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요약

보조 단백질 TnpB가 개별 살아있는 대장균 세포의 전이 역학에 어떻게 영향을 미치는지 정량화하기 위해 실시간 이미징을 수행하는 프로토콜이 요약되어 있습니다.

초록

여기서, 프로토콜은 전치에 결합된 형광 리포터 제품군을 사용하여 살아있는 박테리아 세포에서 전치 가능한 요소 활성의 실시간 이미징을 수행하는 것으로 요약됩니다. 특히, 실시간 이미징을 사용하여 보조 단백질 TnpB가 전치 가능한 요소의 IS200/IS605 제품군에 속하는 전치 가능한 요소 IS608의 활성에 미치는 영향을 평가하는 방법을 보여줍니다. IS200/IS605 전치 가능한 요소 계열은 자연에서 발견되는 가장 무수한 유전자 중 하나인 tnpB와 연결된 풍부한 이동 요소입니다. 서열 상동성은 TnpB 단백질이 CRISPR/Cas9 시스템의 진화적 전구체일 수 있음을 시사한다. 또한, TnpB는 Cas-유사 RNA 유도 DNA 엔도뉴클레아제로서 작용하는 것으로 밝혀져 새로운 관심을 받았다. IS608의 전이 속도에 대한 TnpB의 효과가 정량화되고, IS608의 TnpB의 발현이 TnpB 발현이 부족한 세포에 비해 ~ 5 배 증가 된 트랜스포존 활성을 초래한다는 것이 입증되었다.

서문

전치 가능한 요소(TE)는 절제 또는 촉매 복제에 이어 게놈 재통합에 의해 숙주 게놈 내에서 동원되는 유전 요소입니다. TE는 생명의 모든 영역에 존재하며, 전위는 숙주 게놈을 재구성하여 코딩 및 제어 영역을 돌연변이시킵니다1. 이것은 진화 2,3, 발달 4,5 및 암7을 포함한 여러 인간 질병6에서 중요한 역할을 하는 돌연변이와 다양성을 생성합니다.

전위 활성의 측면을 형광 리포터와 결합하는 새로운 유전자 구조를 사용하여 이전 연구에서는 광범위한 IS200/IS605 TE제품군을 대표하는 박테리아 TE IS608을 기반으로 개별살아있는 세포8에서 전이를 실시간으로 시각화할 수 있는 실험 시스템의 개발에 대해 설명했습니다(그림 1). TE 시스템은 그림 1A에 표시되어 있습니다. TE는 TnpA에 대한 인식 및 절제 부위인 좌측 말단(LE) 및 우단(RE) 불완전 회문 반복(IP)에 의해 측면에 있는 트랜스포아제 코딩 서열 tnpA를 포함한다. tnpA는 프로모터 PLTetO1을 사용하여 발현되며, 이는 tet 억제 자에 의해 억제되고 안하이드로 테트라 사이클린 (aTc)9로 유도 될 수 있습니다. TE는 청색 리포터 mCerulean3 11에 대해 구성적PlacIQ1 프로모터 10의 -10 및 -35 서열을 분할한다. 도 1C에 나타낸 바와 같이, tnpA의 생산이 유도될 때, TE는 절제될 수 있고, 프로모터 재구성을 유도할 수 있다. 생성 된 세포는 mCerulean을 발현합니다.3 그리고 청색 형광. TnpA의 N- 말단은 황색 리포터 Venus12에 융합되어 황색 형광으로 TnpA 수준을 측정 할 수 있습니다.

IS608 및 트랜스포존의 IS200/IS605 패밀리의 다른 구성원은 또한 전형적으로 지금까지 알려지지 않은 기능의 제2 유전자인 tnpB13을 암호화한다. TnpB 단백질은 엄청나게 풍부하지만 불완전하게 특성화된 뉴클레아제 계열이며, 이는 종종 tnpB16으로만 구성되는 여러 박테리아 및 고고학 TEs14,15에 의해 암호화됩니다. 또한, 최근 연구는 TnpB가 다양한 조건에서 dsDNA 또는 ssDNA 절단을 생성하는 CRISPR / Cas와 같은 프로그래밍 가능한 RNA 유도 엔도 뉴 클레아 제로서 기능한다는 것을 발견함으로써 TnpB에 대한 관심을 새롭게했습니다17,18. 그러나 TnpB가 전치를 조절하는 데 어떤 역할을 할 수 있는지는 불분명합니다. IS608 전치에 대한 TnpB의 효과에 대한 실시간 시각화를 수행하기 위해 적색 형광 단백질 mCherry에 대한 N- 말단 융합을 갖는 TnpB의 코딩 영역을 포함하는 트랜스포존 버전이 생성되었습니다.

