瞬态吸收数据的处理、拟合和解释简介

摘要

该协议是初学者处理、拟合和解释瞬态吸收光谱的入门级工具。该协议的重点是准备数据集，并使用单波长动力学和全局寿命分析进行拟合。讨论了与瞬态吸收数据及其拟合相关的挑战。

摘要

瞬态吸收 （TA） 光谱是一种强大的时间分辨光谱方法，用于通过系统吸收光谱的变化来跟踪激发态过程的演变。TA 的早期实施仅限于专业实验室，但商业交钥匙系统的发展使该技术越来越多地被世界各地的研究小组使用。现代 TA 系统能够生成具有高能量和时间分辨率的大型数据集，其中包含丰富的光物理信息。然而，由于存在大量的激发态特征和仪器伪影，处理、拟合和解释 TA 光谱可能具有挑战性。在收集、处理和拟合 TA 数据时，必须仔细考虑许多因素，以减少哪个模型或一组拟合参数最能描述数据的不确定性。数据准备和拟合的目标是尽可能多地减少这些无关因素，同时保留数据以供分析。在这种方法中，为初学者提供了处理和准备TA数据的协议，并简要介绍了选定的拟合程序和模型，特别是单波长拟合和全局寿命分析。对一些常见的数据准备挑战和解决这些挑战的方法进行了评论，然后讨论了这些简单拟合方法的挑战和局限性。

引言

瞬态吸收 （TA） 光谱是一种时间分辨光谱技术，它通过光脉冲激发后吸收光谱的随时间变化来监测光激发物质的进化。由于 TA 是一种吸收技术，因此可以识别由同时经历辐射跃迁（即通常发射光子的状态）和非辐射跃迁（通常为非荧光并经历内部转换、系统间交叉或参与光反应的状态）的状态产生的光谱信号，并遵循其演化 ^1,2.根据激发源和检测方法的具体情况，TA可以访问从飞秒到超微秒以及从紫外到远红外的动力学，使其成为一种多功能光谱工具。在过去的几十年里，TA光谱仪的商业化取得了长足的进步，导致更多的实验室和设施能够使用这种强大的技术²。

现代 TA 系统能够生成具有高能量和时间分辨率的大型数据集。数据集通常采用透射率或吸光度差值的二维矩阵的形式，作为相对于激发脉冲的波长和时间延迟的函数。该数据集可以看作是二维热图或三维地形图。随着研究人员在生成最能描述其感兴趣系统的拟合时努力包括整个数据集，对这些数据的解释变得更加复杂³.

尽管TA可以覆盖广泛的波长和时间尺度，但该协议侧重于其最广泛使用的形式^之一4：由飞秒脉冲激光驱动的紫外可见光区域的宽带光谱。图1提供了这种仪器的原理图^5,6。实验首先从激光中获取脉冲并将其分成两份。脉冲的一个副本，称为“泵”，用于激发样品。光学参量放大器（OPA）等器件通常用于将泵浦脉冲转换为所需的激励波长^5,7。脉冲的第二个副本，称为“探头”，进入机械延迟级，该级可以通过改变脉冲传播的距离来改变泵浦和探头脉冲之间的时间延迟。然后使用蓝宝石或氟化钙 （CaF₂） 晶体⁸ 将单波长探针脉冲转换为白光连续谱。白光脉冲通过样品，并使用宽带探测器（如电荷耦合器件 （CCD） 相机）测量其光谱。通过测量带泵和不带泵的白光脉冲光谱的变化，可以测量泵浦引起的样品吸收光谱的变化，即ΔA（T）。有兴趣的读者可以参考这篇有用的评论⁹，以获取有关检测过程的更多信息。

在所有形式的TA光谱中，ΔA（t）谱的计算方法是在给定的时间延迟t下，两个脉冲^2,5,9,10之间的基态吸收（A_探针）和激发态（A_{泵浦+探针}）之间的差值。

(1)

请注意，_探头 等同于样品稳态吸收光谱，并且与时间无关;实验的时间分辨率源于 A_{泵 + 探头} （t） 中捕获的泵和探头之间的延迟。这些数据的模拟如 图2A所示。

