用于研究纳米颗粒诱导的DNA损伤和修复动力学的DNA纤维测定的演示

摘要

该方法有助于分析纳米颗粒存在下DNA复制动力学的变化。根据目标材料的细胞毒性水平，可以采用不同的方法。此外，还提供了图像分析的描述，以帮助进行DNA纤维分析。

摘要

纳米材料暴露会导致细胞中的复制应激和基因组不稳定。不稳定程度取决于纳米材料的化学性质、大小和浓度、暴露时间和暴露的细胞类型。已经使用了几种已建立的方法来阐明内源性/外源性因子如何影响全球复制。然而，复制水平的测定（例如 DNA 纤维测定）对于了解这些药物如何影响复制起始、终止和复制叉进展至关重要。了解这一点可以使人们更好地了解纳米材料如何增加突变固定和基因组不稳定的机会。我们使用RAW 264.7巨噬细胞作为模型细胞来研究氧化石墨烯纳米颗粒暴露下的复制动力学。在这里，我们展示了DNA纤维测定的基本方案，其中包括使用核苷酸类似物进行脉冲标记，细胞裂解，将脉冲标记的DNA纤维铺展到载玻片上，DNA纤维内核苷酸类似物的荧光免疫染色，使用共聚焦显微镜对DNA纤维内的复制中间体进行成像，以及使用计算机辅助评分和分析（CASA）软件进行复制中间体分析。

引言

在每个细胞周期中，DNA复制可确保准确的基因组复制¹。真核染色体复制主要取决于三个因素:多个复制原点的触发时间，从触发的原点出现的分叉的速度，以及当来自相邻原点的两个复制分叉相遇时复制过程的终止².为了将遗传信息高保真地传输到子细胞，以及保持遗传完整性，准确的DNA复制至关重要。从正常代谢发展而来的物质或由于人工或自然环境材料而形成的物质不断攻击基因组。这些内源性和外源性因子由于遇到这些代理引起的DNA损伤而导致复制叉减慢或停止，而响应这些困难而暂时减慢或停止的叉称为复制应激³。为了应对复制应激，细胞已经发展出几种分子途径，以维持受干扰的复制叉的稳定性并允许它们重新启动⁴。在遗传稳定性、细胞存活和人类疾病方面，这些复制应激反应机制已成为维持健康基因组、确保细胞存活和降低疾病形成可能性的关键因素⁵。

能够产生复制应力的外源性物质之一是纳米颗粒。纳米颗粒是尺寸范围从 1 nm 到 100 nm 的颗粒⁶.由于其高表面积、独特的形状和独特的化学性质，纳米颗粒被用于各种医疗、制药、环境和工业应用^7,8。虽然纳米颗粒有很多潜在的好处，但其中一些（由于其遗传性质或寿命）可能会变得有毒。纳米颗粒也可以由于医疗植入物的自然磨损而形成，并释放到假体周围区域^9,10中。

由于人类暴露于为各种应用而生产的无数纳米颗粒中，纳米颗粒毒性领域的研究在过去10年中大大增加¹¹。虽然这些研究工作揭示了有关纳米颗粒对人类健康构成潜在威胁的大量信息，但关于纳米颗粒引起遗传毒性的可能性的知识仍然有限。到目前为止，已经发现的是，这些纳米颗粒可以与DNA物理相互作用，促进DNA损伤，并破坏或干扰负责修复或复制DNA¹²的蛋白质。为了检测它们如何干扰DNA复制，通常使用DNA纤维梳理，抗辐射DNA合成（RDS）和DNA纤维分析^13,14,15,16。

