DESI-MSIを用いた漢方薬の空間メタボロームで同定された代謝物の可視化

要約

本研究では、プラントからDESI-MSIサンプルを調製するための一連の方法を提示し、DESIアセンブリの設置、MSIデータの取得、および処理の手順を詳細に説明します。このプロトコルは、植物における空間メタボローム情報を取得するためのいくつかの条件に適用することができる。

要約

伝統的な漢方薬の薬用使用は、主にその二次代謝産物によるものです。これらの代謝産物の分布の可視化は、植物科学において重要なテーマとなっています。質量分析イメージングは、組織スライスを分析することにより、膨大な量のデータを抽出し、これらに関する空間分布情報を提供できます。高スループットと高精度の利点により、脱離エレクトロスプレーイオン化質量分析イメージング(DESI-MSI)は、生物学研究や伝統的な漢方薬の研究でよく使用されます。ただし、この研究で使用される手順は複雑で手頃な価格ではありません。この研究では、切片作成とDESIイメージング手順を最適化し、代謝物の分布を特定し、植物組織中のこれらの化合物を分類するためのより費用効果の高い方法を開発しました。本研究では、代謝物分析におけるDESIの活用と、研究関連技術のための伝統的な漢方薬/民族医学の標準化を促進します。

概要

代謝物分布の可視化は、植物科学、特に漢方薬において、植物内の特定の代謝物の形成過程を明らかにする重要なトピックとなっています。伝統的な漢方薬(TCM)を参照して、有効成分に関する情報を提供し、製薬用途における植物部品の応用をガイドします。通常、代謝物の可視化はin situハイブリダイゼーション、蛍光顕微鏡、免疫組織化学などによって行われますが、これらの実験で検出される化合物の数では、限られた化学情報しか伝えられません。組織染色と組み合わせることで、質量分析イメージング(MSI)は、ミクロンレベル¹の組織スライスをスキャンして分析することにより、大量のデータを提供し、化合物の空間分布情報を提供できます。MSIは、サンプル表面からの脱離とイオン化に分析物を使用し、その後、得られた気相イオンの質量分析とイメージングソフトウェアの適用により、情報を統合し、特定のイオン存在量を記録した2次元画像をプロットします。この技術は、標的組織および器官における薬物およびそれらの誘導代謝産物の特徴的な分布を検出することにより、外因性分子および内因性分子の両方を決定することができる^2,3,4,5。

さまざまなイメージングMSモダリティがここ数十年にわたって開発されてきました。その中で最も顕著なのは、脱離エレクトロスプレーイオン化ベースのMSI(DESI-MSI)、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化(MALDI)、および二次イオン質量分析(SIMS)⁶です。DESI-MSIは、大気中での操作、高いスループット、およびより高い精度により、生物学研究でよく使用されます⁷。MALDIは、トランスサイレチンフラグメントをゲンタマイシンの潜在的な腎毒性バイオマーカーとして特定し、マウス脳における1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジンの管理後の神経毒性代謝物1-メチル-4-フェニルピリジニウムの分布を分析するために適用されています^8,9。MALDIおよびDESIは、投与されたウサギの腎臓における薬物誘発性結晶様構造の組成を決定するために使用されています。これらの構造は、主に薬物¹⁰の脱メチル化および/または酸化によって形成される代謝産物から構成される。さらに、MSIは、標的臓器における薬物毒性の代謝分布の局在化に適用されています。ただし、植物組織の細胞はさまざまであり、動物とは異なり、特別な切片作成手順が必要です。

植物では、MALDIイメージングを用いて、これまでに、コムギ(Triticum aestivum)茎、ダイヤ豆(Glycine max)、イネ(Oryza sativa)種子、シロイヌナズナの花と根、および大麦(Hordeum vulgare)種子における異なる化合物の分布が分析されている11,12,13,14,15,16,17,18.最近の研究では、DESI-MSIが天然の薬物および製品の代謝物分析、特にイチョウ葉、フジ、アルテミシアアヌアL 19,20,21などのTCMで出現していることが報告されています。これらの研究では、植物材料サンプルの調製のためのプロトコルが異なり、凍結ミクロトームのようなより複雑な装置を必要とするものもあります。DESI-MSIには、検出されたサンプルの表面平坦性に関する厳しい要件があります。動物の臓器または組織を分析する場合、サンプルは通常、凍結切片²²によって作製される。ただし、凍結切片作成の手順は複雑で費用がかかり、一般的に使用される接着剤最適切断温度(OCT)法は、イメージング時に強い信号を示します。さらに、TCMの薬用組織はさまざまです。たとえば、中国語で丹生として知られるサルビアミルティオルリザの根は薬用に使用されますが、Zisu(シソフルテッセンス)では葉が使用されます^23,24。したがって、TCMの代謝物分析におけるDESIの利用を促進するために、サンプル調製手順を改善する必要があります。