与稳态吸收光谱相比，由于公式 1 中的差异，TA 光谱可以同时具有正和负特征。正特征是由泵浦脉冲产生的新吸收物质的结果，可以表示激发的发色团态、三重态、几何重排、溶剂化效应或激发态光产物³。识别这些特征并将其分配给化学物质的一般准则将在讨论中介绍。负特征可能来自基态漂白剂（GSB）或受激发射（SE）（图2B）。GSB是由于吸收泵浦脉冲后基态人口的损失。被提升到激发态的分子不再吸收与其基态相同的区域;因此，吸收的探头脉冲 较少 ，并且等式 1 中的差值在该区域可能为负值。GSB的特点是具有与基态吸收相同的光谱形状，但具有相反的符号。SE 信号由探针脉冲³ 激发的激发态物质发射产生。这些物质的发射导致 更多的光 到达探测器，这相当于在这些波长处的 吸收较少 。SE信号将具有与该物种的自发发射光谱相似的频谱形状，但具有负号和不同的频率权重¹⁰。

除了有关激发态物质的信息外，TA光谱还可能包含许多伪影和无关特征，这些伪影和无关特征可能会扭曲潜在的动力学并模糊吸收带¹¹的分配。在数据编制和分析中对这些工件的不当处理可能导致对数据应用不适当的光物理模型，从而得出误导性结论¹¹.因此，该协议的第一部分重点介绍如何在收集 TA 数据集后对其进行正确处理。本节的目标是为刚接触 TA 的研究人员提供一套指南，这些指南将有助于培养对严格准备和处理数据的直觉和欣赏。

处理数据集后，可以使用大量工具和模型来拟合和解释具有不同复杂度和严谨性的光谱¹⁰。该协议第二部分的目标是让读者准备好将单波长拟合和全局分析应用于数据，并就这些模型何时适合描述其数据提供指导。现在，商业软件可用于准备和处理 TA 数据，例如 Ultrafast 系统的 Surface Xplorer^12,13（可免费下载和使用，请参阅材料表）。学术研究人员已经发布了其他免费替代品，例如 Glotaran¹⁴。Glotaran 是一款免费软件程序，专为时间分辨光谱和显微镜数据的全局和目标分析而开发。它用作 R 封装 TIMP¹⁴ 的图形用户界面 （GUI）。此外，用户可以使用 Python 等编程语言编写自己的代码来执行分析。这些配件软件和编程解决方案中的每一个都具有积极的功能，使它们做出了重要贡献。出于本研究的目的，我们只能为这项活动的视觉组件提供一种软件。对每个试穿软件的深入讨论超出了本文的范围。

本文提供了 （1） 处理 TA 数据，（2） 使用单波长动力学和全局分析拟合 TA 数据，以及 （3） 提取数据并将其拟合到其他模型的分步过程。包括一组具有代表性的 TA 数据供读者用作练习（补充文件 1 和 补充文件 2）。该数据是在 330 nm 处激发并在 −5 ps 至 5.5 ns 范围内收集的 1,4-双（5-苯基噁唑-2-基）苯 （POPOP） 的 165 μM 样品在乙醇中的测量值。此外，在相同的实验条件下，在-5 ps至5 ps的范围内收集仅含有乙醇的“空白”样品，不收集样品，用于准备拟合数据（步骤1）。使用超快瞬态吸收光谱仪收集光谱。将样品包含在2mm光程比色皿中，并不断搅拌。所描述的处理和拟合过程基于 Surface Xplorer 软件，该软件拟合 *.ufs 格式的数据，在此称为“拟合程序”。可用于将其他格式的数据集转换为 *.ufs 文件的程序¹⁵.尽管此协议的详细信息特定于 Surface Xplorer，但以下步骤可推广到任何商业或家庭构建的软件包。此外，可以使用这些其他软件包提取和拟合数据处理的结果。支持信息文件（补充文件 3）提供了有关安装的其他建议。

