쥐 심부전 모델에서 심박수 의존적 이완기 기능 평가를 위한 속도 제어 절차

요약

본 프로토콜은 심부전의 마우스 모델에서 이완기 기능을 평가하는 데 유용한 도구 역할을 하는 경식도 페이싱을 통해 압력-부피 관계를 얻는 방법을 설명합니다.

초록

박출률이 보존된 심부전(HFpEF)은 이완기 기능 장애와 운동 과민증을 특징으로 하는 질환입니다. 운동 스트레스 혈류역학 검사 또는 MRI를 사용하여 이완기 기능 장애를 감지하고 인간의 HFpEF를 진단할 수 있지만, 이러한 양식은 마우스 모델을 사용한 기초 연구에서 제한적입니다. 트레드밀 운동 테스트는 일반적으로 생쥐에서 이러한 목적으로 사용되지만 그 결과는 체중, 골격근 강도 및 정신 상태에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 여기에서는 이완기 기능의 심박수(HR)에 따른 변화를 감지하고 HFpEF의 마우스 모델에서 그 유용성을 검증하기 위한 심방 페이싱 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 방법에는 마취, 삽관 및 심방 페이싱과 동시에 압력-부피(PV) 루프 분석을 수행하는 것이 포함됩니다. 이 연구에서는 좌심실 정점 접근법을 통해 전도도 카테터를 삽입하고 심방 페이싱 카테터를 식도에 삽입했습니다. 기준선 PV 루프는 이바브라딘으로 HR을 늦추기 전에 수집되었습니다. PV 루프는 심방 페이싱을 통해 400bpm에서 700bpm 범위의 HR 단위로 수집 및 분석되었습니다. 이 프로토콜을 사용하여 대사 유도 HFpEF 모델에서 HR 의존성 이완기 장애를 명확하게 입증했습니다. 이완 시간 상수(Tau)와 이완기 말기 압력-부피 관계(EDPVR)는 모두 대조군 마우스에 비해 HR이 증가함에 따라 악화되었습니다. 결론적으로, 이 심방 속도 조절 프로토콜은 HR 의존성 심장 기능 장애를 감지하는 데 유용합니다. HFpEF 마우스 모델에서 이완기 기능 장애의 근본적인 메커니즘을 연구하는 새로운 방법을 제공하고 이 상태에 대한 새로운 치료법을 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다.

서문

심부전은 전 세계적으로 입원 및 사망의 주요 원인이며, 박출률이 보존된 심부전(HFpEF)은 모든 심부전 진단의 약 50%를 차지합니다. HFpEF는 이완기 기능 장애 및 운동 내성 장애를 특징으로 하며, 이완기 기능 장애와 같은 관련 혈역학적 이상은 운동 스트레스 혈류역학 검사 또는 MRI 스캔을 통해 명확하게 감지할 수 있습니다 ^1,2.

그러나 실험 모델에서는 HFpEF와 관련된 생리적 이상을 평가하는 데 사용할 수 있는 양식이 제한적입니다 ^3,4. 트레드밀 운동 테스트(TMT)는 운동 스트레스 심장 혈류역학을 반영할 수 있는 달리기 시간과 거리를 결정하는 데 사용됩니다. 그러나 이 방법은 체중, 골격근 강도 및 정신 상태와 같은 외부 변수의 간섭에 취약합니다.

이러한 한계를 극복하기 위해 당사는 심박수(HR)를 기반으로 이완기 기능의 미묘하지만 중요한 변화를 감지하는 심방 페이싱 프로토콜을 고안했으며 HFpEF⁵의 마우스 모델에서 그 유용성을 검증했습니다. 교감신경 및 카테콜아민 반응, 말초 혈관 확장, 내피 반응, 심박수 등 여러 생리학적 요인이 운동 관련 심장 기능에 기여한다⁶. 그러나 이 중에서도 HR-압력 관계(Bowditch 효과라고도 함)는 심장 생리학적 특징의 중요한 결정 요인으로 알려져 있습니다 ^7,8,9.

