Dimostrazione del saggio delle fibre di DNA per lo studio del danno al DNA e delle dinamiche di riparazione indotte dalle nanoparticelle

Riepilogo

La metodologia assiste nell'analisi della variazione nelle dinamiche di replicazione del DNA in presenza di nanoparticelle. Diverse metodologie possono essere adottate in base al livello di citotossicità del materiale di interesse. Inoltre, viene fornita una descrizione dell'analisi delle immagini per aiutare nell'analisi delle fibre del DNA.

Abstract

L'esposizione ai nanomateriali può causare stress da replicazione e instabilità genomica nelle cellule. Il grado di instabilità dipende dalla chimica, dalle dimensioni e dalla concentrazione dei nanomateriali, dal tempo di esposizione e dal tipo di cellula esposta. Diversi metodi consolidati sono stati utilizzati per chiarire come gli agenti endogeni / esogeni influenzano la replicazione globale. Tuttavia, i saggi a livello di replica, come il test delle fibre di DNA, sono indispensabili per capire come questi agenti influenzano l'inizio della replicazione, le terminazioni e la progressione della forcella di replicazione. Sapere questo permette di capire meglio come i nanomateriali aumentino le possibilità di fissazione delle mutazioni e di instabilità genomica. Abbiamo usato macrofagi RAW 264.7 come cellule modello per studiare le dinamiche di replicazione sotto l'esposizione alle nanoparticelle di ossido di grafene. Qui, dimostriamo il protocollo di base per il test delle fibre di DNA, che include l'etichettatura degli impulsi con analoghi nucleotidici, la lisi cellulare, la diffusione delle fibre di DNA marcate con impulso su vetrini, l'immunocolorazione fluorescente degli analoghi nucleotidici all'interno delle fibre di DNA, l'imaging degli intermedi di replicazione all'interno delle fibre del DNA utilizzando la microscopia confocale e l'analisi intermedia della replica utilizzando un software di punteggio e analisi assistita da computer (CASA).

Introduzione

Durante ogni ciclo cellulare, la replicazione del DNA garantisce un'accurata duplicazione del genoma¹. La replicazione cromosomica eucariotica dipende essenzialmente da tre fattori: la tempistica dell'attivazione di più origini di replicazione, la velocità delle forcelle che emergono dalle origini sparate e la cessazione del processo di replicazione quando due forcelle di replicazione da origini adiacenti si incontrano². Per la trasmissione ad alta fedeltà delle informazioni genetiche alle cellule figlie, nonché per la conservazione dell'integrità genetica, è fondamentale un'accurata replicazione del DNA. Gli agenti che si sviluppano dal metabolismo regolare o sono dovuti a materiali ambientali artificiali o naturali attaccano costantemente il genoma. Questi agenti endogeni ed esogeni causano il rallentamento o l'arresto delle forcelle di replicazione a causa del danno al DNA causato da questi agenti e le forcelle che rallentano temporaneamente o si fermano in risposta a queste difficoltà sono chiamate stress di replicazione³. In risposta allo stress di replicazione, le cellule hanno sviluppato diversi percorsi molecolari che mantengono la stabilità delle forcelle di replicazione disturbate e consentono loro di ricominciare⁴. In termini di stabilità genetica, sopravvivenza cellulare e malattie umane, questi meccanismi di risposta allo stress di replicazione sono emersi come fattori chiave per mantenere un genoma sano, garantire la sopravvivenza cellulare e ridurre la probabilità di formazione di malattie⁵.

Uno degli agenti esogeni in grado di produrre stress di replicazione sono le nanoparticelle. Le nanoparticelle sono particelle di dimensioni variabili da 1 nm a 100 nm⁶. Grazie alle loro elevate aree superficiali, alle forme distintive e alle proprietà chimiche uniche, le nanoparticelle sono utilizzate in varie applicazioni mediche, farmaceutiche, ambientali e industriali ^7,8. Mentre le nanoparticelle hanno molti potenziali benefici, alcune di esse (a causa della loro natura ereditaria o longevità) possono diventare tossiche. Le nanoparticelle possono anche formarsi a causa dell'usura naturale degli impianti medici ed essere rilasciate nella regione peri-protesica ^9,10.