研究方案

1. 准备拟合数据

1. 将 SAMPLE 数据集加载到 Fitting 软件中。数据如 补充图 1 所示。
2. 当实验的光学检测窗口内存在散射激发光时，使用减去 散射光 选项（补充图2）。如果数据中不存在散射激发光，请继续执行步骤 1.5。
   注意：当激发波长落在光学窗口内时，最常观察到散射光。散射光在激发波长（或某些衍射阶数，或OPA中产生的波长）处表现为尖锐的负（漂白）特征，不随时间变化。
3. 单击“ 曲面 ”菜单，然后单击“减去 散射光 ”选项（补充图 2）。将出现一个新窗口。
4. 在新窗口中，单击 箭头 按钮将背景光谱的数量设置为平均值（补充图3），以便执行背景校正。使用十个光谱提供了一个很好的起点，并且可以根据需要调整数量。单击 “接受 ”以执行减法（继续执行步骤 1.7）。
   注意：背景光谱是从数据集中存在的第一个光谱中提取的，然后根据需要使用尽可能多的背景光谱在时间上向前移动，以提供背景信号的平均值;但是，使用过多将开始使用包含目标信号的光谱，因此不要使用太多。对于较长的时间窗数据，散射特征可能不会出现在数据的时间窗结束时。如果时间窗口超过相机集成时间，或者根据 TA 实验的构造方式，或其他原因，可能会发生这种情况。要更正此问题，可以使用 补充文件 3 中概述的设置时间范围选项。
5. 对于光学窗口中不存在散射光的数据，请单击“ 表面 ”菜单，然后单击“ 减去背景 ”选项。
6. 在出现的窗口中，单击右下角的箭头按钮，将“光谱数”平均（选择 10），然后单击接受。
   注意：此选项中的背景光谱功能与“减去散射光”选项中的功能相同。从十个光谱开始提供良好的平均。可以使用更多的光谱，但必须注意不要使用太多，以避免包含包含感兴趣信号的光谱。Surface Xplorer 的用户手册描述了“减去散射光” 与“减去散射光”所应用校正的差异。更基本的“减去背景”校正。对工件¹⁶ 应用适当的校正非常重要。
7. 光学窗口边缘附近的数据可能具有非常低的信噪比，这是由于探头光谱的形状和/或样品吸收了过多的白光。这些区域的嘈杂数据使分析更加困难。删除频谱中这些无用的部分。单击光谱上的 结束波长 （左下角图块），输入新值（补充图4），然后单击 回车键。选择一个波长范围，以消除窗口边缘的噪声数据。对于提供的数据，范围为 340-680 nm。
8. 完成光谱窗口到所需波长范围的调整。单击 “表面 ”菜单，然后单击 “裁剪 ”（补充图 5）。将出现一个弹出窗口。
   1. 单击 “确定”。单击 “文件 ”菜单，然后单击“ 将文件另存为”。然后，单击 “确定”。关闭此数据集。
      注意：裁剪时要小心，因为该函数将沿波长和时间延迟轴裁剪数据，删除所有其他数据。确保时间延迟窗口包含要保留的数据部分。此外，强烈建议将任何裁剪的数据另存为新的、适当标记的文件，以便将原始数据图面完好无损地保留为备份。
9. 对于在 fs 或 ps 时间尺度上收集的数据，必须应用啁啾校正。打开数据表面，仅使用与数据相同的实验设置中采集的溶剂或底物（无样品）。此示例称为“空白”实验运行。对“空白”数据（从步骤 1.2 到步骤 1.8）执行与对示例数据执行的步骤相同的步骤集。
   注意：强烈建议在与样品相同的条件下运行这种“空白”实验，但时间窗口较短（例如，~ −5 ps 至 5 ps），以确保在时间零附近有大量点。根据样品类型，这种“空白”运行应仅由溶剂或底物组成，并用于建立啁啾曲率。到目前为止，“空白”的准备应遵循与样本数据相同的背景校正和裁剪。如果未运行“空白”，则可以直接在数据集上进行啁啾校正。
10. 开始啁啾校正过程。在热图磁贴（左上角）中，单击 十字准线 并将垂直线分量拖动到光谱的蓝色端。从光谱窗口起点附近的蓝色波长范围开始。单击“ 动力学 ”菜单，然后单击 “拟合溶剂响应”。
    注意：拟合溶剂响应只能在“空白”样品上执行，该样品不会产生任何超过时间零的信号。尝试将此拟合函数应用于包含感兴趣分子或材料数据的数据集将导致程序尝试拟合数据而不是 IRF（仪器响应函数）。对于“空白”样品，唯一存在的信号应该是由交叉相位调制产生的相干伪影。交叉相位调制仅在泵浦和探头光束重叠的地方发生，因此，可以使用“拟合溶剂响应”选项提供线性啁啾曲率的轨迹。对于没有附带“空白”的数据，需要手动放置点以用于校正，并在 补充文件 3 中进行了更详细的描述。
11. 将打开一个新的“适合溶剂响应”窗口。单击 “适合 ”按钮（补充图 6）。拟合将使用高斯的一阶导数和二阶导数生成对仪器响应函数的拟合。单击 “保存 ”按钮，然后单击 “x ”关闭屏幕。