이 프로토콜에는 압력 발달 속도(dp/dt), 수축기 말 압력-부피 관계(ESPVR) 및 이완기 말기 혈압-부피 관계(EDPVR)와 같은 매개변수를 포함하여 수축기 및 이완기 기능을 평가하기 위해 기준선에서 기존의 압력-부피 분석을 수행하는 것이 포함됩니다. 그러나 이러한 매개변수는 고유 심박수의 차이로 인해 동물마다 다를 수 있는 HR의 영향을 받는다는 점에 유의해야 합니다. 또한 마취가 HR에 미치는 영향도 고려해야 합니다. 이를 해결하기 위해 심방 페이싱과 이바브라딘을 동시에 투여하여 HR을 표준화하고 심장 매개변수 측정을 점진적인 심박수로 수행했습니다. 특히, HR 의존적 심장 반응은 HFpEF 마우스와 대조군 마우스를 구별한 반면, 기준선 PV 루프 측정(고유 심박수 ^{사용)에서는} 유의미한 차이가 관찰되지 않았습니다5.

이 페이싱 프로토콜은 비교적 복잡해 보일 수 있지만 잘 이해하면 성공률이 90%를 초과합니다. 이 프로토콜은 HFpEF 마우스 모델에서 이완기 기능 장애의 근본적인 메커니즘을 연구하고 이 상태에 대한 새로운 치료법을 개발하는 데 도움이 되는 유용한 방법을 제공할 것입니다.

프로토콜

이 동물 프로토콜은 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았으며 도쿄 대학의 동물 실험 및 관련 활동에 대한 규정을 따랐습니다. 본 연구에서는 8-12주 된 수컷 C57/Bl6J 마우스를 사용하였다. 동물은 상업적 출처에서 얻었다( 재료 표 참조). HFpEF의 모델은 앞서 설명한 바와 같이 NG-니트로-L-아르기닌 메틸 에스테르와 함께 15주 동안 고지방 식단을 투여하여 확립되었습니다¹⁰.

1. 카테터 준비 및 압력/부피 보정

1. 컨덕턴스 카테터를 생리식염수에 넣고 PowerLab 8/35 및 압력 체적 장치(MPVS 모듈, 재료 표 참조)로 구성된 모듈에 부착합니다.
2. MPVS 모듈⁰에서 미리 결정된 압력(100mmHg 및 100mmHg) 및 부피 매개변수(MPVS 모듈마다 다름)를 기록하여 압력과 부피를 전자적으로 보정^{합니다(제조업체} 지침 참조).

2. 카테터 삽입을 위한 동물 준비

1. 마취 및 환기
   1. 삽관 5-10분 전에 에토미데이트 5mg/kg과 우레탄 500mg/kg( 재료 표 참조)을 복강내 주사합니다.
      참고: 우레탄은 동물 실험에서 마취제로 효과적이지만 인간에게는 발암성이 있는 것으로 의심됩니다. 따라서 실험 목적 달성을 위해 우레탄이 필요하고 대체 물질이 충분하지 않은 경우 주의해서 다루어야 합니다. 준비 중 장갑과 마스크를 착용하고 흄 후드를 사용하는 것과 같은 적절한 보호 조치가 의무화됩니다. 가능한 대안으로 케타민(80mg/kg, ip)을 사용할 수 있습니다.
   2. 2% 이소플루란으로 미리 포화된 마취실에 마우스를 넣고 마취 유도 시 38°C에서 40°C 사이로 유지되는 예열된 가열 패드로 동물을 옮깁니다.
   3. 수술 부위를 면도하십시오. 그런 다음 베타딘과 알코올을 번갈아 가며 3회 투여하여 수술 부위를 소독합니다.
   4. 목을 가로로 절개(1-2cm)하고 기관 근육을 절제하고 기관을 노출시킵니다. 수술용 2-0 실크 봉합사를 기관 아래에 통과시키고 들어 올린 다음 작은 절개(1-2mm)하여 엽니다.
   5. 기관 내 튜브를 기관에 삽입하고 100% 산소와 2% 이소플루란의 혼합물을 전달하는 인공호흡기에 연결합니다(나중에 0.5%에서 1%로 감소).
2. 중심정맥(CV) 카테터 삽입 및 수액 주입
   1. 흉쇄유돌근 아래의 내부 경정맥을 찾습니다³.
   2. 10G 바늘에 부착된 PE-30 실라스틱 튜브( 재료 표 참조)로 구성된 중심 정맥 카테터를 경정맥에 삽입합니다.
   3. 3분에 걸쳐 체중 10% 알부민/NaCl의 5-6μL/g의 볼루스 주입을 투여한 후 5-10μL/min의 일정한 주입 속도를 투여합니다.
      알림: 이 단계는 마취로 인한 말초 혈관 확장으로 인한 저혈압을 예방하는 데 중요합니다. 내부 경정맥은 흉쇄유돌근과 경동맥 사이에 위치하며 동맥보다 색이 더 어둡습니다.