A causa dell'esposizione degli esseri umani a una miriade di nanoparticelle prodotte per varie applicazioni, la ricerca nel campo della tossicità delle nanoparticelle è aumentata enormemente negli ultimi 10 anni¹¹. Mentre questi sforzi di ricerca hanno rivelato informazioni in abbondanza sulla potenziale minaccia che le nanoparticelle rappresentano per la salute umana, la conoscenza del potenziale delle nanoparticelle di causare genotossicità è ancora limitata. Ciò che è stato scoperto finora è che queste nanoparticelle possono interagire fisicamente con il DNA, promuovere danni al DNA e danneggiare o interferire con le proteine responsabili della riparazione o della replicazione del DNA¹². Per rilevare come interferiscono con la replicazione del DNA, la pettinatura delle fibre del DNA, la sintesi del DNA radioresistente (RDS) e l'analisi delle fibre del DNA vengono in genere utilizzate^13,14,15,16.

Il metodo di pettinatura delle fibre di DNA è flessibile e fornisce informazioni sulla dinamica della forcella di replicazione a livello di singola molecola¹⁷. In sostanza, un coprislip salinizzato viene delicatamente prelevato dalla soluzione di DNA una volta che le estremità del DNA si legano ad esso. Le molecole di DNA sono raddrizzate e allineate dal menisco della soluzione. L'omogeneità, la spaziatura e l'allineamento delle fibre di DNA supportano misurazioni accurate e affidabili della lunghezza del tratto di fibre. Regolando la lunghezza e la sequenza dei trattamenti e dei farmaci utilizzati per causare stress o danni, molti aspetti dell'avanzamento della forcella possono essere monitorati utilizzando questa applicazione. In questo metodo, viene utilizzato un doppio sistema di etichettatura, attraverso il quale vengono valutate la velocità e la progressione della forcella di replica^17,18. D'altra parte, l'elettroforesi su gel 2D sfrutta il fatto che, nell'elettroforesi su gel di agarosio, le strutture di DNA ramificate viaggiano più lentamente delle molecole di DNA lineari della stessa massa, consentendo la separazione pulita dei due in una corsa 2D. Infatti, questo metodo è studiato per segregare le molecole di DNA in base alla loro massa nella prima corsa e in base alla loro forma nella seconda corsa ortogonale. Dopo la frammentazione del DNA genomico, gli intermedi di replicazione e ricombinazione non comuni sviluppano una forma ramificata e possono essere distinti dalle molecole lineari più comuni nel gel 2D¹⁹.

Il metodo RDS viene utilizzato per determinare come viene influenzata la sintesi globale del DNA. In questo metodo, il grado di inibizione della replicazione globale è determinato confrontando la quantità di nucleotidi marcati radioattivamente incorporati, come [14C] timidina, in cellule non trattate rispetto a quelle trattate^14,20. La differenza percentuale nella radiomarcatura tra le cellule non trattate e trattate rappresenta il grado in cui l'agente dannoso per il DNA influisce sulla sintesi del DNA. Analogamente a questo, un altro metodo utilizza la capacità delle cellule di integrare analoghi nucleotidici come BrdU (5-bromo-2′-deossiuridina) per la citometria a flusso per misurare i tassi complessivi di sintesi del DNA^21,22. Mentre questi metodi dimostrano come gli agenti dannosi del DNA influenzano la sintesi globale del DNA, non mostrano come i singoli replicons sono influenzati. In effetti, i saggi a livello di replicon sono indispensabili per comprendere meglio l'inizio e l'entità dell'instabilità genomica in caso di esposizione a particelle tossiche (nanomateriali). L'autoradiografia delle fibre del DNA e la microscopia elettronica sono alcuni metodi utilizzati per determinare questo^23,24,25,26.

