Quantification en temps réel des effets du TnpB associé à la famille IS200/IS605 sur l’activité des transposons

Résumé

Un protocole est décrit pour effectuer une imagerie en temps réel en direct afin de quantifier comment la protéine accessoire TnpB affecte la dynamique de transposition dans les cellules vivantes individuelles d’Escherichia coli .

Résumé

Ici, un protocole est décrit pour effectuer une imagerie en direct et en temps réel de l’activité des éléments transposables dans les cellules bactériennes vivantes à l’aide d’une suite de rapporteurs fluorescents couplés à la transposition. En particulier, il démontre comment l’imagerie en temps réel peut être utilisée pour évaluer les effets de la protéine accessoire TnpB sur l’activité de l’élément transposable IS608, membre de la famille des éléments transposables IS200/IS605. La famille IS200/IS605 d’éléments transposables sont des éléments mobiles abondants liés à l’un des gènes les plus innombrables trouvés dans la nature, tnpB. Les homologies de séquence suggèrent que la protéine TnpB pourrait être un précurseur évolutif des systèmes CRISPR/Cas9. De plus, le TnpB a suscité un regain d’intérêt, ayant été montré comme une endonucléase d’ADN guidée par l’ARN de type Cas. Les effets de TnpB sur les taux de transposition de l’IS608 sont quantifiés, et il est démontré que l’expression de TnpB de l’IS608 entraîne une augmentation ~5x de l’activité du transposon par rapport aux cellules dépourvues d’expression de TnpB.

Introduction

Les éléments transposables (ET) sont des éléments génétiques qui se mobilisent au sein de leur génome hôte par excision ou catalysent la copie suivie d’une réintégration génomique. Les ET existent dans tous les domaines de la vie, et la transposition restructure le génome de l’hôte, mutant les régions codantes et de contrôle¹. Cela génère des mutations et une diversité qui jouent un rôle important dans l’évolution^2,3, le développement ^4,5, et plusieurs maladies humaines^6, dont le cancer⁷.

En utilisant de nouvelles constructions génétiques qui couplent des aspects de l’activité de transposition à des rapporteurs fluorescents, nos travaux antérieurs ont décrit le développement d’un système expérimental basé sur la bactérie TE IS608, un représentant de la famille répandue IS200/IS605 des TE, qui permet la visualisation en temps réel de la transposition dans les cellules vivantes individuelles⁸ (Figure 1). Le système TE est illustré à la figure 1A. Le TE comprend la séquence codante de la transposase, tnpA, flanquée de répétitions palindromiques imparfaites (IP) à l’extrémité gauche (LE) et à l’extrémité droite (RE), qui sont les sites de reconnaissance et d’excision de TnpA. Le tnpA est exprimé à l’aide du promoteur P_LTetO1, qui est réprimé par le répresseur du têt et est inductible par l’anhydrotétracycline (aTc)⁹. Le TE divise les séquences -10 et -35 d’un promoteur constitutif P_lacIQ1 ¹⁰ pour le rapporteur bleu mCerulean3¹¹. Comme le montre la figure 1C, lorsque la production de tnpA est induite, le TE peut être excisé, conduisant à une reconstitution du promoteur. La cellule produite exprime mCerulean3 et devient bleue. L’extrémité N de TnpA est fusionnée avec le rapporteur jaune Vénus¹², permettant de mesurer les niveaux de TnpA par fluorescence jaune.

IS608 et d’autres membres de la famille de transposons IS200/IS605 codent également généralement pour un deuxième gène de la fonction jusqu’ici inconnue, le tnpB¹³. Les protéines TnpB sont une famille de nucléases extrêmement abondantes mais imparfaitement caractérisées codées par plusieurs TEs^14,15 bactériennes et archées^, qui sont souvent constituées uniquement de tnpB¹⁶. De plus, des études récentes ont renouvelé l’intérêt pour le TnpB en constatant que le TnpB fonctionne comme une endonucléase programmable guidée par ARN de type CRISPR / Cas-like qui produira des cassures d’ADNds ou d’ADNss dans diverses conditions^17,18. Cependant, on ne sait toujours pas quel rôle le TnpB peut jouer dans la régulation de la transposition. Pour effectuer une visualisation en temps réel des effets de TnpB sur la transposition IS608, une version du transposon, incluant la région codante de TnpB avec une fusion N-terminale à la protéine fluorescente rouge mCherry, a été créée.