DNA纤维梳理方法是灵活的，并在单分子水平上提供有关复制叉动力学的信息¹⁷。从本质上讲，一旦DNA末端与其结合，盐碱化的盖玻片就会从DNA溶液中轻轻取出。DNA分子被溶液的弯月面拉直和排列。DNA纤维的均匀性、间距和排列支持准确可靠的纤维束长度测量。通过调整治疗的长度和顺序以及用于造成压力或损伤的药物，可以使用此应用程序监控叉子前进的许多方面。在这种方法中，使用双标记系统，通过该系统评估复制分叉的速度和进度^17,18。另一方面，2D凝胶电泳利用了琼脂糖凝胶电泳中分支DNA结构比相同质量的线性DNA分子行进得更慢的事实，从而允许在2D运行中将两者干净地分离。事实上，对这种方法进行了研究，以在第一次运行中根据它们的质量和在第二次正交运行中基于它们的形状来分离 DNA 分子。在基因组DNA片段化之后，不常见的复制和重组中间体发展出分支形式，并且可以将它们与2D凝胶¹⁹中更常见的线性分子区分开来。

RDS方法用于确定全球DNA合成如何受到影响。在该方法中，通过比较未处理细胞与处理细胞中掺入的放射性标记核苷酸（例如[14C]胸苷）的量来确定全局复制的抑制程度^14,20。未处理和处理的细胞之间放射性标记的百分比差异代表了DNA损伤剂影响DNA合成的程度。与此类似，另一种方法利用细胞整合核苷酸类似物的能力，如BrdU（5-溴-2′-脱氧尿苷）进行流式细胞术，以测量DNA合成的总体速率^21,22。虽然这些方法证明了DNA损伤剂如何影响全球DNA合成，但它们并没有显示单个复制子是如何受到影响的。事实上，重复水平的测定对于更好地了解有毒颗粒（纳米材料）暴露情况下基因组不稳定的起始和程度至关重要。DNA纤维放射自显影和电子显微镜检查是用于确定这一点的一些方法23,24,25,26。

复制气泡和来自不均匀间隔来源的双向复制的概念首先是使用单分子测试（如电子显微镜和DNA纤维放射自显影）开发的^27,28。电子显微镜极大地促进了分散在碳涂层网格中的特定分子上分支复制中间体的直接观察。这种方法今天仍在用于跟踪复制叉处的病理变化，用于定位DNA复制的第一个真核起源²⁸。纤维放射自显影以新复制区域的放射自显影鉴定和用氚化胸苷对染色体进行脉冲标记的概念为中心。DNA纤维放射自显影使后生动物基因组序列中的起源密度和复制叉率的首次定量评估成为可能²⁹。

目前，纤维荧光照相方法已经取代了放射自显影，主要是因为纤维荧光照相比放射自显影快得多。在光纤荧光照相术中，将两种卤代核苷酸衍生物，如溴-（Br）、氯-（Cl）或碘脱氧尿苷（IdU））依次掺入新鲜复制的DNA中，然后使用抗体³⁰通过间接免疫荧光鉴定。通过将一种或两种类似物的免疫染色和另一种类似物的不同颜色进行免疫染色（例如，用掺入的 IdU 红和掺入的 CldU 绿对新生 DNA 进行免疫染色）（图 1）²¹。许多不同类型的复制中间体可以通过DNA纤维分析来鉴定。最常研究的是单个细长叉、启动和终止。单个细长叉具有红色的复制模式，然后是绿色（红绿;图2A）。¹³这些中间体的长度经常用于测量叉速度（即叉长/脉冲时间）或通过轨迹缩短来测量新生DNA的核苷酸外分解降解（图2E）^30,31,32。在Mimitou等人的一项研究中，发现长期暴露于羟基脲（一种导致DNA双链断裂的复制毒药）后，RE11被招募³³。MRE11是一种核酸外切酶，以其3'-5'核酸外切酶活性而闻名，它能够切割DNA末端进行修复。因此，当暴露于有毒物质时，人们可能会观察到新生DNA的核苷外分解降解，这是由于暴露于DNA损伤剂而导致的DNA链缩短³⁴。

由物理障碍（DNA-蛋白质复合物或DNA损伤）、化学障碍或突变引起的复制叉断裂可能会停止复制，需要同源重组才能重新启动复制。这被称为分叉进展受损。许多 体外 和 体内 研究表明，转录有时可能会以这种方式阻止复制叉的进步³⁵。