    注意：红色拟合线应在整个时间范围内与数据点（蓝色空心方块）很好地匹配，最重要的是在时间零（0.1-2.0 ps）附近看到的大特征。如果时间零附近有大量点，则拟合将最成功，这可以通过对“空白”实验使用较短的时间延迟窗口并保留大量点来实现。如果拟合似乎与数据点不匹配，请选中“添加高斯 （R0）”框并重试拟合。此选项将高斯之和添加到一阶导数和二阶导数中，并且可能更好地拟合此波长下的 IRF 特征形状。如果溶剂响应拟合仍然无法捕获 IRF 信号，请选择不同的波长。
12. 执行此过程（步骤 1.10-1.11）至少五次，因为需要 5 个点才能正确纠正啁啾声。如果可能的话，这些点应该在整个光谱窗口中间隔开来。根据实验条件，某些溶剂/底物可能不会在光谱窗口的某些部分产生可观察到的信号。可以根据需要添加/使用更多点，以产生可接受的贴合度。完成后，关闭“空白”数据集。
    注意：用户单击 “保存”后，每个保存的点都会作为新行写入工作文件夹中的 Excel 文件。如果保存了不需要的点，则可以通过删除不需要的点的行从 Excel 文件中删除该点。
13. 重新打开裁剪和背景减去的数据集。单击“ 表面 ”菜单，然后单击“ 啁啾校正 ”选项。这将打开一个带有三个窗口和右下角菜单的新屏幕（补充图 7）。
14. 添加刚刚创建的啁啾校正。单击“ 从文件添加 ”选项，选择以“拟合系数”结尾的 Excel 文件，然后单击 “确定”。啁啾校正拟合现在显示在左上角窗口中，显示为带有 X 标记的黑线（补充图 8）。
    注意： 啁啾校正显示为实线;沿线的 X 标记是从拟合溶剂响应过程中产生的点。可以通过调整十字准线并单击 添加来手动添加点。也可以通过突出显示点并按 “删除”来删除点。可以通过在右下角的列表中输入值来手动编辑其他要点。最后，如果需要，还可以将当前校正保存为文件，以便以后使用 “保存到文件 ”按钮重复使用。
15. 单击 “预览啁啾校正 ”按钮。这将暂时应用啁啾校正。观察左上角窗口中的校正，以确保数据在时间上已变平，并且不再可观察到曲率。
    1. 如果对啁啾校正感到满意，请单击 “应用并退出 ”按钮。如果不满意，请重复步骤 1.10-1.14，选择更多（或不同）波长进行啁啾校正拟合，直到获得令人满意的校正。
       注意：应用啁啾校正会将时间零调整为预览中显示的拉直线。“空白”和数据图面之间可能存在一些时间错位。
16. 单击 “文件 ”菜单，然后单击“ 将文件另存为”。键入文件的适当名称，以指示已应用啁啾校正。然后，单击 “确定”。
17. 执行背景减法时，数据中的某些散射特征可能无法完全去除。这些特征会影响拟合并产生错误的拟合结果。在数据中找到应移除的任何此类要素。散射特征在负时区最容易识别。
    1. 在左上角的热图磁贴中，单击十字 准线 并将其拖动到负时间区域。保持在负时间区域内，使用十字准线确定散射特征开始和结束的波长。请注意散射特征的波长范围（对于提供的数据集，特征范围为 654 nm 至 672 nm）。
       注意：在确定是否应删除要素时，请在时间轴上上下拖动水平十字准线以可视化要素的光谱范围。散射特征通常具有非常嘈杂的单波长动力学迹线，因此也可以使用动力学迹线来验证特征的光谱范围。
18. 从较低（蓝色）波长（即 654 nm）开始，单击光谱（左下角图块）上的 右端波长 ，然后输入较低（蓝色）特征范围的值。
19. 通过单击“ 表面 ”菜单来裁剪数据，然后单击 “裁剪”。单击弹出菜单中的 确定 。使用唯一的文件名保存裁剪的数据，以指示这是数据的哪一侧（建议使用蓝色或左侧）。关闭文件。
20. 使用在步骤 1.16 中保存的应用的啁啾校正打开文件。继续到要素的较高（红色）波长范围。单击光谱上的 左端 波长（左下图块），然后输入特征较高范围的值。
21. 通过单击“ 表面 ”菜单来裁剪数据，然后单击 “裁剪”。单击弹出菜单中的 确定 。使用唯一的文件名保存裁剪的数据，以指示这是数据的哪一侧（建议使用红色或右侧）。
22. 通过单击“文件”（ File ） 菜单合并两个文件，然后单击 “合并多个曲面”（Combine Multiple Surfaces）。在新窗口中，选择数据的两边（即“左右”或“蓝色”和“红色”）。使用 ctrl + 单击 选择每个文件。验证是否在“文件名：”框中选择了两个文件，然后单击右下角的 “确定”。进度条完成后，数据已合并。
    注意：可以以这种方式组合任意数量的文件。数据可以在时间和波长轴上的多个切割中拼接在一起。
23. 单击“ 文件 ”菜单，然后单击“ 将文件另存为 ”并选择一个唯一的文件名以指示它已合并（建议使用“组合”或“复合”）。然后，单击 “确定 ”保存文件。
    注意：有关如何从原始数据窗口保存数据以供以后显示和绘图的信息，请参阅第 3 节。热图（左上角图块）中的数据应如 图 3 所示，现在已准备好进行拟合。如 图3所示，可视化代表性光谱在步骤3.1.2中描述。