Kuhlman 실험실19에 의해 수행된보다 상세한 벌크 레벨 연구를 보완하여, 트랜스포존 활성의 실시간 이미징이 TnpB 또는 다른 보조 단백질이 전위 역학에 미치는 영향을 정량적으로 밝힐 수있는 방법을 보여줍니다. TnpB를 mCherry에 융합시킴으로써, 개별 전위 사건은 청색 형광에 의해 식별되고 TnpA (황색 형광) 및 TnpB (적색 형광)의 발현 수준과 상관 관계가 있습니다.

프로토콜

1. 세균 배양의 제조

  1. 플라스미드 트랜스포존 구축물(Kim et al.8에 이전에 기술됨)로 대장균 균주 MG1655를 LB에서 적절한 항생제(카나마이신 25μg/mL, 재료 표 참조)와 함께 37°C에서 밤새 성장시킵니다.
    참고: 사용된 구축물의 서열 및 관련 서열은 GenBank20 수탁 번호 OP581959, OP581957, OP581958, OP717084 및 OP717085로서 입수가능하다.
  2. 정상 상태 기하 급수적 인 성장을 달성하기 위해, 탄소원 (0.5 % w / v 포도당 여기) 및 적절한 항생제 (재료 표 참조)가 보충 된 M63 배지 (100 mM KH2PO4, 1 mM MgSO 4, 1.8 μM FeSO 4, 15 mM [NH 4] 2SO 4, 0.5 μg / mL 티아민 [비타민 B1])로 배양물을 희석 ≥100 배).
  3. 37nm(OD600)의 광학 밀도가 ~0.2에 도달할 때까지 600°C에서 배양물을 성장시킵니다. 문화는 사용할 준비가되었습니다.

2. 슬라이드 준비

  1. 마이크로파에서 M63을 0.5% w/v 포도당과 1.5% w/v 아가로스로 끓여 슬라이드를 준비하여 아가로스를 녹이고 완전히 녹고 잘 혼합되도록 합니다.
  2. 항생제와 유도제 (25 μg / mL 카나마이신 및 10 ng / μL 무수 테트라 사이클린 [aTc], 재료 표 참조)를 추가하기 전에 혼합물을 ~ 55 ° C로 식히십시오.
  3. 작업대에 현미경 슬라이드를 놓습니다. 첫 번째 슬라이드에 수직으로 두 개의 슬라이드를 더 쌓고 아래쪽 슬라이드와 평행하게 다른 슬라이드를 맨 위에 놓습니다. 아래쪽 슬라이드와 위쪽 슬라이드 사이에 슬라이드 두께 1개와 같은 간격이 있는지 확인합니다. M63 아가로스 혼합물의 ~1 mL를 슬라이드 사이의 이 틈에 천천히 넣어 작은 젤 사각형을 만듭니다.
  4. 젤이 굳어지면(~10-15분) 상단 슬라이드를 밀어 제거합니다. 면도날이나 칼로 아가 로스 패드를 다듬습니다. 배양물 2.5 μL를 피펫팅한 다음(단계 1.3) 커버슬립을 그 위에 올려놓는다.
  5. 슬라이드와 커버슬립 사이의 공간을 에폭시로 밀봉하십시오( 재료 표 참조). 에폭시를 건조시키고 세포를 37°C에서 최소 1시간 동안 아가로스 패드 상에 침전시킨다.

3. 타임랩스 형광 현미경

  1. 준비된 샘플(단계 1.3)을 37°C로 가열 및 유지되는 환경에서 형광 현미경( 재료 표 참조) 상에 놓습니다.
    1. 이미지 획득에 사용되는 카메라에 적합한 노출 시간을 설정합니다. 광퇴색을 최소화하기 위해 조명 강도를 조정합니다.
      참고: 각 파장에 대해 2초의 노출 시간이 본 연구에 사용되었습니다.
    2. 각 파장에 대해 최소 형광을 포함하는 시야(FOV)를 찾습니다. 배경 빼기를 위해 분석 중에 사용할 이미지를 획득합니다.
  2. 서로 다른 파장과 일정한 시간 간격으로 그리드에서 이미지를 수집하도록 프로토콜을 설정합니다.
    1. 타임랩스 사진을 프로토콜로 인코딩합니다. 획득 빈도를 원하는 시간 간격(여기서는 20분)으로 설정하고 총 타임랩스 기간을 원하는 길이(24시간)로 설정합니다.
    2. 적절한 파장을 프로토콜로 인코딩합니다(사용된 구성에 따라 다름).
      참고: mCherry 여기 피크는 587nm이고 방출 피크는 610nm21입니다. mVenus는 515nm 및 527nm12에 있는 반면 mCerulean3은 433nm 및 475nm11에 있습니다.
    3. 원하는 FOV 수 사이에서 캡처할 그리드 크기를 설정합니다.
      참고: 여기에 표시된 대표 데이터는 8 x 8 FOV를 사용했습니다.