启动是在第一个或第二个脉冲期间启动和触发的复制源。在第一个脉冲期间触发并具有继续处于活动状态的复制分叉的起源具有绿-红-绿模式（图2B，下图）。在第二个脉冲期间启动的起源具有仅绿色模式（图2B，上图），有时称为新启动的起源，因此这些起源可以与在第一个脉冲期间启动的起源区分开来。比较两种实验条件之间新烧制起源的相对百分比，可以了解细胞如何对DNA损伤剂或蛋白质的存在与否做出反应。当来自相邻复制子的两个复制分支合并时，将创建终止，并且它们具有红-绿-红模式（图 2D）³⁰。

基于上述事实，DNA纤维分析目前被认为是研究由纳米材料等有毒物质引起的DNA复制动力学变化的首选方法。由于这项技术的发现，研究人员现在对真核生物中全基因组DNA复制的动态有了很好的理解和了解，无论是定量还是定性³⁶。根据结果变量，可以采用几种方法。 图3显示了研究由外部试剂/纳米颗粒诱导的DNA损伤变化的一些方法示例。本研究中描述的DNA纤维分析方法的总体目标是确定纳米颗粒如何影响 体外 复制过程以及它们如何差异化地影响各种组织。

研究方案

1. 抗体和缓冲液的制备

1. 制备一抗溶液，小鼠抗BrdU在5%BSA中以1:300稀释，大鼠抗BrdU在5%BSA中以1:500稀释。
2. 制备二抗溶液，在5%BSA中以1:300稀释的alexafluor 594兔抗小鼠和在5%BSA中以1:500稀释的alexafluor 488鸡抗鼠。
3. 制备三级抗体溶液，在5%BSA中以1:1,000稀释度制备alexafluor 594山羊抗兔剂和在5%BSA中以1:1,000稀释度制备alexafluor 488山羊抗鸡药。
4. 在 ddH₂O 中制备 10 mL 裂解缓冲液，加入 2 mL 1M Tris （pH 7.4）、1 mL 0.5 M EDTA 和 0.5 mL 10% SDS。