2. 执行拟合

1. 加载正确准备的数据图面。
2. 确定将执行哪个拟合并移动到相应的部分。
   注意：该协议提供了两个数据拟合选项：步骤2.3提供了单波长动力学迹线拟合，步骤2.4提供了全局分析拟合。
3. 单波长拟合
   1. 要设置单个动力学拟合，请将光标（在左上角或左下角的磁贴中）移动到所需的波长。单击“ Kinetics ”菜单，然后单击 “Fit Kinetic”。对于提供的数据集，从 632 nm 开始。
   2. 在打开的新窗口（补充图 9）中，请注意，主要拟合参数和种子值设置在窗口左上角的程序徽标下方，该区域旁边的框中，在“当前拟合 @ 波长”文本下。
   3. 单击 箭头 按钮以调整“有限生存期”框中的生存期数（即用于拟合数据的指数衰减数）。对于提供的数据集，选择 2 生存期。1 到 3 个生命周期是典型的起点。
   4. 如果数据信号超出收集的时间窗口，则应包含“无限”寿命分量。为此，请单击 “使用无限生存期 ”复选框。如果数据完全衰减到基线，请不要选中此框。对于提供的数据集，请勿选中该框。
      注意：“无限寿命”允许保持信号偏移（即，程序不会强制拟合衰减回基线）。当该波长的信号在实验的时间范围内没有衰减到基线时，需要使用无限分量。
   5. 输入寿命和相关振幅、仪器响应时间和零点时间的猜测值，以帮助拟合过程（补充图 10）。单击所需的参数。在值窗口中单击，键入一个猜测值，然后单击 初始猜测 按钮以设置该值。对于提供的数据集，适当的猜测值为：0 = 0 ps、IRF = 0.25 ps、A1 = 0.6、t1 = 100 ps、A2 = 0.08、t2 = 1100 ps。
      注：“0”是时间零的估计值，“IRF”是仪器响应时间，“A”是指给定指数的振幅（见公式3），“t”是寿命/时间常数。提供良好的猜测值有助于程序获得合理的拟合。选择数据集中 A 范围值内的“A”值。在动力学迹线中观察到显著变化的时间范围内选择“t”值。获得关于猜测值如何影响拟合的直觉的最佳方法是尝试几组猜测值并观察它们产生的拟合。如果这些参数中的一个或多个是已知的，则可以设置和“固定”该参数，使其不会随拟合而变化（补充图11）。
   6. 输入所有猜测参数后，单击 “适合 ”按钮。代表性拟合如 图 4 所示。
      注意：应用拟合将使用拟合线和可用于评估拟合质量的残差图填充数据图。拟合参数（如寿命和相关振幅、时间零点和仪器响应时间）也填充在左上角的框中。使用多个不同的拟合参数来确定生存期的数量以及包含/排除产生对数据的最佳拟合的“无限”时间分量。
   7. 通过单击 “保存 ”按钮保存拟合（补充图 9）。
      注意：有关如何从原始数据窗口保存数据以供以后显示和绘图的信息，请参阅第 3 节。
4. 全局分析拟合
   1. 单击“ 表面 ”菜单，然后单击“ 通过 SVD 的主成分 ”选项。此时将显示一个新窗口（补充图 12）。
      注：右上角窗口显示主动力学迹线，左下角显示主光谱。左上角的磁贴显示 由原始曲面与所选主成分创建的曲面之间的差值创建的残余曲面图。
   2. 单击 箭头 按钮以设置“主成分数”（补充图 12）。对于提供的数据集，选择 15。