I concetti di bolle di replicazione e replicazione bidirezionale da sorgenti distanti in modo non uniforme sono stati inizialmente sviluppati utilizzando test a singola molecola come la microscopia elettronica e l'autoradiografia delle fibre di DNA^27,28. L'osservazione diretta di intermedi di replicazione ramificati su molecole specifiche disperse attraverso una griglia rivestita di carbonio è notevolmente facilitata dalla microscopia elettronica. Questo metodo, che è ancora in uso oggi per tracciare i cambiamenti patologici alle forche di replicazione, è stato utilizzato per localizzare la prima origine eucariotica della replicazione del DNA²⁸. L'autoradiografia a fibra è incentrata sul concetto di identificazione autoradiografica di aree di nuova replicazione e sulla marcatura del polso dei cromosomi con timidina triziata. La prima valutazione quantitativa delle densità di origine e dei tassi di forcella di replicazione nelle sequenze genomiche dei metazoi è stata resa possibile dall'autoradiografia delle fibre di DNA²⁹.

Attualmente, i metodi di fluorografia delle fibre hanno preso il posto dell'autoradiografia, principalmente perché la fluorografia delle fibre è molto più veloce dell'autoradiografia. Nella fluorografia delle fibre, due derivati nucleotidici alogenati, come bromo- (Br), cloro- (Cl) o iododeossiuridina (IdU), sono incorporati sequenzialmente nel DNA appena replicato e quindi identificati mediante immunofluorescenza indiretta utilizzando anticorpi³⁰. La visione microscopica del DNA nascente che ha incorporato uno o entrambi gli analoghi è resa possibile dall'immunocolorazione di uno degli analoghi in un colore e dell'altro analogo in un colore diverso (ad esempio, immunocolorazione del DNA nascente con rosso IdU incorporato e verde CldU incorporato) (Figura 1)²¹. Molti diversi tipi di intermedi di replicazione possono essere identificati dall'analisi delle fibre del DNA. I più comunemente studiati sono le singole forcelle allunganti, iniziazioni e terminazioni. Le singole forcelle allunganti hanno un modello di replicazione di rosso seguito da verde (rosso-verde; Figura 2A). ¹³ Le lunghezze di questi intermedi sono frequentemente utilizzate per misurare la velocità della forcella (cioè la lunghezza della forcella/tempo dell'impulso) o la degradazione esonucleolitica del DNA nascente attraverso l'accorciamento della traccia (Figura 2E)^30,31,32. In uno studio di Mimitou et al., è stato scoperto che dopo l'esposizione a lungo termine all'idrossiurea, un veleno di replicazione che causa rotture a doppio filamento nel DNA, RE11 è stato reclutato³³. MRE11 è un'esonucleasi nota per la sua attività di esonucleasi 3'-5' ed è in grado di tagliare le estremità del DNA per la riparazione. Pertanto, quando esposti ad agenti tossici, si può osservare la degradazione esonucleolitica del DNA nascente, che è l'accorciamento del filamento di DNA dovuto all'esposizione a un agente dannoso per il DNA³⁴.

Le rotture della forcella di replicazione causate da ostruzioni fisiche (complessi DNA-proteina o lesioni del DNA), impedimenti chimici o mutazioni possono arrestare la replicazione e richiedere una ricombinazione omologa per riavviarla. Questo è noto come progressione della forcella compromessa. Numerose indagini in vitro e in vivo hanno indicato che la trascrizione può, occasionalmente, impedire l'avanzamento della forcella di replicazione in questo modo³⁵.

