用于评估小鼠心力衰竭模型心率依赖性舒张功能的起搏控制程序

摘要

本方案描述了通过经食管起搏获得压力-容积关系，这是评估心力衰竭小鼠模型舒张功能的宝贵工具。

摘要

射血分数保留型心力衰竭 （HFpEF） 是一种以舒张功能障碍和运动不耐受为特征的疾病。虽然运动应激血流动力学测试或 MRI 可用于检测舒张功能障碍和诊断人类的 HFpEF，但这种方式在使用小鼠模型的基础研究中受到限制。跑步机运动试验通常用于小鼠的此目的，但其结果会受到体重、骨骼肌力量和精神状态的影响。在这里，我们描述了一种心房起搏方案，用于检测舒张性能的心率（HR）依赖性变化，并验证其在HFpEF小鼠模型中的有用性。该方法包括麻醉、插管和进行压力-容积 （PV） 环分析，同时进行心房起搏。在这项工作中， 通过 左心室心尖入路插入电导导管，并在食管中放置心房起搏导管。在用伊伐布雷定减慢心率之前收集基线 PV 环。 通过 心房起搏以 400 bpm 至 700 bpm 的 HR 增量收集和分析 PV 环路。使用该协议，我们在代谢诱导的HFpEF模型中清楚地证明了HR依赖性舒张功能障碍。与对照组小鼠相比，弛豫时间常数（Tau）和舒张末期压力-容积关系（EDPVR）均随着HR的增加而恶化。总之，这种心房起搏控制方案可用于检测 HR 依赖性心功能障碍。它为研究HFpEF小鼠模型中舒张功能障碍的潜在机制提供了一种新方法，并可能有助于开发针对这种情况的新疗法。

引言

心力衰竭是全球住院和死亡的主要原因，射血分数保留型心力衰竭 （HFpEF） 约占所有心力衰竭诊断的 50%。HFpEF 的特征是舒张功能障碍和运动耐量受损，相关的血流动力学异常，如舒张功能障碍，可以通过运动应激血流动力学测试或 MRI 扫描 ^1,2 清楚地检测到。

然而，在实验模型中，用于评估与 HFpEF 相关的生理异常的可用模式是有限的 ^3,4。跑步机运动试验 （TMT） 用于确定跑步时间和距离，这可能反映运动应激心脏血流动力学;然而，这种方法容易受到体重、骨骼肌力量和精神状态等外来变量的干扰。

为了规避这些限制，我们设计了一种心房起搏方案，该方案根据心率 （HR） 检测舒张性能的细微但关键的变化，并验证了其在 HFpEF⁵ 小鼠模型中的有用性。有几个生理因素会影响与运动相关的心脏功能，包括交感神经和儿茶酚胺反应、外周血管舒张、内皮反应和心率⁶.然而，其中，心率-压力关系（也称为鲍迪奇效应）被称为心脏生理特征的关键决定因素 ^7,8,9。

该方案涉及在基线时进行常规压力-容积分析，以评估收缩压和舒张功能，包括压力发展速率 （dp/dt）、收缩末期压力-容积关系 （ESPVR） 和舒张末期压力-容积关系 （EDPVR） 等参数。然而，应该注意的是，这些参数受心率的影响，由于动物的内在心率不同，心率可能因动物而异。此外，还应考虑麻醉对心率的影响。为了解决这个问题，通过与伊伐布雷定同时进行心房起搏来标准化心率，并以增量心率进行心脏参数测量。值得注意的是，HR依赖性心脏反应将HFpEF小鼠与对照组小鼠区分开来，而在基线PV环测量（使用固有心^率）中未观察到显着差异5。

虽然这种起搏协议可能看起来相对复杂，但当它被充分理解时，它的成功率超过 90%。该协议将为研究HFpEF小鼠模型中舒张功能障碍的潜在机制提供有用的方法，并有助于开发针对这种情况的新疗法。

研究方案

该动物方案已获得机构动物护理和使用委员会的批准，并遵循东京大学动物实验和相关活动的规定。本研究以8-12周龄雄性C57/Bl6J小鼠为研究对象。这些动物是从商业来源获得的（见 材料表）。如前所述，通过与NG-硝基-L-精氨酸甲酯一起给予高脂肪饮食15周来建立HFpEF模型¹⁰。

