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요약

본 연구에서는 플랜트에서 DESI-MSI 샘플을 준비하기 위한 일련의 방법을 제시하고, DESI 어셈블리 설치, MSI 데이터 수집 및 처리 절차를 상세히 설명한다. 이 프로토콜은 식물에서 공간 대사체 정보를 획득하기 위한 여러 조건에 적용될 수 있습니다.

초록

중국 전통 의학의 의약 사용은 주로 2 차 대사 산물 때문입니다. 이러한 대사 산물의 분포를 시각화하는 것은 식물 과학에서 중요한 주제가 되었습니다. 질량 분석 이미징은 조직 조각을 분석하여 방대한 양의 데이터를 추출하고 이에 대한 공간 분포 정보를 제공할 수 있습니다. 높은 처리량과 더 높은 정확도의 장점으로 탈착 전기분무 이온화 질량 분석 이미징(DESI-MSI)은 생물학 연구 및 중국 전통 의학 연구에 자주 사용됩니다. 그러나 이 연구에 사용된 절차는 복잡하고 저렴하지 않습니다. 이 연구에서 우리는 절편 및 DESI 이미징 절차를 최적화하고 특히 중국 전통 의약품에 중점을 두고 대사 산물의 분포를 식별하고 식물 조직에서 이러한 화합물을 분류하는 보다 비용 효율적인 방법을 개발했습니다. 이 연구는 연구 관련 기술을 위한 중국 전통 의학/민족 의학의 대사 산물 분석 및 표준화에서 DESI의 활용을 촉진할 것입니다.

서문

대사 산물 분포의 시각화는 식물 내 특정 대사 산물의 형성 과정을 공개하기 때문에 식물 과학, 특히 중국 전통 의학에서 중요한 주제가 되었습니다. 중국 전통 의학(TCM)과 관련하여 활성 성분에 대한 정보를 제공하고 제약 응용 분야에서 식물 부분의 적용을 안내합니다. 일반적으로 대사 산물의 시각화는 현장 혼성화, 형광 현미경 또는 면역조직화학에 의해 이루어지지만 이러한 실험에서 검출된 화합물의 수는 제한된 화학 정보를 전달합니다. 조직 염색과 결합된 질량 분석 이미징(MSI)은 미크론 수준1에서 조직 조각을 스캔하고 분석하여 많은 양의 데이터를 제공하고 화합물의 공간 분포 정보를 제공할 수 있습니다. MSI는 시료 표면에서 탈착 및 이온화를 위해 분석물을 사용하고, 생성된 증기상 이온의 질량 분석과 이미징 소프트웨어를 적용하여 정보를 통합하고 특정 이온 존재비를 기록하는 2차원 이미지를 플로팅합니다. 이 기술은 표적 조직 및 기관에서 약물 및 유도 대사 산물의 특성 분포를 검출함으로써 외인성 및 내인성 분자를 모두 결정할 수 있습니다 2,3,4,5.

최근 수십 년 동안 다양한 이미징 MS 양식이 개발되었습니다. 그 중 가장 두드러진 것은 탈착 전기 분무 이온화 기반 MSI (DESI-MSI), 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 (MALDI) 및 2 차 이온 질량 분석법 (SIMS)입니다.6. DESI-MSI는 대기 작동, 높은 처리량 및 높은 정확도로 인해 생물학 연구에 자주 사용됩니다7. MALDI는 트랜스티레틴 단편을 겐타마이신에 대한 잠재적인 신독성 바이오마커로 식별하고 생쥐 뇌에서 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라히드로피리딘을 투여한 후 신경독성 대사산물인 1-메틸-4-페닐피리디늄의 분포를 분석하기 위해 적용되었습니다 8,9. MALDI와 DESI는 투여된 토끼의 신장에서 약물 유도 결정과 같은 구조의 구성을 결정하는 데 사용되었습니다. 이들 구조는 주로 약물(10)의 탈메틸화 및/또는 산화로 인해 형성된 대사산물로 구성된다. 또한 MSI는 표적 기관에서 약물 독성의 대사 분포의 국소화에 적용되었습니다. 그러나 식물 조직의 세포는 다양하고 동물과 다르며 특별한 절개 절차가 필요합니다.

