实时定量IS200/IS605家族相关TnpB对转座子活性的影响

摘要

概述了执行实时成像的方案，以量化辅助蛋白TnpB如何影响单个 活大肠杆菌 细胞中的转位动力学。

摘要

在这里，概述了一个协议，以使用一套与转位耦合的荧光报告基因对活细菌细胞中的转座元件活性进行实时实时成像。特别是，它展示了如何使用实时成像来评估辅助蛋白TnpB对转座元件IS608活性的影响，IS608是IS200/IS605转座元件家族的成员。IS200/IS605转座元件家族是丰富的移动元件，与自然界中发现的无数基因之一tnpB相连。序列同源性表明TnpB蛋白可能是CRISPR / Cas9系统的进化前体。此外，TnpB重新引起了人们的兴趣，已被证明可作为Cas样RNA引导的DNA核酸内切酶。量化了TnpB对IS608转位速率的影响，结果表明，与缺乏TnpB表达的细胞相比，IS608的TnpB表达导致~5倍的转座子活性增加。

引言

转座元件（TEs）是通过切除或催化复制然后基因组重新整合在其宿主基因组内动员的遗传元件。TE存在于生命的所有领域，转位重组宿主基因组，突变编码和控制区域¹。这产生的突变和多样性在进化²，³，发育^4，5和几种人类疾病⁶（包括癌症⁷）中起着重要作用。

使用将转位活性的各个方面与荧光报告基因耦合的新型遗传构建体，我们之前的工作描述了基于细菌TE IS608的实验系统的发展，TE IS608是广泛的IS200 / IS605家族TE的代表，允许实时可视化单个^{活细胞中的}转座8（图1）。TE 系统如图 1A 所示。TE由转座酶编码序列tnpA组成，两侧是左端（LE）和右端（RE）不完全回文重复序列（IP），它们是TnpA的识别和切除位点。tnpA使用启动子P_LTetO1表达，其被tet阻遏因子抑制并且可与脱水四环素（aTc^）9诱导。TE 将组成型 P_lacIQ1 启动子 10 的 -10 和 -35 序列拆分为蓝色报告基因 mCerulean3¹¹。如图1C所示，当诱导tnpA的产生时，可以切除TE，导致启动子重建。产生的细胞表达mCerulean3并发出蓝色荧光。TnpA的N端融合到黄色报告基因金星¹²上，允许通过黄色荧光测量TnpA水平。

IS608和IS200/IS605转座子家族的其他成员通常也编码迄今为止未知功能的第二个基因tnpB¹³。TnpB蛋白是一个非常丰富但不完美表征的核酸酶家族，由几种细菌和古细菌TE^编码14，^15，其通常仅由tnpB¹⁶组成。此外，最近的研究发现TnpB作为一种CRISPR / Cas样可编程RNA引导的核酸内切酶，可以在不同条件下产生dsDNA或ssDNA断裂，从而重新引起了人们对TnpB的兴趣^17，18。然而，目前尚不清楚TnpB在调节转位中可能发挥什么作用。为了实时可视化TnpB对IS608转位的影响，创建了一个转座子版本，包括与红色荧光蛋白mCherry融合的N端融合的TnpB编码区。

作为Kuhlman实验室¹⁹进行的更详细的体积水平研究的补充，这里展示了转座子活性的实时成像如何定量揭示TnpB或任何其他辅助蛋白对转位动力学的影响。通过将TnpB融合到mCherry，通过蓝色荧光识别单个换位事件，并与TnpA（黄色荧光）和TnpB（红色荧光）的表达水平相关。

研究方案

1. 细菌培养物的制备

1. 在37°C下用适当的抗生素（25μg/ mL卡那霉素，参见材料表）在LB中用质粒转座子构建体（先前在Kim等人8中描述）生长大肠杆菌菌株MG1655过夜。
   注意:所用结构的序列和相关序列以GenBank²⁰ 入藏号OP581959、OP581957、OP581958、OP717084和OP717085的形式提供。
2. 为了实现稳态指数生长，将培养物≥100倍稀释到M63培养基（100 mM KH 2 PO 4，1 mM MgSO 4，1.8 μM FeSO 4，15 mM [NH 4]₂SO ₄，0.5 μg/ mL硫胺素[维生素B1]）中，并补充碳源（此处为0.5%w / v葡萄糖）和适当的抗生素（参见材料表）。
3. 在37°C下培养培养物，直到600nm处的光密度（OD 600）达到~0.2。培养物已准备就绪，可供使用。

2. 载玻片准备

1. 通过在微波炉中将M63与0.5%w / v葡萄糖和1.5%w / v琼脂糖煮沸以融化琼脂糖并确保其完全熔融并充分混合来制备载玻片。
2. 在加入抗生素和诱导剂（25 μg/mL 卡那霉素和 10 ng/μL 脱水四环素 [aTc]，参见 材料表）之前，让混合物冷却至 ~55 °C。
3. 将显微镜载玻片放在工作台上。垂直于第一张幻灯片再堆叠两张幻灯片，并将另一张幻灯片放在顶部，平行于底部幻灯片。确保底部和顶部幻灯片之间的间隙等于一个载玻片厚度。将~1 mL的M63琼脂糖混合物缓慢移液到载玻片之间的间隙中，以形成一个小的凝胶方块。
4. 凝胶凝固（~10-15分钟）后，滑动顶部载玻片将其取出。用剃须刀片或刀修剪琼脂糖垫。然后移液 2.5 μL 培养物（步骤 1.3），并将盖玻片放在顶部。
5. 用环氧树脂密封载玻片和盖玻片之间的空间（见 材料表）。让环氧树脂干燥，细胞在37°C下沉淀在琼脂糖垫上至少1小时。