多年生のハーブおよび一般的に使用されるTCMとして、 S. miltiorrhiza は最初に最も古い医学モノグラフである神農のマテリアメディカの古典(中国語で神農ベンカオジンとして知られている)に記録されました。この研究では、切片作成とDESIイメージング手順を最適化し、 S. miltiorrhizaの組織中の分布を特定し、化合物を分類するためのより費用効果の高い方法を開発しました。この方法はまた、乾燥組織に関連する欠点(通常は窒素ブローで容易に骨折する)を克服し、TCMの発症を促進することができます。本研究では、研究関連技術のためのTCM/民族医学の標準化を推進します。

プロトコル

1. サンプル調製

1. 2年生の サルビアミルティオルリザ 植物(図1A)からきれいにした根と葉を集め、手で約3〜5 mmの断面の厚さで直接スライスします。次に、両面テープを使用してサンプルを接着顕微鏡スライドガラス上に貼り付けます(図1B)。
   注意: 両面テープのサイズがサンプルよりも大きいことを確認してください。ティッシュが乾燥している場合は、スライスする前に水または4%パラホルムアルデヒドに一晩浸します。
2. 別の顕微鏡スライドガラスをサンプルの上に置き、2つのスライドガラスをサンドイッチのようなシーリングフィルムで包みます(図1C)。サンドイッチサンプルを-80°Cで少なくとも4時間凍結し、次に次の設定パラメータを使用して2時間空気真空にさらします(図1D):トラップ温度は-75〜-82°C、真空計は2.5〜3.7Paです。
   注意: サンプルの表面を無傷に保つために、シーリングフィルムを包むときは、2つのスライドガラスが平行であることを確認してください。植物組織の水分含有量が高い場合は、空気真空の時間を3時間に延長します。5時間を超えないでください、そうでなければ組織は容易に骨折します。
3. サンドイッチサンプルは、分析されるまで-80°Cで保存します。サンプル表面の結露を避けるために、デシケーターでサンプルを室温に戻します。次に、サンプルをマトリックスアプリケーションにかけます。

2. 脱離エレクトロスプレーイオン化(DESI)装置の設置

1. 検出器のセットアップと機器の質量校正をESIモードで実装します。水-アセトニトリル(1:1 v / v)溶液中のロイシンエンケファリン(LE)を使用して検出器のセットアップを実行し、水-イソプロパノール(1:1 v / v)溶液中のギ酸ナトリウム(NaFA)を使用して質量校正を実行します。
2. ESIソースを取り出し、DESIユニットを質量分析計に取り付けます。N₂ ガス供給をDESIユニットに接続し、ガス圧力を約0.5MPaに調整します(図2A)。ソースを交換するときに機器をベントする必要はありません。
3. 5 mLシリンジに水-メタノール(1:9 v/v)溶液中のLEとギ酸を満たし、シリンジを高性能シリンジポンプに取り付けて、サンプル中の化学物質をイオン化するための溶媒を供給します(図2B)。
4. シリンジとDESI噴霧器に毛細管を提供する溶媒を取り付けます(図2C)。溶媒供給キャピラリーは、標準的な内径75μm、外径375μmのキャピラリーです。それはかなり狭く、不純物によって簡単にブロックされるため、スキャンプロセスで使用される溶媒はMSグレードであり、閉塞のリスクを減らすために使用前にろ過する必要があります。
5. シリンジポンプを始動し、注入速度を2 μL/minに設定して、溶媒の流れとスプレーを一定にします(図2B)。N₂ ガスバルブをオフにし、約15秒後にオンにします。溶剤の小さな滴がステージに吹き出され、溶剤の流れが一定の状態にある場合はスプレーが見られます。
6. スプレー角度、XYZ軸、突起、および高さの観点から噴霧器の位置を調整します(図2D)。赤と黒のマーカーを基準として使用して質量分析信号を最適化し、感度モードで1 x 10⁵ を超える信号強度を取得します(図2E)。
   1. 噴霧器の突出は、信号強度に影響を与える最も重要な要因です。N₂ ガスガードを5mmレンチで交換して突起を調整します。スプレー方向はマス画像の品質に影響します。スプレーがまっすぐになるまでスプレーを回転させます。突起を最適な信号強度位置に調整したら、ソースを交換するときに変更しないようにしてください。
7. 上記のすべての手順を完了すると、セットアップは実験の準備が整い、セットアップは通常、初期設定後に観察される>3週間の使いやすさで安定しています。