1. 导管准备和压力/体积校准

1. 将电导导管放入生理盐水中，并将其连接到由 PowerLab 8/35 和压力容积单元（MPVS 模块，参见 材料表）组成的模块上。
2. 通过在 MPVS 模块 ^3,11 上记录预定压力（0 mmHg 和 ¹⁰⁰ mmHg）和体积参数（这些因 MPVS 模块而异）以电子方式校准压力和体积（另请参阅制造商的说明）。

2. 准备动物进行导尿

1. 麻醉和通气
   1. 插管前 5-10 分钟腹膜内注射 5 mg/kg 依托咪酯和 500 mg/kg 氨基甲酸乙酯（见 材料表）。
      注:聚氨酯虽然在动物研究中作为麻醉剂有效，但被怀疑对人类致癌。因此，当氨基甲酸乙酯是实现实验目标所必需的，并且没有替代剂足以满足时，必须谨慎处理。必须采取适当的保护措施，例如戴手套和口罩以及在准备过程中使用通风柜。作为一种可能的替代方法，可以使用氯胺酮（80 mg/kg，ip）。
   2. 将小鼠置于先前用2%异氟烷饱和的麻醉室中，并在麻醉诱导时将动物转移到保持在38°C至40°C之间的预热加热垫中。
   3. 剃除手术区域。然后，用三轮交替的甜菜碱和酒精对手术部位进行消毒。
   4. 在颈部做一个水平切口（1-2厘米），切除气管肌，露出气管。将手术 2-0 丝线缝合在气管下方，将其抬高，并做一个小切口（1-2 毫米）将其打开。
   5. 将气管插管插入气管，并将其连接到呼吸机，呼吸机提供 100% 氧气和 2% 异氟烷的混合物（后来减少到 0.5% 至 1%）。
2. 中心静脉 （CV） 导管插入和液体注入
   1. 找到胸锁乳突肌下方的颈内静脉³.
   2. 将中心静脉导管插入颈静脉，该导管由连接到30G针头的PE-10硅橡胶管（参见 材料表）组成。
   3. 在 3 分钟内推注 5-6 μL/g 体重的 10% 白蛋白/NaCl，然后以 5-10 μL/min 的恒定输注速率。
      注意:此步骤对于预防麻醉引起的外周血管舒张引起的低血压至关重要。颈内静脉位于胸锁乳突肌和颈动脉之间，颜色比动脉深。

3. 左心室导管插入术（开胸入路）的外科手术

1. 剃除麻醉小鼠的手术区域。然后，用三轮交替的甜菜碱和酒精对手术部位进行消毒。
2. 通过捏脚趾来确认麻醉深度。然后，在剑突下方做一个水平切口（2-3厘米），并用钝剪刀将皮肤与胸壁分开。
3. 使用电烧术在两侧横向切开胸壁（参见 材料表）。
4. 通过切开横膈膜暴露心脏，然后用镊子轻轻地从心脏中取出心包。
5. 将一根 27 G 针插入左心室 （LV） 的顶点，然后 通过 穿刺孔逆行将电导导管插入左心室。
6. 调整导管位置，以获得方形压力-容积环。
7. 通过检查下腔静脉 （IVC） 闭塞期间 PV 环的形状，验证当负荷条件发生变化时导管不会接触肌。
   注意:充分的心脏暴露有助于手术并有助于获得清晰的视野。

4. 记录PV回路数据，确定收缩末期压力-容积关系（ESPVR）和舒张末期压力-容积关系（EDPVR）

注意:通过 IVC 闭塞减少预紧力可以确定 ESPVR 和 EDPVR。

1. 在信号稳定后（插管后5-10分钟），使用LabChart软件（参见 材料表），PowerLab和MPVS模块记录和分析基线压力 - 体积（PV）回路。
2. 通过用镊子按压IVC进行IVC闭塞，并在IVC闭塞期间记录至少20个心动周期的PV环。通过使用 LabChart 软件将曲线线拟合到 PV 环的收缩末点和 EDPVR 中，通过拟合一条曲线穿过 PV 环的舒张末期点来确定 ESPVR。
   注意: 在 IVC 闭塞期间停止呼吸机以防止肺运动伪影。当肺运动过度时，泮库溴铵 （0.5-1 mg/kg） 等麻痹剂可能有帮助，只有在确认麻醉平面稳定后才应使用。

