício com tesoura de Potts até diâmetro maior que o diâmetro do AP do doador. Em seguida, lave o lúmen com soro fisiológico heparinizado para eliminar coágulos.
   11. Amarrar o PA do doador à veia cava inferior do receptor com sutura de náilon 9-0 na posição das 6 horas.
   12. Anastomosar o lado esquerdo da veia cava inferior do receptor e a AP do doador com fio de náilon 9-0 do sentido caudal para o cranial (total de sete a oito suturas).
   13. Amarrar a AP do doador à veia cava inferior do receptor com uma sutura de nylon 9-0 na posição das 12 horas. Além disso, amarrar essa sutura de permanência ao náilon 9-0 do lado esquerdo da anastomose entre a AP do doador e a veia cava inferior do receptor.
   14. Anastomosar o lado direito da veia cava inferior do receptor e da AP do doador com fio de náilon 9-0 do sentido cranial para o caudal e amarrar com a sutura de permanência das 6 horas (total de 10-12 suturas).
   15. Aplicar agentes hemostáticos em ambas as anastomoses e colocar gaze ao redor delas.
   16. Após soltar a pinça de pinça de mordida lateral, comprimir suavemente as anastomoses com cotonetes esterilizados para facilitar a hemostasia. Posteriormente, aplique soro fisiológico quente no coração do doador para fornecer calor. O coração do doador começa a fibrilar em poucas dezenas de segundos e se recupera para o ritmo sinusal após alguns minutos.
   17. Devolva o intestino delgado ao abdômen do receptor usando cotonetes esterilizados. Deve-se tomar cuidado para evitar comprimir o coração do doador ou torcer o intestino delgado.
   18. Fechar a parede abdominal usando uma sutura de seda 4-0. Após a administração de atipamezol (0,75 mg/kg) no abdome, feche a pele com uma sutura de seda 4-0.
   19. Suspender a anestesia inalatória e injetar 1 mL de lidocaína a 1% sob a incisão. Além disso, injetar 2 mL de soro fisiológico normal aquecido por via subcutânea para compensar a perda de sangue.
   20. Aqueça o rato receptor usando uma lâmpada de diodo emissor de luz. O rato receptor recupera a consciência e pode ser extubado aproximadamente 30-40 minutos após a interrupção da anestesia inalatória.

2. Novo modelo de RA utilizando transplante cardíaco abdominal heterotópico em ratos

NOTA: Um novo modelo de RA usando transplante cardíaco abdominal heterotópico foi gerado usando ratos Jcl:Wistar machos com idade entre 7-9 semanas de idade. Um microscópio com aumento de 6,7x a 45x foi utilizado para realizar o procedimento. Os instrumentais cirúrgicos foram autoclavados para esterilização.

1. Colheita do coração do doador
   NOTA: Uma placa de Petri modificada com um orifício no centro, um alicate e um fio-guia rígido são necessários para criar o novo modelo de RA (Figura 1).
   1. Como descrito acima, colher o coração do doador usando um procedimento semelhante ao transplante normal em ratos, exceto para as etapas relativas à aorta ascendente e transecção da AP (1.1.1-1.1.14, 1.1.16-1.1.17)
   2. Antes de transeccionar a aorta ascendente e AP, remova o tecido adiposo na parte anterior de ambos os vasos usando tesoura de Potts. Em seguida, dissecar o tecido conjuntivo entre os dois vasos com uma pinça.
   3. Insira uma lâmina da tesoura de Potts no seio transverso. Puxe a tesoura de Potts em direção ao operador e insira a lâmina entre a aorta ascendente e o AP. Em seguida, transecciona-se apenas o AP (Figura 2A), seguindo-se a transecção distal da aorta para a artéria braquiocefálica com tesoura de Potts (Figura 2B).
   4. Após a ligadura da base do coração com fio de seda 5-0 e sua divisão distal à ligadura com tesoura, dissecar o tecido conjuntivo entre a aorta ascendente e o AP e perfundir solução cardioplégica de Krebs-Henseleit modificada a frio nas artérias coronárias com procedimento semelhante ao transplante normal (passos 1.1.18-1.1.20).
   5. Fixar o coração do doador com um alicate (Figura 2C). Em seguida, cobrir o coração do doador com uma placa de Petri modificada com um orifício no centro e imobilizar a aorta ascendente com um clipe vascular.
   6. Inserir um fio-guia rígido na artéria braquiocefálica (Figura 2D). Empurre ainda mais o fio-guia mesmo depois que a resistência for atendida e perfure a válvula aórtica se uma perda de resistência for confirmada. Realizar múltiplas punções se um modelo de RA grave for criado.
   7. Transeccionar a aorta proximalmente à artéria braquiocefálica para remover a porção pinçada com o clipe vascular (Figura 2E). Posteriormente, armazenar o coração do doador em solução cardioplégica Krebs-Henseleit modificada a frio, utilizando um procedimento semelhante ao transplante normal (passo 1.1.21).
2. Preparação do destinatário
   OBS: Antes de colher o coração do doador, complete o preparo do receptor.
   1. Como descrito acima, o procedimento de preparo do receptor é semelhante ao do transplante normal (passos 1.2.1-1.2.7).
3. Transplante cardíaco heterotópico
   1. Como descrito acima, o procedimento de transplante cardíaco do doador é semelhante ao transplante normal (passos 1.3.1-1.3.20).

Resultados

Em relação ao modelo normal, uma boa contração do VE foi estabelecida com sucesso após o despinçamento. O tempo de isquemia do coração transplantado e o tempo de anestesia do receptor foram de aproximadamente 60 min e 130 min, respectivamente (Tabela 1).

Boa contração do VE também foi obtida após o despinçamento no novo modelo de RA. O tempo de isquemia do coração transplantado e o tempo de anestesia do receptor no modelo de RA foram aproximadamente 5 min e 10 m...

Discussão

Foram descobertos os principais passos para evitar que o coração doador enrijeça durante o implante. Primeiramente, é fundamental transeccionar a aorta abdominal do doador antes da coleta para descarregar o coração do doador ^4,7. Se o procedimento cirúrgico do doador for realizado sem intubação endotraqueal, a respiração cessa após a toracotomia, o que obstrui a circulação pulmonar do doador. Consequentemente, o coração do doador fica sobrecarrega...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antisedan (atipamezole)	Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.
Domitor (medetomidine)	Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.
Dormicum (midazolam)	Maruishi Pharmaceutical Co., Ltd.
heparin	AY Pharmaceuticals Co.,Ltd.
Jcl:Wistar rats	CLEA Japan, Inc.
microscope	Orinpas Co., Ltd.	SZ61
modified Krebs-Henseleit cardioplegic solution	Merck KGaA
sevoflurane	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation
SURGICEL FIBRILLAR	Johnson & Johnson K.K.
Vetorphale (butorphanol)	Meiji Animal Health Co., Ltd.