En complément d’études plus détaillées au niveau du vrac réalisées par le laboratoire Kuhlman¹⁹, il est montré ici comment l’imagerie en temps réel de l’activité des transposons peut révéler quantitativement l’impact de TnpB ou de toute autre protéine accessoire sur la dynamique de transposition. En fusionnant TnpB en mCherry, les événements de transposition individuels sont identifiés par fluorescence bleue et corrélés avec les niveaux d’expression de TnpA (fluorescence jaune) et TnpB (fluorescence rouge).

Protocole

1. Préparation de cultures bactériennes

1. Cultiver la souche MG1655 d’E. coli avec des constructions de transposons plasmidiques (décrites précédemment dans Kim et ^coll.8) pendant une nuit dans LB avec les antibiotiques appropriés (25 μg/mL de kanamycine, voir le tableau des matériaux) à 37 °C.
   REMARQUE : Les séquences des constructions utilisées et les séquences associées sont disponibles sous les numéros d’acquisition GenBank²⁰ OP581959, OP581957, OP581958, OP717084 et OP717085.
2. Pour obtenir une croissance exponentielle à l’état d’équilibre, diluer les cultures ≥100 fois dans le milieu M63 (100 mM KH2 PO 4, 1 mM MgSO 4, 1,8 μM FeSO 4, 15 mM [NH 4]₂SO ₄, 0,5 μg/mL de thiamine [vitamine B1]) complétées par une source de carbone (0,5 % p/v de glucose ici) et des antibiotiques appropriés (voir Tableau des matériaux).
3. Cultiver des cultures à 37 °C jusqu’à ce que la densité optique à 600 nm (OD600) atteigne ~0,2. Les cultures sont prêtes à l’emploi.

2. Préparation des diapositives

1. Préparez une lame en faisant bouillir du M63 avec 0,5 % p/v de glucose et 1,5 % p/v d’agarose au micro-ondes pour faire fondre l’agarose et s’assurer qu’elle est complètement fondue et bien mélangée.
2. Laisser refroidir le mélange à ~55 °C avant d’ajouter des antibiotiques et des inducteurs (25 μg/mL de kanamycine et 10 ng/μL d’anhydrotétracycline [aTc], voir le tableau des matières).
3. Placez une lame de microscope sur l’établi. Empilez deux autres diapositives perpendiculaires à la première et placez-en une autre sur le dessus, parallèlement à la glissière inférieure. Assurez-vous qu’il y a un espace égal à une épaisseur de lame entre les diapositives inférieure et supérieure. Pipeter ~1 mL du mélange d’agarose M63 dans cet espace entre les lames lentement pour créer un petit carré de gel.
4. Une fois que le gel s’est solidifié (~10-15 min), faites glisser la lame supérieure pour l’enlever. Coupez le tampon d’agarose avec une lame de rasoir ou un couteau. Ensuite, pipeter 2,5 μL de la culture (étape 1.3) et mettre la lamelle de couverture sur le dessus.
5. Scellez l’espace entre la glissière et la lamelle de couverture avec de l’époxy (voir le tableau des matériaux). Laisser sécher l’époxy et déposer les cellules sur le tampon d’agarose pendant au moins 1 h à 37 °C.

3. Microscopie à fluorescence timelapse

1. Placer l’échantillon préparé (étape 1.3) sur un microscope à fluorescence (voir le tableau des matériaux) dans un environnement chauffé et maintenu à 37 °C.
   1. Réglez les temps d’exposition appropriés pour l’appareil photo utilisé pour l’acquisition d’images. Ajustez l’intensité de l’éclairage pour minimiser le photoblanchiment.
      REMARQUE : Un temps d’exposition de 2 s pour chaque longueur d’onde a été utilisé pour la présente étude.
   2. Pour chaque longueur d’onde, trouvez un champ de vision (FOV) contenant une fluorescence minimale. Acquérir des images à utiliser pendant l’analyse pour la soustraction d’arrière-plan.
2. Configurez un protocole pour acquérir des images dans une grille à différentes longueurs d’onde et à intervalles de temps réguliers.
   1. Encodez la photographie timelapse dans le protocole. Réglez la fréquence d’acquisition sur l’intervalle de temps souhaité (20 min ici) et la durée totale du timelapse sur la durée souhaitée (24 h).
   2. Coder les longueurs d’onde appropriées dans le protocole (selon la construction utilisée).
      NOTE: Le pic d’excitation mCherry est à 587 nm et le pic d’émission à 610 nm²¹; mVénus est à 515 nm et 527 nm¹², tandis que mCerulean3 est à 433 nm et 475 nm¹¹.
   3. Définissez la taille de la grille à capturer entre le nombre souhaité de FOV.
      REMARQUE: Les données représentatives présentées ici utilisaient des FOV de 8 x 8.