식물에서, MALDI 이미징을 이용하여, 지금까지 밀(Triticum aestivum) 줄기, 콩(Glycine max), 벼(Oryza sativa) 종자, 애기장대 꽃 및 뿌리, 및 보리(Hordeum vulgare) 종자에서 상이한 화합물의 분포가 분석되었다 11,12,13,14,15,16,17,18 . 최근 연구에 따르면 DESI-MSI는 특히 은행나무, Fuzi 및 Artemisia annua L 19,20,21과 같은 TCM에서 천연 약물 및 제품의 대사 산물 분석에서 부상하고 있습니다. 이 연구에서 식물 재료 샘플 준비를위한 프로토콜은 다르며 일부는 냉동 마이크로 톰과 같은 더 복잡한 장비가 필요합니다. DESI-MSI는 검출된 샘플의 표면 평탄도에 대한 엄격한 요구 사항을 가지고 있습니다. 동물의 장기 또는 조직을 분석할 때, 샘플은 보통 냉동절편(cryo-sectioning)에 의해 이루어진다22. 그러나 극저온 절편 절차는 복잡하고 비용이 많이 들며, 일반적으로 사용되는 접착제 최적 절단 온도(OCT) 방법은 이미징 시 신호가 강합니다. 또한 TCM의 의약 조직은 다양합니다. 예를 들어, 중국어로 Danshen으로 알려진 Salvia miltiorrhiza의 뿌리는 약용으로 사용되는 반면 Zisu (Perilla frutescens)에서는 잎이사용됩니다 23,24. 따라서 TCM에 대한 대사산물 분석에서 DESI의 활용을 촉진하기 위해 샘플 준비 절차를 개선할 필요가 있습니다.

다년생 초본이자 일반적으로 사용되는 TCM인 S. miltiorrhiza 는 처음에 가장 오래된 의학 논문인 Shennong's Classic of Materia Medica(중국어로 Shennong Bencao Jing으로 알려짐)에 기록되었습니다. 이 연구에서 우리는 절편 및 DESI 이미징 절차를 최적화하고 분포를 식별하고 S. miltiorrhiza의 조직에서 화합물을 분류하는 보다 비용 효율적인 방법을 개발했습니다. 이 방법은 또한 건조 조직과 관련된 단점을 극복 할 수 있습니다 - 일반적으로 질소 블로우에 의해 쉽게 파괴됩니다 - TCM의 발달을 촉진합니다. 이 연구는 연구 관련 기술에 대한 TCM/민족 의학의 표준화를 촉진할 것입니다.

프로토콜

1. 시료 전처리

  1. 2년 된 Salvia miltiorrhiza 식물(그림 1A)에서 깨끗이 씻은 뿌리와 잎을 수집하고 손으로 약 3-5mm의 단면 두께로 직접 자릅니다. 그런 다음 양면 테이프를 사용하여 접착 현미경 유리 슬라이드에 샘플을 붙입니다(그림 1B).
    알림: 양면 테이프의 크기가 샘플보다 큰지 확인하십시오. 조직이 건조되면 슬라이스하기 전에 물이나 4% 파라포름알데히드에 밤새 담가둡니다.
  2. 샘플 위에 다른 현미경 유리 슬라이드를 놓고 두 개의 유리 슬라이드를 샌드위치와 같은 밀봉 필름으로 감쌉니다(그림 1C). 샌드위치 샘플을 -80°C에서 최소 4시간 동안 동결한 다음 -75 - -82°C의 트랩 온도 및 2.5 - 3.7Pa의 진공 게이지 설정 매개변수를 사용하여 2시간 동안 공기 진공(그림 1D)을 적용합니다.
    알림: s의 표면을 유지하기 위해 밀봉 필름을 감쌀 때 두 개의 유리 슬라이드가 평행한지 확인하십시오.amp르. 식물 조직의 수분 함량이 높으면 공기 진공 시간을 3 시간으로 연장하십시오. 5 시간을 초과하지 않으면 조직이 쉽게 골절됩니다.
  3. 분석될 때까지 샌드위치 샘플을 -80°C에서 보관한다. 샘플 표면의 응결을 방지하기 위해 데시케이터에서 샘플을 실온으로 가져옵니다. 그런 다음 샘플을 매트릭스 적용에 적용합니다.