3. 延时荧光显微镜

1. 将制备的样品（步骤1.3）放在荧光显微镜（参见 材料表）上，在加热并保持在37°C的环境中。
   1. 设置适合用于图像采集的相机的曝光时间。调整照明强度以尽量减少光漂白。
      注意:本研究使用每个波长的2秒曝光时间。
   2. 对于每个波长，找到一个包含最小荧光的视场（FOV）。获取要在分析过程中用于背景减法的图像。
2. 设置协议以不同波长和固定时间间隔采集网格中的图像。
   1. 将延时摄影编码到协议中。将采集频率设置为所需的时间间隔（此处为20分钟），将总延时持续时间设置为所需的长度（24小时）。
   2. 将适当的波长编码到协议中（取决于所使用的结构）。
      注意:mCherry激发峰在587 nm处，发射峰在610 nm²¹处;mVenus位于515 nm和527 nm¹²，而mCerulean3位于433 nm和475 nm¹¹。
   3. 设置网格大小以在所需数量的 FOV 之间捕获。
      注意:此处显示的代表性数据使用了 8 x 8 FOV。

4. 图像分析

1. 使用在步骤3.1.2中获取的相应背景图像对每个颜色通道进行背景减法。对于所有分析步骤，我们使用开源平台斐济²² 中的标准模块（见 材料表）。
2. 通过阈值化 mCerulean 通道并将阈值面积除以平均细胞面积来近似每个时间点的总群体。
3. 要计算独特的切除事件，请采用mCerulean3通道的时间导数。通过减去 mCerulean3 通道中的连续图像来执行此操作。切除事件将在时间导数中检测为明亮的荧光闪光。
   1. 阈值切除事件堆栈以消除不需要的荧光。请注意，此过程将阈值部分切除本身。要解决此问题，请放大图像以将切除物恢复到原始大小。
      注意:使用类似的阈值和图像分析技术的分析也可以在其他荧光通道上进行（例如，将切除事件与转座酶TnpA [黄色金星荧光]和TnpB [红色mCherry荧光]的水平相关联]。

结果

这种通过荧光显微镜可视化活细胞中转座子活性的方法虽然通量低于批量荧光测量，但允许直接可视化单个活细胞中的转座子活性。转座子切除事件导致mCerulean3启动子的重建（图1），允许通过亮蓝色荧光鉴定经历转座子活性的细胞（图2，TnpB +:补充电影1和TnpB-:补充电影2）。

研究发现，表达辅助蛋白TnpB（...

讨论

这里介绍的用于实时成像活细胞中转座元件活性的独特方法是一种灵敏的测定，可以直接实时检测活细胞中的转位，并将该活性与辅助蛋白的表达相关联。虽然通量低于体积方法所能达到的通量，但该方法可以详细测量单个活细胞中的TE活性和蛋白质表达。

可以使用各种工具和技术直接在显微镜上培养细胞以进行实时成像。这里使用的琼脂糖垫上的细胞生长方法具有快速、便...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 Ton Clear Epoxy	Devcon	31345
Agarose	Sigma-Aldrich	5066
Ammonium sulfate	Sigma-Aldrich	AX1385-1
Anhydrotetracycline hydrochloride	Sigma-Aldrich	37919
Argon Laser	Melles Griot	35-IMA-840-015
Blue Filter Cube	Chroma	Ex: Z457/10X, Em: ET485/30M
D(+)Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
Eclipse Ti-E Microscope	Nikon		Discontinued
Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 0.1 to 10 µL, Length: 3.4 cm, 1.33 in., PP (Polypropylene)	Eppendorf North America Biotools	22491504
Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 50 to 1000 µL, Length: 7.1 cm, 2.79 in., PP (Polypropylene)	Eppendorf North America Biotools	22491555
Ferrous Sulfate Acs 500 g	Fisher Scientific	706834
Fiji			Fiji (imagej.net)
Fisher BioReagents LB Broth, Miller (Granulated)	Fisher Scientific	BP9723-2
Glass Cover Slide	Fisher Scientific	12-542B
Kanamycin Sulfate	Sigma-Aldrich	1355006
Magnesium sulfate Cert Ac	Fisher Scientific	XXM63SP3KG
Microscope Heater	World Precision Instruments	96810-1
Potassium Phosphate Monobasic	Fisher Scientific	17001H
ProScan III Stage	Prior
Red Filter Cube	Chroma	Ex: ET560/40X, Em: ET645/75M
Sapphire 561 LP Laser	Coherent	1170412
Slide, Microscope	Fisher Scientific	125535B
Thiamine Hydrochloride	Sigma-Aldrich (SIAL)	T1270-100G
Ti-LU4 Laser Launch	Nikon
Yellow Filter Cube	Chroma	Ex: Z514/10X, Em: ET535/30M