4. 이미지 분석

  1. 3.1.2단계에서 획득한 각 배경 이미지를 사용하여 각 색상 채널에서 배경 빼기를 수행합니다. 모든 분석 단계에서 오픈 소스 플랫폼 Fiji22 의 표준 모듈을 사용합니다 ( 재료 표 참조).
  2. mCerulean 채널을 임계값화하고 임계값 영역을 평균 셀 영역으로 나누어 각 시점의 총 모집단을 근사화합니다.
  3. 고유한 절제 이벤트를 계산하려면 mCerulean3 채널의 시간 미분을 취하십시오. mCerulean3 채널에서 연속 이미지를 빼서 이 작업을 수행합니다. 절제 이벤트는 시간 미분에서 형광의 밝은 섬광으로 감지됩니다.
    1. 원치 않는 형광을 제거하기 위해 절제 이벤트의 스택을 임계값으로 설정합니다. 이 과정은 절제 자체의 일부를 임계 값으로 표시합니다. 이 문제를 해결하려면 이미지를 확장하여 절제를 원래 크기로 복원하십시오.
      참고: 유사한 임계값 및 이미지 분석 기술을 사용하는 분석은 다른 형광 채널에서도 수행할 수 있습니다(예: 절제 이벤트를 트랜스포아제 TnpA[노란색 금성 형광] 및 TnpB[빨간색 mCherry 형광] 수준과 상관 관계).

결과

형광 현미경으로 살아있는 세포에서 트랜스포존 활성을 시각화하는 이 방법은 벌크 형광 측정보다 처리량이 낮기 때문에 개별 살아있는 세포에서 트랜스포존 활성을 직접 시각화할 수 있습니다. 트랜스포존 절제 이벤트는 mCerulean3에 대한 프로모터의 재구성을 초래하여(그림 1), 밝은 파란색 형광에 의해 트랜스포존 활성을 받는 세포를 식별할 수 있습니다(그림 2, TnpB+: 보충...

토론

살아있는 세포에서 전치 가능한 요소 활성의 실시간 이미징을 위해 여기에 제시된 고유한 방법은 살아있는 세포에서 실시간으로 전이를 직접 감지하고 이 활성을 보조 단백질의 발현과 연관시킬 수 있는 민감한 분석입니다. 처리량은 벌크 방법으로 달성할 수 있는 것보다 낮지만 이 방법은 개별 살아있는 세포에서 TE 활성 및 단백질 발현을 자세히 측정합니다.

실시간 이미징...

공개

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 말

이 연구에 대한 재정 지원은 캘리포니아 대학의 창업 자금으로 제공되었습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
2 Ton Clear EpoxyDevcon31345
AgaroseSigma-Aldrich5066
Ammonium sulfateSigma-AldrichAX1385-1
Anhydrotetracycline hydrochlorideSigma-Aldrich37919
Argon LaserMelles Griot35-IMA-840-015
Blue Filter CubeChromaEx: Z457/10X, Em: ET485/30M
D(+)GlucoseSigma-AldrichG7021
Eclipse Ti-E MicroscopeNikonDiscontinued
Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 0.1 to 10 µL, Length: 3.4 cm, 1.33 in., PP (Polypropylene)Eppendorf North America Biotools22491504
Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 50 to 1000 µL, Length: 7.1 cm, 2.79 in., PP (Polypropylene)Eppendorf North America Biotools22491555
Ferrous Sulfate Acs 500 gFisher Scientific706834
FijiFiji (imagej.net)
Fisher BioReagents LB Broth, Miller (Granulated)Fisher ScientificBP9723-2 
Glass Cover SlideFisher Scientific12-542B 
Kanamycin SulfateSigma-Aldrich1355006
Magnesium sulfate Cert AcFisher ScientificXXM63SP3KG
Microscope HeaterWorld Precision Instruments96810-1
Potassium Phosphate MonobasicFisher Scientific17001H
ProScan III StagePrior
Red Filter CubeChromaEx: ET560/40X, Em: ET645/75M
Sapphire 561 LP LaserCoherent1170412
Slide, MicroscopeFisher Scientific125535B
Thiamine HydrochlorideSigma-Aldrich (SIAL)T1270-100G
Ti-LU4 Laser LaunchNikon
Yellow Filter CubeChromaEx: Z514/10X, Em: ET535/30M

참고문헌

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