2. 탈착 전기분무 이온화(DESI) 장치 설치

  1. ESI 모드에서 기기의 검출기 설정 및 질량 교정을 구현합니다. 물-아세토니트릴(1:1 v/v) 용액에서 류신 엔케팔린(LE)을 사용하여 검출기 설정을 수행하고 물-이소프로판올(1:1 v/v) 용액에서 포름산나트륨(NaFA)으로 질량 보정을 수행합니다.
  2. ESI 소스를 꺼내고 DESI 장치를 질량분석기에 장착합니다. N2 가스 공급 장치를 DESI 장치에 연결하고 가스 압력을 약 0.5MPa로 조정합니다(그림 2A). 소스를 교환할 때 기기를 환기시킬 필요가 없습니다.
  3. 5mL 주사기를 물-메탄올(1:9 v/v) 용액에 LE와 포름산으로 채우고 주사기를 고성능 주사기 펌프에 부착하여 시료 내 화학 물질의 이온화를 위한 용매를 제공합니다(그림 2B).
  4. 모세관을 제공하는 용매를 주사기와 DESI 분무기에 부착합니다(그림 2C). 용매 제공 모세관은 표준 75 μm 내경 및 375 μm 외경 모세관; 다소 좁고 불순물에 의해 쉽게 차단되므로 스캐닝 공정에 사용되는 용매는 막힘 위험을 줄이기 위해 사용 전에 MS 등급으로 여과해야 합니다.
  5. 주사기 펌프를 시작하고 주입 속도를 2μL/min으로 설정하여 용매의 일정한 흐름과 스프레이를 얻습니다(그림 2B). N2 가스 밸브를 끈 다음 약 15초 후에 켭니다. 작은 방울의 용매가 무대 위로 날아갈 것이고, 용매 흐름이 일정한 상태에 있으면 스프레이를 볼 수 있습니다.
  6. 스프레이 각도, XYZ 축, 돌출부 및 높이 측면에서 분무기의 위치를 조정합니다(그림 2D). 빨간색과 검은색 마커를 참조로 사용하여 질량 분석 신호를 최적화하고 감도 모드에서 1 x 105 이상의 신호 강도를 얻을 수 있습니다(그림 2E).
    1. 분무기의 돌출은 신호 강도에 영향을 미치는 가장 중요한 요소입니다. 2mm 렌치로 N5 가스 가드를 교체하여 돌출부를 조정합니다. 스프레이 방향은 질량 이미지의 품질에 영향을 미칩니다. 스프레이가 직선이 될 때까지 분무기를 돌립니다. 돌출부가 최상의 신호 강도 위치로 조정되면 소스를 교환할 때 돌출부를 변경하지 마십시오.
  7. 위의 모든 단계를 마치면 설정이 실험에 사용할 준비가 된 것이며 초기 설정 후 관찰된 >3주 동안 설정이 일반적으로 안정적입니다.

3. DESI-MS 이미지 획득

  1. DESI-MSI의 경우 시료 전처리를 수행하지 않습니다. 이미 전처리가 완료된 샘플의 경우 전처리 단계를 최대한 최소화하십시오. 예를 들어, 일부 샘플은 마운팅 미디어로만 만들 수 있으므로 가능하면 슬라이드에서 여분의 미디어를 제거하십시오.
  2. 슬라이드에서 샘플 이미지를 찍습니다(그림 3A). 불순물 흡입을 피하기 위해 샘플의 표면을 만지지 마십시오.
  3. DESI의 플레이트 위치에 슬라이드를 놓습니다.tage. 스테이지에는 A와 B의 두 가지 플레이트 위치가 있습니다. 올바른 위치를 기억하는 것이 중요합니다. 표준 슬라이드(75mm x 25mm) 또는 전체 슬라이드를 사용하지 않으면 슬라이드가 위치에 맞지 않아 안정적으로 고정할 수 없습니다. 전체 슬라이드(120mm x 80mm)는 최대 4개의 슬라이드를 수용할 수 있으므로 실험을 위한 훨씬 더 넓은 영역을 가지고 있습니다.
  4. 고화질 대량 이미지 처리 소프트웨어를 열고 획득 탭에서 새 플레이트를 설정한 다음 올바른 플레이트 위치(A 또는 B)와 플레이트 유형을 선택합니다. 이미지 선택 페이지에서 슬라이드의 네 모서리를 선택하면 이미지가 올바른 방향으로 자동 조정됩니다(그림 3A).
  5. MS 매개 변수를 설정합니다. 일반적으로 사용되는 실험 유형은 DESI-MS 모드로, 모이온만 검출됩니다. 기기는 한 번의 실험에서 하나의 극성만 사용할 수 있습니다. 따라서 극성을 양극 또는 음극으로 선택하십시오. 소량의 화학 물질에 대한 자세한 정보를 얻으려면 감도 모드를 적용하십시오(그림 3B).
  6. 사각형을 그려 패턴 탭에서 스캔 영역을 정의하고 픽셀 크기를 설정합니다. 일반적으로 DESI-MS 모드의 경우 픽셀의 X 및 Y 크기를 동일하게 유지합니다. 스캔 속도를 픽셀 크기의 5배 이하로 설정합니다(그림 3C).
  7. 프로젝트를 저장하고 질량 분석 수집 소프트웨어용 워크시트를 내보냅니다.
  8. 질량 분석 수집 소프트웨어를 열고, 워크시트를 가져오고, 새 샘플 목록으로 저장합니다. Start Run(실행 시작 )을 눌러 MSI 스캔을 시작합니다. 더 많은 워크시트를 가져와서 실험 대기열에 여러 이미지를 추가할 수 있습니다.

