使用DESI-MSI鉴定中药空间代谢组中代谢物的可视化

摘要

本研究提出了一系列从工厂制备DESI-MSI样品的方法，并详细描述了DESI组件安装、MSI数据采集和处理的过程。该协议可以应用于获取植物空间代谢组信息的几种条件。

摘要

中药的药用主要是由于其次生代谢产物。这些代谢物分布的可视化已成为植物科学中的一个关键课题。质谱成像可以提取大量数据，并通过分析组织切片来提供有关这些数据的空间分布信息。解吸电喷雾电离质谱成像（DESI-MSI）具有高通量和高精度的优点，常用于生物学研究和中药研究。然而，本研究中使用的程序很复杂，负担不起。在这项研究中，我们优化了切片和DESI成像程序，并开发了一种更具成本效益的方法来鉴定代谢物的分布，并在植物组织中对这些化合物进行分类，特别关注中药。本研究将促进DESI在中药/民族医学代谢物分析中的应用和研究相关技术的标准化。

引言

代谢物分布的可视化已成为植物科学中的一个关键课题，特别是在传统中医中，因为它揭示了植物内特定代谢物的形成过程。参考传统中药（TCM），它提供有关活性成分的信息，并指导植物部分在制药应用中的应用。通常，代谢物的可视化是通过原位杂交、荧光显微镜或免疫组织化学来实现的，但是这些实验检测到的化合物数量传达的化学信息有限。结合组织染色，质谱成像（MSI）可以通过扫描和分析微米^级1的组织切片，提供大量的数据并提供化合物的空间分布信息。MSI使用分析物从样品表面解吸和电离，然后对产生的气相离子进行质量分析，并应用成像软件来整合信息并绘制记录特定离子丰度的二维图像。该技术可以通过检测靶组织和器官中药物及其诱导代谢物的特征分布来确定外源性和内源性分子²，³，^4，5。

近几十年来，已经开发了各种成像MS模式;其中最突出的是解吸电喷雾电离基MSI （DESI-MSI）、基质辅助激光解吸/电离（MALDI）和二次离子质谱（SIMS）⁶。DESI-MSI由于其常压操作，高通量^{和更高的精度}而通常用于生物学研究7。MALDI已被应用于鉴定转甲状腺素蛋白片段作为庆大霉素的潜在肾毒性生物标志物，并分析在小鼠大脑中管理1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶后神经毒性代谢物1-甲基-4-苯基吡啶的分布8^，9。MALDI和DESI已被用于确定药物诱导的小鼠肾脏中晶体状结构的组成;这些结构主要由由于药物的去甲基化和/或氧化而形成的代谢物组成¹⁰。此外，MSI已被应用于靶器官中药物毒性代谢分布的定位。然而，植物组织中的细胞各不相同，与动物不同，需要特殊的切片程序。

在植物中，通过使用MALDI成像，到目前为止，已经分析了小麦（小麦）茎，大豆（甘氨酸max），水稻（稻（稻）种子，拟南芥花和根以及大麦（Hordeum vulgare）种子中不同化合物的分布11，^12，13，¹⁴，^15，16，^17，18.最近的研究报告，DESI-MSI正在天然药物和产品的代谢物分析中出现，特别是在银杏叶，夫子和青蒿L¹⁹，^20，21等中药中。在这些研究中，制备植物材料样品的方案不同，有些需要更复杂的设备，如冷冻切片机。DESI-MSI对检测样品的表面平整度有严格的要求。在分析动物的器官或组织时，通常通过冷冻切片²²制成样品。然而，冷冻切片的程序复杂且昂贵，并且常用的粘合剂最佳切割温度（OCT）方法在成像时具有很强的信号。此外，中医的药用组织各不相同;例如，丹参的根，在中文中被称为丹参，用于药用，而在紫苏（紫苏）中，叶子被使用^23，24。因此，有必要改进样品制备程序，以促进DESI在中药代谢物分析中的应用。