Le iniziazioni sono origini di replica che iniziano e si attivano durante il primo o il secondo impulso. Le origini che si attivano durante il primo impulso e hanno forcelle di replica che continuano ad essere attive hanno un pattern verde-rosso-verde (Figura 2B, in basso). Le origini che iniziano durante il secondo impulso hanno un modello solo verde (Figura 2B, in alto) e sono talvolta chiamate origini appena iniziate, quindi quelle origini possono essere differenziate da quelle che iniziano durante il primo impulso. Il confronto delle percentuali relative di origini appena cotte tra due condizioni sperimentali permette di capire come una cellula risponde a un agente dannoso per il DNA o la presenza o l'assenza di una proteina. Le terminazioni vengono create quando due fork di replica da replicons adiacenti si uniscono e hanno un pattern rosso-verde-rosso (Figura 2D)³⁰.

Sulla base dei fatti sopra descritti, l'analisi delle fibre di DNA è attualmente considerata un metodo preferito per studiare la variazione delle dinamiche di replicazione del DNA causata da agenti tossici come i nanomateriali. I ricercatori hanno ora una buona comprensione e conoscenza delle dinamiche della replicazione del DNA a livello di genoma negli eucarioti, sia quantitativamente che qualitativamente, grazie alla scoperta di questa tecnologia³⁶. Sulla base delle variabili di risultato, possono essere adottate diverse metodologie. Alcuni esempi di metodi per studiare le variazioni del danno al DNA indotto da agenti esterni/nanoparticelle sono mostrati nella Figura 3. L'obiettivo generale del metodo di analisi delle fibre di DNA descritto in questo studio è determinare come le nanoparticelle influenzano il processo di replicazione in vitro e come influenzano in modo differenziale i vari tessuti.

Protocollo

1. Preparazione di anticorpi e tampone

1. Preparare la soluzione anticorpale primaria, l'anti-BrdU del topo ad una diluizione di 1:300 in BSA al 5% e l'anti-BrdU di ratto ad una diluizione di 1:500 in BSA al 5%.
2. Preparare la soluzione anticorpale secondaria, alexafluor 594 coniglio anti-topo ad una diluizione 1:300 in 5% BSA e alexafluor 488 pollo anti-ratto ad una diluizione 1:500 in 5% BSA.
3. Preparare la soluzione anticorpale terziaria, alexafluor 594 capra anti-coniglio ad una diluizione 1:1.000 in 5% BSA e alexafluor 488 capra anti-pollo ad una diluizione 1:1.000 in 5% BSA.
4. Preparare 10 mL di tampone di lisi in ddH 2 O con₂mL di 1M Tris (pH 7,4), 1 mL di 0,5 M EDTA e 0,5 mL di 10% SDS.