3. 좌심실 카테터 삽입술(개흉 접근법) 수술

1. 마취된 쥐의 수술 부위를 면도합니다. 그런 다음 베타딘과 알코올을 번갈아 가며 3회 투여하여 수술 부위를 소독합니다.
2. 발가락 꼬집기를 실시하여 마취 깊이를 확인합니다. 그런 다음 xiphoid 돌기 아래에 수평으로 절개 (2-3cm)하고 뭉툭한 가위를 사용하여 흉벽에서 피부를 분리합니다.
3. 전기 소작을 사용하여 양쪽에서 흉벽을 측면으로 절단합니다( 재료 표 참조).
4. 횡격막을 절단하여 심장을 노출시키고 겸자를 사용하여 심장에서 심낭을 부드럽게 제거합니다.
5. 좌심실(LV)의 정점에 27G 바늘을 삽입하고 천자 구멍을 통해 전도도 카테터를 LV에 역행적으로 삽입합니다.
6. 사각형 모양의 압력-부피 루프가 생성되도록 카테터 위치를 조정합니다.
7. 하대정맥(IVC) 폐색 중 PV 루프의 모양을 확인하여 부하 조건의 변화가 발생할 때 카테터가 유두 근육에 닿지 않는지 확인합니다.
   알림: 적절한 심장 노출은 절차를 용이하게 하고 명확한 시야를 확보하는 데 도움이 됩니다.

4. PV 루프 데이터 기록 및 수축기 말기 혈압-부피 관계(ESPVR) 및 이완기 말기 혈압-부피 관계(EDPVR) 결정

알림: IVC 폐색으로 예압을 줄이면 ESPVR 및 EDPVR을 결정할 수 있습니다.

1. 신호 안정화 후(캐뉼레이션 후 5-10분) LabChart 소프트웨어( 재료 표 참조), PowerLab 및 MPVS 모듈을 사용하여 기준선 압력-부피(PV) 루프를 기록하고 분석합니다.
2. 겸자로 IVC를 압축하여 IVC 폐색을 수행하고 IVC 폐색 중 최소 20회의 심장 주기 동안 PV 루프를 기록합니다. LabChart 소프트웨어를 사용하여 PV 루프의 수축기 말단을 통해 선형 회귀선을 피팅하고 PV 루프의 이완기 말단을 통해 곡선 라인을 피팅하여 EDPVR을 결정하여 ESPVR을 결정합니다.
   알림: IVC 폐색 중에 인공호흡기를 중지하여 폐 운동 아티팩트를 방지하십시오. 판쿠로늄(0.5-1mg/kg)과 같은 마비제는 폐 운동이 과도할 때 도움이 될 수 있으며 안정적인 마취면이 확인된 후에만 사용해야 합니다.

5. 경식도 페이싱

1. 2-Fr 사극 전극 카테터를 식도에 삽입하고 카테터를 펄스 자극기에 연결하고( 재료 표 참조) 심방 포획 임계값을 결정합니다(일반적으로 자극 진폭은 3mA, 펄스 폭은 1ms).
2. 복강내로 투여되는 20mg/kg의 이바브라딘( 재료 표 참조)을 사용하여 HR을 분당 400회 미만으로 늦춥니다.
3. 안정화 후 20회/분에서 400비트/분까지 다양한 페이싱 속도로 700회/분(100회/분)의 PV 루프의 연속 심장 사이클을 획득합니다. 각 페이싱 속도에서 5분 동안 주기를 획득합니다.