2. 纤维测定的准备

1. 第1天:纤维测定的细胞培养和纳米材料处理
   1. 板RAW 264.5巨噬细胞或感兴趣的细胞，使细胞在实验当天处于其生长的对数期。对于RAW细胞，针对每种条件向24孔板中添加5 x 10⁴细胞/孔。将细胞保持在37°C培养箱中，CO₂为5%，湿度为98%。表 1 描述了所用介质的成分。让细胞生长到75%-80%汇合度^17,37。
   2. 细胞达到75%-80%汇合度后，从平板中取出培养基，取一半培养基并将其保留用于CldU脉冲（CldU储备），并以50μM的终浓度向另一半加入5μL IdU。 混合并将含IdU的培养基加回平板中。将带有IdU的细胞放入培养箱中20分钟。
   3. 将CldU储备培养基置于37°C以保持预热。在CldU脉冲之前将CldU添加到该培养基中。
   4. 20分钟后，吸出IdU培养基混合物，并通过轻轻旋转板，用500μL磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）轻轻洗涤细胞。丢弃 PBS。
   5. 在500μL培养基中用不同浓度的纳米颗粒处理细胞，并再孵育30分钟。对于本研究，使用浓度为 25 μg/mL 的处理过的氧化石墨烯纳米颗粒。
   6. 吸出处理培养基混合物，并通过轻轻旋转板用 500 μL PBS 轻轻洗涤细胞。丢弃 PBS。加入 5 μL CldU（最终 100 μM
   7. 浓度）到CldU储备培养基，并用CldU储备培养基覆盖细胞。将细胞置于培养箱中CldU脉冲20分钟。
   8. 用PBS洗涤细胞，刮掉或胰蛋白酶消化3-4分钟，然后将5mL培养基加入板中，并收集细胞。
   9. 以 264 x g 旋转 4 分钟。取出培养基，并将细胞重悬于 1 mL 冰冷的 PBS 中。使用台盼蓝测定法（血细胞计数器计数）确定细胞数量，然后将细胞稀释至~200-400个细胞/μL。 在细胞计数过程中将细胞悬液保持在冰上。
      注意:如果可能，限制细胞在冰上放置的时间。这可能有助于沿载玻片顶部获得细胞溶液珠。如果将它们放在冰上，请保持它们少于 30 分钟。
2. 第1天:DNA纤维的制备
   1. 用铅笔在载玻片（载玻片，75 mm x 25 mm）上标记实验条件和日期。
   2. 在移液管中取 2 μL 细胞，以 ~45° 角握住移液器，将移液器置于玻片标签下方约 1 cm 处，然后将移液器水平移动到玻片标签上。当移液器在载玻片上移动时，一次释放少量细胞溶液。在每张幻灯片上制作多行单元格（关键步骤）。
      注意:载玻片上应有一条水平的细胞悬液线。如果细胞悬液珠状，则将 5-10 μL 细胞培养基添加到具有细胞悬液的容器中，因为这有助于溶液在再次应用时粘附在载玻片上。
   3. 让带有细胞的溶液蒸发，直到溶液看起来粘稠和粘稠。在这一点上，一些液体与细胞有关，但不多。此步骤需要 8-20 分钟，并根据空气中的湿度而变化。
      注意:确保所有溶液都没有蒸发，因为这使得很难获得直的和对齐的DNA纤维，因为大多数（如果不是全部）DNA将粘在一起并且无法分离。
   4. 当溶液发粘时，每行细胞用 15 μL 扩散（裂解）缓冲液覆盖细胞，注意不要让移液器吸头接触载玻片。等待10分钟。将载玻片倾斜 25° 角，然后将载玻片的标签水平放置在试管架的边缘上（标签的底部应与试管架的边缘对齐）。
   5. 让DNA扩散从制作最后一张载玻片开始风干至少4小时。
      注意:4小时至12小时的时间有利于干燥。但是，不要让它们过夜干燥。如果让干燥过夜，会有很多松弛的DNA，但很少有直的和对齐的DNA纤维。
3. 第 1 天:固定 DNA 纤维和冷冻
   1. 载玻片干燥后，将载玻片浸入2分钟，用甲醇:乙酸（3:1）固定载玻片。在引擎盖下执行此步骤，让载玻片在光照有限的区域干燥过夜，或用锡箔帐篷盖住载玻片。
4. 第二天
   1. 将载玻片放在载玻片托架中。将载玻片在-20°C下放置至少24小时。此步骤可提高图像的分辨率或清晰度。

3. 进行DNA纤维测定

1. 脱氧核糖核酸变性
   1. 使用带盖的小移液器吸头盒准备一个加湿室。用水将容器装满一半，并将它们置于37°C水浴中至少1小时。
   2. 将载玻片从-20°C取出，解冻几秒钟。小心地将载玻片放入装有去离子（DI）水的Coplin罐中，以使涂层表面不会接触罐壁。将载玻片孵育20秒，然后小心地倒出水。
   3. 将 2.5 M HCL 添加到 Coplin 罐中，使其覆盖所有载玻片。等待80分钟。这是协议中的关键步骤。时间的变化可以改变图像的结果。
   4. 用PBS加吐温（PBS + 0.1%吐温[终浓度]）洗涤载玻片1次，然后在室温（RT）下用PBS洗涤2次，每次3分钟。
2. 免疫染色
   1. 将载玻片保存在加湿室中以进行以下步骤。在室温下将载玻片在PBS中的5%BSA中封闭30分钟，并用盖玻片，由蛋白质印迹袋制成的盖玻片或透明塑料片覆盖它们。
   2. 封闭后，小心地取出盖玻片，取出封闭溶液，然后将载玻片吸干在纸巾上（点击毛巾上的载玻片）以除去多余的封闭溶液。
   3. 沿载玻片长度加入 100 μL 一抗溶液。添加新的塑料盖玻片，等待2小时。添加盖玻片时，请确保没有气泡形成。
   4. 2小时后，敲掉抗体溶液，并在室温下在PBS填充的Coplin罐中冲洗载玻片2x。 每次使用新鲜的PBS清洗载玻片。
   5. 通过沿每张载玻片添加 200 μL（三到四滴）5% BSA 再次阻塞载玻片，并添加塑料盖玻片。等待15分钟。
   6. 取下盖玻片，在纸巾上敲掉多余的BSA，并沿载玻片长度加入100μL二抗溶液。加入新的塑料盖玻片，等待1小时。
   7. 取下盖玻片，在纸巾上敲掉多余的BSA，然后在室温下在PBS中清洗载玻片2次。
   8. 通过沿每张载玻片添加 200 μL（三到四滴）5% BSA 再次阻塞载玻片，并添加塑料盖玻片。等待15分钟。
   9. 如果需要，取下盖玻片，在纸巾上去除多余的BSA，并沿载玻片的长度添加100μL叔抗溶液。添加新的塑料盖玻片，等待30分钟。
   10. 用PBS 3x清洗载玻片。去除多余的PBS，让它们完全干燥。
   11. 干燥后，加入封片剂，并小心地将玻璃盖玻片（24 mm x 60 mm）放在封片剂上，以避免气泡。重新标记幻灯片，并将它们放在黑暗中过夜。