作为一种多年生草本植物和常用中药， 绣线菊 最初被记录在最古老的医学专著《神农本草经》（中文称为神农本草经）中。在这项研究中，我们优化了切片和DESI成像程序，并开发了一种更具成本效益的方法来鉴定S . miltiorrhiza组织中的分布和分类。这种方法还可以克服与干燥组织相关的缺点 - 它们通常在氮气吹下容易断裂 - 并促进中医的发展。本研究将促进中医/民族医学在研究相关技术方面的标准化。

研究方案

1. 样品制备

1. 从2年生的 丹参 植物（图1A）收集干净的根和叶，并用手直接以约3-5毫米的横截面厚度切片。然后，使用双面胶带将样品粘附在粘附显微镜载玻片上（图1B）。
   注意:确保双面胶带的尺寸大于样品。如果组织干燥，请在切片前将其浸泡在水或4%多聚甲醛中过夜。
2. 将另一个显微镜载玻片放在样品上方，并用像三明治一样的密封膜包裹两个载玻片（图1C）。将夹心样品在-80°C下冷冻至少4小时，然后用以下设置参数将其置于空气真空下2小时（图1D）:疏水阀温度为-75至-82°C，真空计为2.5至3.7Pa。
   注意:包裹密封膜时，请确保两个载玻片平行，以保持样品表面完整。如果植物组织水分含量高，请将空气真空时间延长至3小时。不要超过5小时，否则组织很容易断裂。
3. 将夹心样品储存在-80°C直至分析。在干燥器中将样品置于室温，以避免样品表面冷凝。然后，将样品置于基质应用中。

2. 安装解吸电喷雾电离（DESI）装置

1. 在ESI模式下实现仪器的检测器设置和质量校准;在水-乙腈 （1:1 v/v） 溶液中使用亮氨酸脑啡肽 （LE） 进行检测器设置，并在水异丙醇 （1:1 v/v） 溶液中使用甲酸钠 （NaFA） 进行质量校准。
2. 取出ESI源并将DESI单元安装到质谱仪上。将N₂ 气体供应连接到DESI装置，并将气体压力调节到0.5 MPa左右（图2A）。交换源时无需排气仪器。
3. 在水-甲醇（1:9 v / v）溶液中用LE和甲酸填充5 mL注射器，并将注射器连接到高性能注射泵，为样品中化学物质的电离提供溶剂（图2B）。
4. 将提供毛细管的溶剂连接到注射器和DESI喷雾器（图2C）。提供毛细管的溶剂是标准的75 μm内径和375 μm外径毛细管;它相当狭窄，容易被杂质堵塞，因此扫描过程中使用的溶剂应该是MS级的，并在使用前过滤，以降低堵塞的风险。
5. 启动注射泵并将输注速率设置为 2 μL/min，以获得恒定的流量和溶剂喷雾（图 2B）。关闭N₂ 气阀，然后在大约15秒后将其打开;一小滴溶剂将被吹到载物台上，如果溶剂流动处于恒定状态，则可以看到喷雾。
6. 根据喷雾角度、XYZ 轴、突起和高度调整喷雾器的位置（图 2D）。使用红色和黑色标记作为参考来优化质谱信号，在灵敏度模式下获得高于 1 x 10^{5 的} 信号强度（图 2E）。
   1. 喷雾器的突出是影响信号强度的最重要因素;通过使用 2 mm 扳手更换 N₅ 气体护罩来调整突起。喷雾方向影响质量图像的质量;旋转喷雾器，直到喷雾笔直。一旦突出部分调整到最佳信号强度位置，在交换信号源时尽量不要改变它。
7. 完成上述所有步骤后，设置已准备好进行实验，并且在初始设置后观察到，设置通常稳定>3周的可用性。