2. Preparazione per il dosaggio delle fibre

1. Giorno 1: Coltura cellulare e trattamento con nanomateriali per il saggio delle fibre
   1. Piastra RAW 264,5 cellule macrofagiche o le cellule di interesse, in modo che le cellule siano nella fase logaritmica della loro crescita il giorno dell'esperimento. Per le celle RAW, aggiungere 5 x 10⁴ celle / pozzetto a piastre da 24 pozzetti per ogni condizione. Mantenere le celle in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO₂ e il 98% di umidità. La tabella 1 descrive i componenti dei mezzi utilizzati. Lasciare che le cellule crescano fino al 75%-80% di confluenza^17,37.
   2. Dopo che le celle raggiungono il livello di confluenza del 75%-80%, rimuovere il mezzo dalle piastre, prendere metà del mezzo e riservarlo per l'impulso CldU (riserva CldU) e aggiungere 5 μL di IdU all'altra metà ad una concentrazione finale di 50 μM. Mescolare e aggiungere nuovamente il mezzo contenente IdU alle piastre. Posizionare le celle con IdU nell'incubatore per 20 minuti.
   3. Posizionare il mezzo di riserva CldU a 37 °C per mantenerlo preriscaldato. Aggiungi CldU a questo mezzo appena prima dell'impulso CldU.
   4. Dopo 20 minuti, aspirare la miscela IdU-medium e lavare delicatamente le cellule con 500 μL di soluzione salina tamponata fosfato (PBS, pH 7,4) ruotando delicatamente la piastra. Scartare il PBS.
   5. Trattare le cellule con varie concentrazioni di nanoparticelle in 500 μL del mezzo e incubare per altri 30 minuti. Per questo studio, utilizzare nanoparticelle di ossido di grafene trattate a una concentrazione di 25 μg / ml.
   6. Aspirare la miscela del mezzo di trattamento e lavare delicatamente le celle con 500 μL di PBS ruotando delicatamente la piastra. Scartare il PBS. Aggiungere 5 μL di CldU (100 μM finale
   7. concentrazione) al mezzo di riserva CldU e coprire le cellule con il mezzo di riserva CldU. Posizionare le celle nell'incubatore per la durata dell'impulso CldU per 20 minuti.
   8. Lavare le cellule con PBS, raschiare via o tripsinizzare per 3-4 minuti, quindi aggiungere 5 ml di terreno alla piastra e raccogliere le cellule.
   9. Girare a 264 x g per 4 min. Rimuovere il mezzo e risospendere le cellule in 1 mL di PBS ghiacciato. Determinare il numero di cellule utilizzando un test di tripano blu (conteggio emocitometrico), quindi diluire le cellule a ~ 200-400 cellule / μL. Mantenere la sospensione cellulare sul ghiaccio durante il conteggio delle cellule.
      NOTA: Se possibile, limitare il tempo in cui le celle rimangono sul ghiaccio. Questo può aiutare a ottenere una soluzione cellulare lungo la parte superiore del vetrino. Se sono tenuti sul ghiaccio, tenerli in posa per meno di 30 minuti.
2. Giorno 1: Preparazione delle fibre del DNA
   1. Utilizzando una matita, etichettare i vetrini (vetrino, 75 mm x 25 mm) con la condizione sperimentale e la data.
   2. Prelevare 2 μL di celle in una pipetta, tenere la pipetta con un angolo di ~45°, posizionare la pipetta circa 1 cm sotto l'etichetta del vetrino e spostare la pipetta orizzontalmente sull'etichetta del vetrino. Mentre la pipetta si sposta sul vetrino, rilasciare un po' della soluzione cellulare alla volta. Creare più righe di celle in ogni diapositiva (passaggio critico).
      NOTA: dovrebbe esserci una linea orizzontale di sospensione cellulare attraverso la diapositiva. Se la sospensione cellulare si gonfia, aggiungere 5-10 μL di mezzo cellulare al contenitore che ha la sospensione cellulare, poiché ciò potrebbe aiutare la soluzione ad aderire al vetrino quando viene nuovamente applicata.
   3. Lasciare che la soluzione con le cellule evapori fino a quando la soluzione appare appiccicosa e appiccicosa. A questo punto, un po 'di liquido è associato alle cellule, ma non molto. Questo passaggio richiede 8-20 minuti e varia a seconda di quanta umidità c'è nell'aria.
      NOTA: Assicurarsi che tutta la soluzione non sia evaporata, poiché ciò rende molto difficile ottenere fibre di DNA dritte e allineate poiché la maggior parte, se non tutto, del DNA sarà incollato insieme e non sarà in grado di separarsi.
   4. Quando la soluzione è appiccicosa, sovrapporre le cellule con 15 μL di tampone di diffusione (lisi) per ogni linea di cellule, facendo attenzione a non lasciare che la punta della pipetta tocchi il vetrino. Attendere 10 min. Inclinare la diapositiva con un angolo di 25° e posizionare l'etichetta della diapositiva orizzontalmente contro il bordo di un rack portatubi (la parte inferiore dell'etichetta deve allinearsi con il bordo del rack tubiero).
   5. Lasciare asciugare il DNA all'aria per un minimo di 4 ore dal momento in cui sono state fatte le ultime diapositive.
      NOTA: Un periodo da 4 h a 12 h è buono per l'asciugatura. Tuttavia, non lasciarli asciugare durante la notte. Se lasciato asciugare durante la notte, ci sarà molto DNA rilassato ma pochissime fibre di DNA dritte e allineate.
3. Giorno 1: Fissaggio delle fibre del DNA e congelamento
   1. Una volta asciugati i vetrini, fissare i vetrini con metanolo:acido acetico (3:1) immergendo i vetrini per 2 min. Esegui questo passaggio sotto un cappuccio e lascia asciugare i vetrini durante la notte in un'area con esposizione alla luce limitata o copri i vetrini con una tenda di stagnola.
4. Giorno 2
   1. Posizionare le diapositive in un portavetri. Posizionare i vetrini a -20 °C per un minimo di 24 ore. Questo passaggio migliora la risoluzione o la nitidezza dell'immagine.