3. DESI-MS画像取得

1. DESI-MSIの場合、サンプルの前処理は行いません。すでに前処理が行われているサンプルの場合は、前処理ステップをできるだけ最小限に抑えます。たとえば、一部のサンプルは封入剤でしか作成できないため、可能であればスライド上の余分な媒体を取り除きます。
2. スライド上のサンプルの画像を撮ります(図3A)。不純物の取り込みを防ぐため、サンプルの表面に触れないでください。
3. DESIステージのプレート位置にスライドを置きます。ステージには、AとBの2つのプレート位置があります。正しい位置を覚えておくことが重要です。標準のスライド(75 mm x 25 mm)またはフルスライドを使用すると、スライドがその位置に収まらず、安定して保持できなくなります。フルスライド(120 mm x 80mm)は最大4つのスライドを収容できるため、実験用の領域がはるかに大きくなります。
4. 高精細マス画像処理ソフトウェアを開き、[取得]タブで新しいプレートを設定し、正しいプレート位置(AまたはB)とプレートタイプを選択します。画像選択ページで、スライドの四隅を選択すると、画像が正しい向きに自動調整されます(図3A)。
5. MSパラメータを設定します。一般的に使用される実験タイプはDESI-MSモードで、親イオンのみが検出されます。機器は1回の実験で1つの極性しか使用できません。したがって、極性を正または負として選択してください。少量の化学物質に関する詳細情報を取得するには、感度モードを適用します(図3B)。
6. 長方形を描画して、[パターン]タブでスキャン領域を定義し、ピクセルサイズを設定します。一般に、DESI-MS モードでは、ピクセルの X サイズと Y サイズを等しく保ちます。スキャンレートをピクセルサイズの5倍以下に設定します(図3C)。
7. プロジェクトを保存し、質量分析取得ソフトウェアのワークシートをエクスポートします。
8. 質量分析取得ソフトウェアを開き、ワークシートをインポートして、新しいサンプルリストとして保存します。[ 実行の開始 ]を押して、MSIスキャンを開始します。さらにワークシートをインポートすることで、複数の画像を実験キューに追加できます。

4. DESI-MSIデータの処理と可視化

1. サンプルのデータファイルを大量画像処理ソフトウェアにロードし、DESI画像処理のパラメータを設定します(図3D)。ロイシンエンケファリンは内部ロック質量に使用され、ロック質量は実験の極性を識別する唯一のポイントであるため、正しいロック質量を設定することが非常に重要です。次の値を設定します:ポジティブモードの場合:556.2772;負のモードの場合:554.2620。
2. ターゲット化学物質のリストを作成することは可能であり、その場合、処理結果はターゲットリスト内の化学物質に焦点を当てます。処理されたデータファイルをロードして、サンプルのDESI画像を視覚化します。「正規化」ボタンをクリックしてトータルイオンクロマトグラフィー(TIC)でデータを正規化し、特定の化学物質の基準に対する相対強度を取得すると、異なるサンプルを相互に比較できます(図3E)。
3. 関心領域(ROI)を描画し、サンプル画像にいくつかのコピーをコピーします。ROIは、さまざまな画像にわたって作成できます。すべてのROIを選択し、多変量解析(MVA)をエクスポートして、MVAのすべてのROIからMS情報を抽出します(図3F)。

結果

このプロトコルは、植物サンプル中の化合物の同定と分布につながる可能性があります。特定のm/zのMS画像では、各ピクセルの色はm/zの相対強度を表しているため、サンプル全体の自然分布と代謝物イオンの存在量に関連付けることができます。収集位置での化学物質の量が多いほど、色は明るくなります。写真のバー(図4A-D)は、色のグラデー?...

ディスカッション

MS技術の出現は、近年の分子レベルでの天然物研究に新しい洞察を開きました²⁴。高感度と高スループットを備えたMS装置は、微量濃度²⁵でも天然物中の代謝物の標的分析と非標的分析を可能にします。したがって、MSは現在、伝統的な漢方薬(TCM)化学の分野で広く使用されています。TCMの化学組成に関する定性的および定量的研究は、医薬品の成分とその関?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Propanol	Fisher	CAS:67-63-0	HPLC grade
Acetonitrile	Sigma-aldrich	Number-75-05-8	LC-MS grade
Adhesion Microscope slides	Citotest scientific	80312-3161	Microscope glass slides  can adhere to  the sample
Air cooled dry vacuum pump	EYELA	FDU-2110	Air-vaccum equipment at -80°C
Formic Acid	ACS	F1089 | 64-18-6	LC-MS grade
LE (Leucine Enkephalin)	Waters	186006013-1	LC-MS grade
Methanol	Sigma-aldrich	Number-67-56-1	LC-MS grade
Parafilm	Bemis Company	sc-200288	Laboratory Sealing Film
Paraformaldehyde	Sigma-aldrich	V900894	Reagent grade
Q-Tof Mass Spectrometer with DESI source	Waters	Synapt XS