      注意：在决定选择主成分的数量时，一种方法是不断增加数量，直到主光谱和主动力学迹线都类似于噪声模式。确定要选择多少个主成分的另一种方法是查看右上图块中图例左侧显示的权重系数值。继续添加主成分，直到此值达到 0.01。一般来说，建议在此基础上再添加一些，以达到良好的效果。这可能会导致选择多达 15 个或更多主成分。
   3. 单击 “保存 ”按钮。需要保存的主组件才能进入下一步。
      注意：每个主组件都是原始数据图面的简化复杂度表示形式。与要分析的原始数据相比，使用主成分将导致简化的表面。考虑数据表面的大多数主要特征对于获得准确的拟合非常重要，因此使用足够的主成分来捕获这些特征至关重要。使用更多的主成分不会影响配合。因此，如果对选择多少主成分有任何疑问，请使用更多的主成分而不是更少的主成分。请记住，使用过多可能会减慢验配软件的速度。
   4. 保存主组件后，程序将返回主屏幕，现在可以尝试全局拟合。单击 “曲面 ”菜单，然后单击“ 全局拟合 ”选项。将打开一个新窗口（补充图 13）。
      注意：主动力学迹线显示在右上角的磁贴中。左上角的磁贴将显示拟合曲面与原始曲面的比较。左下角的图块将显示拟合生成的衰减相关差分谱 （DADS）。最后，右下角的磁贴是可以设置拟合参数的地方，包括要使用的指数函数的数量以及是否使用无限函数。
   5. 使用“经验值”旁边的 箭头 按钮设置拟合中要包含的指数函数数。如果数据信号超出收集的时间窗口，则应包含“无限”寿命分量。为此，请单击 “使用偏移量 （Ainf）” 复选框。对于提供的数据集，选择 2，不要单击该框。如果数据完全衰减到基线，请不要选中此框。
      注意：在执行拟合之前，可以通过单击右下角框中全局拟合系数下的标签列来修复拟合参数。标签将变为红色，并更改为标签上有一个（固定）指示器。在右侧框中键入的任何值都将用于该参数，而不是根据拟合自由变化。在确定拟合值时应小心，因为这可能会使拟合结果产生偏差。
   6. 单击 “适合 ”按钮。适合进度将通过屏幕中央的小加载栏显示。完成拟合进度后，窗口将填充拟合数据（图 5 和 补充图 14）。目视检查拟合结果。
      注意：来自主动力学拟合和 DADS 的信息用于确定拟合是否值得保存或太差。通常，如果主迹线的拟合与数据匹配良好，并且图中没有 特征或特征很少，则可以接受拟合。通过更改生存期和/或选中/取消选中“使用偏移 （Ainf）”按钮，可以轻松检查多个拟合。在检查拟合参数的多种变化后产生的最佳拟合应被接受。
   7. 单击 “保存 ”按钮。这会将当前显示的拟合度与数据一起保存在 Excel 文件中。
      注意：Excel 文件保存在与数据集相同的文件位置。如果执行了其他拟合并需要保存，它们将覆盖任何以前的版本。因此，在生成和保存新拟合之前，请为任何旧拟合指定一个唯一的名称。从拟合中保存的参数仅包括时间零、IRF、生存期及其随附的 DADS。此文件不包含有关 绘图或主动力学迹线拟合的任何信息。步骤 3.3 中概述了保存主动力学迹线。有关如何保存原始数据窗口中的数据以供以后显示和绘制的信息，请参阅步骤 3.0。