3. 德西-质谱图像采集

1. 对于 DESI-MSI，不进行样品预处理。对于已经进行预处理的样品，请尽可能减少预处理步骤。例如，有些样品只能使用封片剂制作，因此请尽可能去除载玻片上多余的培养基。
2. 在载玻片上拍摄样品的图像（图3A）。请勿触摸样品表面，以免吸入任何杂质。
3. 将载玻片放在DESI载物台上的板位置上。舞台有两个板位置，A 和 B;记住正确的位置很重要。使用标准载玻片 （75 mm x 25 mm） 或全载玻片，否则载玻片将无法安装在该位置且无法稳定握持。一个完整的载玻片（120 mm x 80mm）最多可容纳四个载玻片，因此实验面积要大得多。
4. 打开高清海量图像处理软件，在采集选项卡中设置新印版，选择正确的印版位置（A或B）和印版类型。在图像选择页面上，选择幻灯片的四个角，然后将图像自动调整到正确的方向（图 3A）。
5. 设置 MS 参数;常用的实验类型是DESI-MS模式，在该模式下，仅检测母离子。该仪器在一个实验中只能使用一个极性;因此，选择极性为正极或负极。要获得有关少量化学品的更多信息，请应用灵敏度模式（图3B）。
6. 绘制一个矩形以在"图案"选项卡中定义扫描区域并设置像素大小。通常，对于 DESI-MS 模式，请保持像素的 X 和 Y 大小相等。将扫描速率设置为不超过像素大小的5倍（图3C）。
7. 保存项目并导出质谱采集软件的工作表。
8. 打开质谱采集软件，导入工作表，并将其另存为新的样品列表。按开始 运行以开始 MSI 扫描。可以通过导入更多工作表将多个图像添加到实验队列中。

4. 处理 DESI-MSI 数据和可视化

1. 将样品的数据文件加载到大量图像处理软件中，并设置DESI图像处理的参数（图3D）。由于亮氨酸脑啡肽用于内部锁定质量，并且锁定质量是识别实验极性的唯一点，因此设置正确的锁定质量非常重要。设置以下值:对于正模式:556.2772;对于负模式:554.2620。
2. 可以建立目标化学品清单，在这种情况下，处理结果将集中在目标清单中的化学品上。加载处理后的数据文件以可视化样品的DESI图像。单击"归一化"按钮通过总离子色谱（TIC）对数据进行归一化，以获得特定化学物质与参考的相对强度，然后可以将不同的样品相互比较（图3E）。
3. 绘制感兴趣区域（ROI）并在样本图像上复制多个副本;可以在不同的图像上进行投资回报。选择所有 ROI 并导出多变量分析 （MVA） 以从 MVA 的所有 ROI 中提取 MS 信息（图 3F）。

结果

该协议可以导致植物样品中化合物的鉴定和分布。在特定m/z的MS图像中，每个像素的颜色代表m/z的相对强度，因此可以与整个样品中代谢物离子的自然分布和丰度相关联。收集位置的化学物质丰度越高，颜色越亮。图片中的条形图（图4A-D）显示了颜色的渐变。在这里，我们选择了两种对S. miltiorrhiza的药用有价值的化合物。如图4A-D所示，目标?...

讨论

MS技术的出现开启了近年来分子水平天然产物研究的新见解²⁴。该质谱仪具有高灵敏度和高通量，即使在痕量浓度^为25的情况下，也能对天然产物中的代谢物进行靶向和非靶向分析。因此，MS目前广泛应用于中药（TCM）化学领域。对中药化学成分进行定性和定量研究，可以提供中药成分及其相关化合物的信息，不仅为药理学研究提供了适宜的参考，而且为构建中?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Propanol	Fisher	CAS:67-63-0	HPLC grade
Acetonitrile	Sigma-aldrich	Number-75-05-8	LC-MS grade
Adhesion Microscope slides	Citotest scientific	80312-3161	Microscope glass slides  can adhere to  the sample
Air cooled dry vacuum pump	EYELA	FDU-2110	Air-vaccum equipment at -80°C
Formic Acid	ACS	F1089 | 64-18-6	LC-MS grade
LE (Leucine Enkephalin)	Waters	186006013-1	LC-MS grade
Methanol	Sigma-aldrich	Number-67-56-1	LC-MS grade
Parafilm	Bemis Company	sc-200288	Laboratory Sealing Film
Paraformaldehyde	Sigma-aldrich	V900894	Reagent grade
Q-Tof Mass Spectrometer with DESI source	Waters	Synapt XS