3. Esecuzione del test delle fibre del DNA

1. Denaturazione del DNA
   1. Preparare una camera umidificata utilizzando piccole scatole di punta per pipette con coperchi. Riempire a metà i contenitori con acqua e metterli a bagnomaria a 37 °C per almeno 1 ora.
   2. Estrarre i vetrini da -20 °C e scongelarli per alcuni secondi. Posizionare con cura i vetrini in un barattolo Coplin contenente acqua deionizzata (DI) in modo che le superfici rivestite non tocchino le pareti del barattolo. Incubare il vetrino per 20 secondi, quindi versare con cura l'acqua.
   3. Aggiungere 2,5 M HCL al barattolo Coplin in modo che copra tutti i vetrini. Attendere 80 min. Questo è un passaggio fondamentale nel protocollo. Un cambiamento nel tempo può cambiare il risultato dell'immagine.
   4. Lavare i vetrini 1x con PBS più Tween (PBS + 0,1% Tween [concentrazione finale]) e poi 2x con PBS per 3 minuti ciascuno a temperatura ambiente (RT).
2. Immunocolorazione
   1. Conservare le diapositive nella camera umidificata per i passaggi successivi. Blocca le diapositive in BSA al 5% in PBS per 30 minuti su RT e coprile con copertine, copertine fatte da un sacchetto Western blot o fogli di plastica trasparente.
   2. Dopo il blocco, rimuovere con attenzione il vetrino, rimuovere la soluzione bloccante e asciugare il vetrino su un tovagliolo di carta (toccare il vetrino sull'asciugamano) per rimuovere la soluzione bloccante in eccesso.
   3. Aggiungere 100 μL della soluzione anticorpale primaria lungo la lunghezza del vetrino. Aggiungi un nuovo copricopertina di plastica e attendi 2 ore. Quando si aggiunge il foglietto, assicurarsi che non si formino bolle.
   4. Dopo 2 ore, eliminare la soluzione anticorpale e sciacquare i vetrini in un barattolo Coplin riempito di PBS 2 volte a RT. Utilizzare PBS fresco ogni volta per lavare i vetrini.
   5. Bloccare nuovamente i vetrini aggiungendo 200 μL (da tre a quattro gocce) di BSA al 5% lungo ogni vetrino e aggiungere un vetrino di plastica. Attendere 15 min.
   6. Togliere il vetrino, eliminare il BSA in eccesso su un tovagliolo di carta e aggiungere 100 μL della soluzione anticorpale secondaria lungo la lunghezza del vetrino. Aggiungi una nuova copertina di plastica e attendi 1 ora.
   7. Togliere il coprifoglio, buttare via il BSA in eccesso su un tovagliolo di carta e lavare le diapositive 2 volte in PBS a RT.
   8. Bloccare nuovamente i vetrini aggiungendo 200 μL (da tre a quattro gocce) di BSA al 5% lungo ogni vetrino e aggiungere un vetrino di plastica. Attendere 15 min.
   9. Se necessario, rimuovere il foglietto, rimuovere l'eccesso di BSA su un tovagliolo di carta e aggiungere 100 μL di soluzione terziaria di anticorpi lungo la lunghezza del vetrino. Aggiungi nuovi coprivetrini di plastica e attendi 30 minuti.
   10. Lavare i vetrini con PBS 3x. Rimuovere il PBS in eccesso e lasciarli asciugare completamente.
   11. Una volta asciutto, aggiungere il supporto di montaggio e posizionare con cura i vetrini di vetro (24 mm x 60 mm) sul supporto di montaggio in modo da evitare bolle. Ri-etichettare le diapositive e lasciarle al buio durante la notte.