6. 식염수 교정 및 대동맥 유량 교정

1. 인공호흡기를 비활성화하고 CV 카테터를 통해 5-10μL의 고긴장성 식염수를 정맥 주사합니다.
2. 식염수 주입 중 압력 및 부피의 변동을 문서화하고 PowerLab ^3,11을 사용하여 Vp 값을 계산합니다.
3. 식염수 보정을 반복하여 정확도와 재현성을 향상시킵니다.
4. 볼륨 신호를 방해하지 않도록 마우스를 왼쪽으로 돌립니다.
5. Th3에서 Th5 사이의 척추 쪽 측면 개흉술을 하고 집게로 하행 대동맥의 작은 부분을 부드럽게 절개합니다.
6. 대동맥 위에 혈관 흐름 프로브( 재료 표 참조)를 놓고 심박출량을 측정합니다.
   알림: 절대 부피를 정확하게 계산하려면 식염수 교정과 대동맥 유량 교정의 두 가지 유형의 교정을 사용해야 합니다. 과도한 염분 로딩은 수축률의 감소를 초래할 수 있으므로 동물 피험자의 고긴장성 식염수 주입과 관련된 잠재적 위험을 인식하는 것이 중요합니다.

7. 안락사

1. 연구 후 자궁 경부 탈구를 통해 마취제 과다 복용 하에서 쥐를 안락사시킵니다.
   참고: 생명 기능의 완전한 중단을 보장하기 위해, 마취 하에 출혈을 하고 후속 심장 조직을 채취하는 것과 같은 2차 안락사 방법이 사용됩니다.

결과

기준선 PV 루프 데이터는 그림 1과 표 1에 표시되어 있습니다. 기준선(페이싱이 없는 경우)에서 대조군과 HFpEF 마우스 간에 이완 시간 상수(Tau), 최소 압력 변화율(dP/dt min) 및 EDPVR과 같은 이완기 매개변수에는 큰 차이가 없었습니다. 그러나 HFpEF 마우스는 그림 1에서 볼 수 있듯이 더 높은 혈압과 동맥 탄성(Ea)을 나타냈으며 심실 수축기 동안 ?...

토론

우리는 경식도 페이싱의 적용과 압력-부피 관계를 평가하는 방법론을 제시합니다. 운동 과민증은 HFpEF의 주요 특성 중 하나이지만 운동 중 쥐의 심장 기능을 평가하는 데 사용할 수 있는 기술은 없습니다. 우리의 페이싱 프로토콜은 휴식 상태에서는 분명하지 않을 수 있는 이완기 기능 장애를 감지하는 데 유용한 도구를 제공합니다.

정확하고 일관된 품질의 PV 루프를 달성하?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-0 silk suture, sterlie	Alfresa Pharma Corporation, Osaka, Japan	62-9965-57	Surgical Supplies
2-Fr tetrapolar electrode catheter	Fukuda Denshi, Japan and UNIQUE MEDICAL, Japan	custom-made	Surgical Supplies
Albumin Bovine Serum	Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japan	01859-47	Miscellaneous
C57/BI6J mouse	Jackson Laboratory		animals
Conductance catheter	Millar Instruments, Houston, TX	PVR 1035
Electrical cautery, Electrocautery Knife Kit	ellman-Japan,Osaka, Japan	1-1861-21	Surgical Supplies
Etomidate	Tokyo Chemical Industory Co., Ltd., Tokyo Japan	E0897	Anesthetic
Grass Instrument S44G Square Pulse Stimulator	Astro-Med, West Warwick, RI		Pacing equipment
Isoflurane	Viatris Inc., Tokyo, Japan	8803998	Anesthetic
Ivabradine	Tokyo Chemical Industory Co., Ltd., Tokyo Japan	I0847	Miscellaneous
LabChart software	ADInstruments, Sydney, Australia	LabChart 7	Hemodynamic equipment
MPVS Ultra	Millar Instruments, Houston, TX	PL3516B49	Hemodynamic equipment
Pancronium bromide	Sigma Aldrich Co., St. Louis, MO	15500-66-0	Anesthetic
PE10 polyethylene tube	Bio Research Center  Co. Ltd., Tokyo, Japan	62101010	Surgical Supplies
PowerLab 8/35	ADInstruments, Sydney, Australia	PL3508/P	Hemodynamic equipment
PVR 1035	Millar Instruments, Houston, TX	842-0002	Hemodynamic equipment
Urethane (Ethyl Carbamate)	Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan	050-05821	Anesthetic
Vascular Flow Probe	Transonic, Ithaca, NY	MA1PRB	Surgical Supplies