3. 从拟合软件中提取原始数据和拟合以进行绘图

注意：从单波长拟合或全局分析产生的原始数据或拟合可以导出到 csv 文件，这些文件可以在一系列其他程序中打开。

1. 提取原始数据进行绘图
   1. 要导出数据集的热图，请单击 “文件 ”菜单，然后单击 “导出到 CSV ”（补充图 15）。这将打开一个窗口，单击 “确定 ”将csv文件保存在与数据文件相同的目录中，打开与数据文件同名。
      注意：或者，可以通过右键单击热图窗口并单击 “将数据导出到剪贴板”来导出原始数据。这将暂时保存数据，以便将其粘贴到用户选择的软件文档中。将数据粘贴到 Excel 文件中，然后保存数据。
   2. 多个光谱可以显示在窗口中进行比较或用于制作图形。将 水平光标 （在热图中，左上角）拖动到所需的时间点。按 Ctrl + S 选择频谱并将其保存在频谱窗口（左下角）中。根据需要添加尽可能多的时间点以显示数据的进展（5-10 个光谱），如 图 3 所示。
      注意：选择用于表示数据的光谱数量和这些光谱的时间排列可能在很大程度上取决于特定的样品和实验条件。上述建议是一般准则，但实验的细节应决定强调数据集的哪些部分。
   3. 通过右键单击包含光谱的窗口导出为数据。单击“ 将数据导出到剪贴板 ”选项。数据是临时保存的。将此数据粘贴到所需的软件文档（即 Excel）中并保存。
   4. 多个动力学轨迹可以以与光谱窗口相同的方式显示在动力学窗口中。将 垂直光标 （在热图中，左上角）拖动到所需的波长。按 Ctrl + X 选择时间轨迹并将其保存在动力学窗口（右上角）中。根据需要添加任意数量的时间点。这将暂时将当前动力学迹线保存在窗口中。
   5. 通过右键单击包含动力学迹线的窗口导出为数据。单击“ 将数据导出到剪贴板 ”选项。数据是临时保存的。将此数据粘贴到所需的软件文档（即 Excel）中并保存。
2. 从单波长拟合中提取数据进行显示
   1. 单击“动力学”（ Kinetics ） 菜单，然后单击 “拟合动力学”（Fit Kinetic ） 以打开包含拟合数据的窗口。
   2. 右键单击 适合 窗口（即单个适合窗口中的中央磁贴）。单击 将数据导出到剪贴板。这将暂时保存它，以便可以将其粘贴到其他软件程序中。
      注意：无法导出拟合数据下方的残差图，而必须从拟合数据重新创建。拟合会导出原始数据和拟合线，然后可用于重新创建残差。残差是通过从每个时间点的数据中减去拟合值，并创建类似于“拟合动力学”窗口中显示的图来创建的。
   3. 将此数据粘贴到所需的软件文档（即 Excel）中并保存。
      注意：导出到剪贴板将仅包括拟合中使用的每个指数的原始数据和拟合线数据。拟合的参数（如寿命、振幅等）将不包括在内，必须通过从拟合软件复制值来导出。
3. 从全局生命周期分析中提取数据以进行显示和分析
   1. 单击“ 曲面 ”（Surface） 菜单，然后单击“ 全局拟合”（Global Fit ） 选项以打开包含拟合数据的窗口。
   2. 需要分别调整主成分（右上图）和 DADS（左下图）的光密度和时间延迟/波长轴值的精度。将鼠标悬停在主组件窗口上，直到设置框出现在右下角。
   3. 快速单击 x.xx 按钮，将鼠标悬停在“精度”上，然后单击菜单中的 6 以设置要包含的小数位数。
   4. 将鼠标悬停在主组件窗口上，直到设置框出现在右下角。快速单击 y.yy 按钮，将鼠标悬停在“精度”上，然后单击菜单中的 6 以设置要包含的小数位数。
   5. 右键单击 “主动力学迹线”（Principal Kinetic Traces） 窗口。单击 将数据导出到剪贴板。这将暂时保存它，以便可以将其粘贴到其他软件程序中。
   6. 将此数据粘贴到所需的软件文档（即 Excel）中并保存。
      注意：数据将保存为一系列列，首先包含时间延迟，然后是主动力学轨迹，然后是拟合线。在准备全局分析时，将为选择的每个主成分提供一组。DADS谱图已保存为步骤2.4.7中拟合程序的一部分。