4. Acquisizione di immagini

1. Visualizza le fibre di DNA immunocolorate utilizzando un microscopio immunofluorescente dotato di una fotocamera, un obiettivo 60x e set di filtri appropriati per rilevare i coloranti Alexafluor 488 e 594.
2. Scatta immagini per l'analisi in regioni in cui le fibre sono ben separate e non impigliate. È importante acquisire immagini in aree diverse lungo la diapositiva, poiché l'acquisizione di immagini in una sola parte della diapositiva potrebbe non fornire dati rappresentativi relativi a tutti gli intermedi di replica trovati nella diapositiva.
3. Se possibile, ottenere immagini in fibra da 20 regioni diverse su una diapositiva. Utilizzare un solo canale per selezionare le aree per scattare immagini per evitare distorsioni.

Risultati

Dopo aver ottenuto un numero sufficiente di immagini (da 20 a 100 immagini per condizione), gli intermedi di replica devono essere identificati, misurati e contati. Sia che si analizzino le fibre manualmente o automaticamente tramite un programma³⁸, è necessario definire chiaramente quali caratteristiche deve avere una fibra per poter essere contata o segnata (o non contata o misurata)³⁹. Ad esempio, è possibile prendere in considerazione le seguenti domande. (1)...

Discussione

Discutiamo qui un metodo per aiutare nell'analisi della variazione nella dinamica di replicazione del DNA in presenza di nanoparticelle attraverso il saggio delle fibre di DNA. I principali passaggi critici coinvolti nel test standard sono descritti nel protocollo (fase 2.2.2 e fase 3.1.3). Si consiglia sempre di utilizzare un'area con un'esposizione limitata alla luce dall'alto e un flusso d'aria costante per prevenire rotture del DNA indotte dalla luce nei vetrini e per migliorare la riproducibilità. È necessaria un'...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 well plate	Fisher brand	FB012929
Acetic Acid	Sigma Aldrich	695092
Alexa flour 594 goat anti-rabbit	Invitrogen	A11037
Alexa fluor 488 chicken anti-rat	Invitrogen	A21470
Alexa fluor 488 goat anti-chicken	Invitrogen	A11039
Alexa fluor 594 rabbit anti-mouse	Invitrogen	A11062
BSA	Sigma Aldrich	A2153
CldU	Sigma Aldrich	50-90-8
Coverslips (22 x 50 mm)	Fisher brand	12-545-EP
EDTA	Fisher Scientific	15575020
Frosted Microscope Slides	Fisher brand	12-550-11
Hydrochloric Acid	Sigma Aldrich	320331
IdU	Sigma Aldrich	54-42-2
Methanol	Fisher Scientific	A454-4
Mouse Anti-BrdU	BD Biosciences	347580
Phosphate Buffer Saline	Gibco	10010072
Rat anti-BrdU	Abcam	BU1--75(ICR1)
Raw 264.5 macrophage cells	ATCC	TIB-71
SDS	Sigma Aldrich	L3771
Silane-Prep slides	Sigma Aldrich	S4651-72EA
Superfrost gold plus slides	Fischer scientific	22-035813
Tris pH 7.4	Sigma Aldrich	77861
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416