4. Analyse d’images

1. Effectuez une soustraction d’arrière-plan sur chaque couche de couleur en utilisant les images d’arrière-plan respectives acquises à l’étape 3.1.2. Pour toutes les étapes d’analyse, nous utilisons des modules standard dans la plate-forme open-source Fiji²² (voir Tableau des matériaux).
2. Approximez la population totale à chaque moment en seuillant le canal céruléen et en divisant la zone seuil par la surface cellulaire moyenne.
3. Pour compter les événements d’excision uniques, prenez la dérivée temporelle du canal mCerulean3. Pour ce faire, soustrayez des images successives dans le canal mCerulean3. Les événements d’excision seront détectés dans la dérivée temporelle comme un éclair lumineux de fluorescence.
   1. Seuil de la pile d’événements d’excision pour éliminer la fluorescence indésirable. Notez que ce processus entraînera le seuil d’une partie des excisions elles-mêmes. Pour résoudre ce problème, dilatez les images pour restaurer les excisions à leur taille d’origine.
      REMARQUE : Des analyses utilisant des techniques similaires de seuillage et d’analyse d’images peuvent également être effectuées sur les autres canaux de fluorescence (p. ex., corréler les événements d’excision avec les niveaux de transsase TnpA [fluorescence jaune de Vénus] et TnpB [fluorescence rouge mCherry].

Résultats

Cette méthode de visualisation de l’activité des transposons dans les cellules vivantes par microscopie à fluorescence, tout en ayant un débit inférieur à celui des mesures de fluorescence en vrac, permet une visualisation directe de l’activité des transposons dans les cellules vivantes individuelles. Les événements d’excision de transposons entraînent la reconstitution du promoteur de mCerulean3 (Figure 1), permettant l’identification des cellules subissant une activité de transposon par fluorescence ...

Discussion

La méthode unique présentée ici pour l’imagerie en temps réel de l’activité des éléments transposables dans les cellules vivantes est un test sensible qui peut détecter directement la transposition dans les cellules vivantes et en temps réel et corréler cette activité avec l’expression de protéines accessoires. Bien que le débit soit inférieur à ce qui peut être accompli par des méthodes en vrac, cette méthode permet d’obtenir des mesures détaillées de l’activité TE et de l’expression des...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 Ton Clear Epoxy	Devcon	31345
Agarose	Sigma-Aldrich	5066
Ammonium sulfate	Sigma-Aldrich	AX1385-1
Anhydrotetracycline hydrochloride	Sigma-Aldrich	37919
Argon Laser	Melles Griot	35-IMA-840-015
Blue Filter Cube	Chroma	Ex: Z457/10X, Em: ET485/30M
D(+)Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
Eclipse Ti-E Microscope	Nikon		Discontinued
Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 0.1 to 10 µL, Length: 3.4 cm, 1.33 in., PP (Polypropylene)	Eppendorf North America Biotools	22491504
Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 50 to 1000 µL, Length: 7.1 cm, 2.79 in., PP (Polypropylene)	Eppendorf North America Biotools	22491555
Ferrous Sulfate Acs 500 g	Fisher Scientific	706834
Fiji			Fiji (imagej.net)
Fisher BioReagents LB Broth, Miller (Granulated)	Fisher Scientific	BP9723-2
Glass Cover Slide	Fisher Scientific	12-542B
Kanamycin Sulfate	Sigma-Aldrich	1355006
Magnesium sulfate Cert Ac	Fisher Scientific	XXM63SP3KG
Microscope Heater	World Precision Instruments	96810-1
Potassium Phosphate Monobasic	Fisher Scientific	17001H
ProScan III Stage	Prior
Red Filter Cube	Chroma	Ex: ET560/40X, Em: ET645/75M
Sapphire 561 LP Laser	Coherent	1170412
Slide, Microscope	Fisher Scientific	125535B
Thiamine Hydrochloride	Sigma-Aldrich (SIAL)	T1270-100G
Ti-LU4 Laser Launch	Nikon
Yellow Filter Cube	Chroma	Ex: Z514/10X, Em: ET535/30M