5.经食管起搏

1. 将 2-Fr 四极电极导管插入食管，将导管连接到脉冲刺激器（参见 材料表），并确定心房捕获阈值（通常，刺激幅度为 3 mA，脉冲宽度为 1 ms）。
2. 使用腹膜内给药的20mg / kg伊伐布雷定（参见 材料表）将HR减慢至400次/ min以下。
3. 稳定后，以 400 次/分钟至 700 次/分钟的不同起搏率获取 20 个连续心动周期的 PV 循环，增量为 100 次/分钟;以每个起搏率获得超过 5 分钟的周期。

6. 生理盐水校准和主动脉血流校准

1. 使呼吸机失活，并通过 CV 导管静脉注射 5-10 μL 高渗盐水溶液。
2. 记录盐水注射过程中压力和体积的波动，并使用 PowerLab ^3,11 计算 Vp 值。
3. 重复盐水校准以提高准确性和可重复性。
4. 将鼠标转到左侧，以免干扰音量信号。
5. 在Th3至Th5之间朝向脊柱进行侧向开胸术，并用镊子轻轻解剖降主动脉的一小部分。
6. 在主动脉上放置一个血管流量探头（参见 材料表）以测量心输出量。
   注意:绝对容积的准确计算需要使用两种类型的校准:盐水校准和主动脉血流校准。重要的是要认识到与动物受试者高渗盐水输注相关的潜在风险，因为过量的盐负荷会导致收缩力下降。

7. 安乐死

1. 研究结束后， 通过 颈椎脱位在麻醉剂过量下对小鼠实施安乐死。
   注意:为确保生命功能完全停止，采用安乐死的辅助方法，例如在麻醉下放血，随后摘取心脏组织。

结果

基线PV环路数据如图1和表1所示。在基线（没有起搏的情况下），对照组和HFpEF小鼠之间的舒张期参数（如弛豫时间常数（Tau）、最小压力变化率（dP / dt min）和EDPVR没有显着差异。然而，HFpEF小鼠表现出更高的血压和动脉弹性（Ea），如图1所示，并在心室收缩期间表现出典型的山形PV环。这应与心室肌肉直接接触压力传感器引起的尖峰区分开...

讨论

我们提出了一种方法来评估压力-容积与经食管起搏应用的关系。运动不耐受是HFpEF的关键特征之一，但尚无技术可用于评估运动期间小鼠的心脏功能。我们的起搏方案为检测舒张功能障碍提供了有价值的工具，这在静息条件下可能并不明显。

为了获得准确和一致的质量的PV回路，必须仔细执行以下步骤3,4,5,7,8,11,12,13,14:（1）必须小心地

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-0 silk suture, sterlie	Alfresa Pharma Corporation, Osaka, Japan	62-9965-57	Surgical Supplies
2-Fr tetrapolar electrode catheter	Fukuda Denshi, Japan and UNIQUE MEDICAL, Japan	custom-made	Surgical Supplies
Albumin Bovine Serum	Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japan	01859-47	Miscellaneous
C57/BI6J mouse	Jackson Laboratory		animals
Conductance catheter	Millar Instruments, Houston, TX	PVR 1035
Electrical cautery, Electrocautery Knife Kit	ellman-Japan,Osaka, Japan	1-1861-21	Surgical Supplies
Etomidate	Tokyo Chemical Industory Co., Ltd., Tokyo Japan	E0897	Anesthetic
Grass Instrument S44G Square Pulse Stimulator	Astro-Med, West Warwick, RI		Pacing equipment
Isoflurane	Viatris Inc., Tokyo, Japan	8803998	Anesthetic
Ivabradine	Tokyo Chemical Industory Co., Ltd., Tokyo Japan	I0847	Miscellaneous
LabChart software	ADInstruments, Sydney, Australia	LabChart 7	Hemodynamic equipment
MPVS Ultra	Millar Instruments, Houston, TX	PL3516B49	Hemodynamic equipment
Pancronium bromide	Sigma Aldrich Co., St. Louis, MO	15500-66-0	Anesthetic
PE10 polyethylene tube	Bio Research Center  Co. Ltd., Tokyo, Japan	62101010	Surgical Supplies
PowerLab 8/35	ADInstruments, Sydney, Australia	PL3508/P	Hemodynamic equipment
PVR 1035	Millar Instruments, Houston, TX	842-0002	Hemodynamic equipment
Urethane (Ethyl Carbamate)	Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan	050-05821	Anesthetic
Vascular Flow Probe	Transonic, Ithaca, NY	MA1PRB	Surgical Supplies