4. DESI-MSI 데이터 처리 및 시각화

  1. 샘플의 데이터 파일을 질량 이미지 처리 소프트웨어에 로드하고 DESI 이미지 처리를 위한 매개변수를 설정합니다(그림 3D). 내부 잠금 질량에는 류신 엔케팔린이 사용되었고 잠금 질량은 실험의 극성을 식별하는 유일한 지점이므로 올바른 잠금 질량을 설정하는 것이 매우 중요합니다. 다음 값을 설정합니다 : 양수 모드의 경우 : 556.2772; 네거티브 모드의 경우: 554.2620.
  2. 표적 화학물질 목록을 작성할 수 있으며, 이 경우 처리 결과는 표적 목록의 화학물질에 초점을 맞춥니다. 처리된 데이터 파일을 불러와 샘플의 DESI 이미지를 시각화합니다. "정규화" 버튼을 클릭하여 총 이온 크로마토그래피(TIC)로 데이터를 정규화하여 특정 화학 물질의 상대 강도를 기준으로 얻은 다음 서로 다른 샘플을 비교할 수 있습니다(그림 3E).
  3. 관심 영역(ROI)을 그리고 샘플 이미지에 여러 복사본을 복사합니다. ROI는 다양한 이미지에서 만들 수 있습니다. 모든 ROI를 선택하고 MVA(다변량 분석)를 내보내 MVA에 대한 모든 ROI에서 MS 정보를 추출합니다(그림 3F).

결과

이 프로토콜은 식물 샘플에서 화합물의 식별 및 분포로 이어질 수 있습니다. 특정 m/z의 MS 이미지에서 모든 단일 픽셀의 색상은 m/z의 상대적 강도를 나타내므로 샘플 전체의 대사 산물 이온의 자연 분포 및 풍부도와 연관될 수 있습니다. 수집 위치에서 화학 물질의 함량이 높을수록 색상이 더 밝아집니다. 그림의 막대(그림 4A-D)는 색상의 그라데이션?...

토론

MS 기술의 출현은 최근 몇 년 동안 분자 수준에서 천연물 연구에 대한 새로운 통찰력을 열었습니다24. 고감도 및 높은 처리량을 갖춘 MS 기기는 미량 농도25에서도 천연물 내 대사산물의 표적 및 비표적 분석을 가능하게 합니다. 따라서 MS는 현재 중국 전통 의학(TCM) 화학 분야에서 널리 사용됩니다. TCM의 화학 성분에 대한 질적 및 정량적 연구는 약리학 연구에 적?...

공개

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 말

이 작업은 쓰촨성 자연과학재단(No. 2022NSFSC0171)과 청두대학교 한의학대학(No. 030058042)의 Xinglin Talent Program의 지원을 받았습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
2-PropanolFisherCAS:67-63-0HPLC grade
AcetonitrileSigma-aldrichNumber-75-05-8LC-MS grade
Adhesion Microscope slidesCitotest scientific80312-3161Microscope glass slides  can adhere to  the sample 
Air cooled dry vacuum pumpEYELAFDU-2110Air-vaccum equipment at -80°C
Formic AcidACSF1089 | 64-18-6LC-MS grade
LE (Leucine Enkephalin)Waters186006013-1LC-MS grade
MethanolSigma-aldrichNumber-67-56-1LC-MS grade
Parafilm Bemis Companysc-200288Laboratory Sealing Film
ParaformaldehydeSigma-aldrichV900894Reagent grade
Q-Tof Mass Spectrometer with DESI sourceWatersSynapt XS

참고문헌

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