4. 图像采集

1. 使用配备摄像头、60 倍物镜和适当滤光片组的免疫荧光显微镜可视化免疫染色的 DNA 纤维，以检测 alexafluor 488 和 594 染料。
2. 在纤维分离良好且未缠绕的区域拍摄图像进行分析。在载玻片的不同区域捕获图像非常重要，因为仅在载玻片的一个部分拍摄图像可能无法提供有关载玻片上发现的所有复制中间体的代表性数据。
3. 如果可能，从载玻片上的 20 个不同区域获取光纤图像。仅使用一个通道选择拍摄图像的区域以避免偏差。

结果

获得足够的图像（每个条件20-100张图像）后，需要识别，测量和计数复制中间体。无论是手动分析纤维还是通过程序自动分析纤维³⁸，都必须明确定义纤维必须具有哪些特性才能对其进行计数或评分（或不计数或测量）³⁹。例如，可以考虑以下问题。（1）是否应该只测量和计数整个纤维中具有100%免疫荧光的纤维，或者它们可以包含一些没有免疫荧光的区?...

讨论

我们在这里讨论一种方法，以帮助通过DNA纤维测定分析在纳米颗粒存在下DNA复制动力学的变化。标准测定中涉及的主要关键步骤在协议中描述（步骤2.2.2和步骤3.1.3）。始终建议使用顶部光暴露有限且气流恒定的区域，以防止载玻片中光诱导的DNA断裂并提高可重复性。需要特别注意载玻片上细胞裂解物干燥的持续时间。过度干燥会对纤维扩散产生负面影响。第二个关键步骤是使用酸溶液使纤维变性...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 well plate	Fisher brand	FB012929
Acetic Acid	Sigma Aldrich	695092
Alexa flour 594 goat anti-rabbit	Invitrogen	A11037
Alexa fluor 488 chicken anti-rat	Invitrogen	A21470
Alexa fluor 488 goat anti-chicken	Invitrogen	A11039
Alexa fluor 594 rabbit anti-mouse	Invitrogen	A11062
BSA	Sigma Aldrich	A2153
CldU	Sigma Aldrich	50-90-8
Coverslips (22 x 50 mm)	Fisher brand	12-545-EP
EDTA	Fisher Scientific	15575020
Frosted Microscope Slides	Fisher brand	12-550-11
Hydrochloric Acid	Sigma Aldrich	320331
IdU	Sigma Aldrich	54-42-2
Methanol	Fisher Scientific	A454-4
Mouse Anti-BrdU	BD Biosciences	347580
Phosphate Buffer Saline	Gibco	10010072
Rat anti-BrdU	Abcam	BU1--75(ICR1)
Raw 264.5 macrophage cells	ATCC	TIB-71
SDS	Sigma Aldrich	L3771
Silane-Prep slides	Sigma Aldrich	S4651-72EA
Superfrost gold plus slides	Fischer scientific	22-035813
Tris pH 7.4	Sigma Aldrich	77861
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416