讨论

数据准备的一般注意事项
乍一看，拟合 TA 数据似乎相对简单，并且可以预期给定数据集应该产生一个明确的正确“答案”。然而，正如协议中强调的那样，在数据采集、数据准备和数据分析中有许多因素需要仔细考虑，这些因素可能导致哪个模型或拟合参数集最能描述数据的不确定性。数据准备和拟合的目标是尽可能多地减少这些无关因素，同时保留数据以供分析。对于初学者来说，手头的任务可能看起来令人生畏，因为有很多事情需要考虑。为了建立关于拟合过程的直觉，我们鼓励初学者尝试以略有不同的方式从头开始多次准备相同的数据，以检查数据准备步骤对最佳拟合的影响有多大。此外，两个不同的研究人员可以准备和拟合相同的数据并比较结果。这个过程在前几次可能很耗时，但是，这样做将使初学者能够就如何始终如一地为未来的样品准备数据产生直觉。与任何技能一样，这种数据准备和拟合需要时间来发展，鼓励初学者在试验和学习该过程时保持耐心和纪律。本研究中使用的数据集旨在让初学者有机会直接与教程一起使用，并直接将结果与教程中产生的结果进行比较。

数据可能包含所有时间延迟都存在 的背景特征 （补充图2 和 补充图3），例如泵浦光束的散射和样品的自发发射。必须去除这些不需要的特征，以便将瞬态吸收信号与感兴趣的物种^{隔离开来11}。通过选择、平均和消除许多负时差光谱的贡献来去除这些特征。在选择背景光谱时，重要的是要确保不包括可能属于感兴趣过程的特征。在TA数据中也可以观察到溶剂产生的背景特征，例如杂质或溶剂本身的吸收。当溶剂产生信号时，需要从样品数据集中减去在与样品完全相同的实验条件下运行的仅包含溶剂的“空白”数据集。有关此程序的详细信息包含在 补充文件 3 中。

啁啾校正是另一个需要仔细考虑的因素。当探头脉冲传播到样品时，由于转向镜的缺陷或通过色散光学元件（如透镜或滤光片）而变宽，就会发生啁啾。最终结果是，探针脉冲中的低能量光子（即探针光谱的红色侧）在高能光子（即探针光谱的蓝色侧）之前到达样品。这导致 TA 光谱的“时间零”在几飞秒或皮秒¹⁸ 内被涂抹掉，这在原始数据集中表现为一条明显的曲线，从蓝色波长开始，然后在接近红色波长时变平（补充图 7）。啁啾在较短的时间尺度上最为明显，例如超快 TA 访问的时间尺度。这种与波长相关的时间零点可以按照协议中的描述进行校正，但这个过程的应用可能是棘手和主观的。使用“空白”样品或测量溶剂 Kerr 响应可以最大限度地减少手动拾取点的主观性，以生成用于调整和校正啁啾的多项式拟合所需的啁啾校正。啁啾校正的目标是消除时间零点的明显“曲线”。可能需要多次尝试拟合啁啾才能获得最佳的啁啾校正数据。可以通过应用不同的啁啾校正对数据进行多次拟合，以便了解啁啾校正对短 TA 生存期值的影响。

在“时间零”时出现的伪影
在TA数据中可以观察到一些接近“时间零”的伪影，包括瑞利散射、受激拉曼散射和交叉相位调制。泵浦梁的瑞利散射是在不改变能量的情况下产生的弹性散射。此特征将出现在与泵浦脉冲相同的波长处。受激发拉曼散射可以伴随泵散射^信号19。拉曼散射是由泵浦光子的非弹性散射引起的，在比入射泵浦能量更高（反斯托克斯）和更低（斯托克斯）能量时产生峰值。在TA数据中，由于泵浦和探针光束同时照射样品，观察到受激发拉曼散射。当探针束与泵浦束同时与样品相互作用时，它会刺激拉曼过程。因此，受激发的拉曼散射发生在时间零附近，并在最初的几百飞秒内导致光谱中出现额外的峰值（图6，在突出显示区域的深蓝色光谱和 补充图17中观察到）。交叉相位调制源于与脉冲强电场相互作用对溶剂折射率的调制。

受激拉曼散射可以与交叉相位调制区分开来，因为拉曼峰出现在与溶剂振动模式相对应的特定频率下。由于它是拉曼过程，因此可以观察到激励两侧的斯托克斯线和反斯托克斯线。氯化溶剂（如二氯甲烷）由于氯的极化率大，显示出非常突出的拉曼谱带。交叉相位调制的光谱特征是溶剂所特有的，但不像拉曼散射特征那样容易预测。

根据被测样品的动力学，瑞利散射、拉曼散射和交叉相调制可能与TA数据的早期特征重叠，并且很难从数据中删除。原则上，这些特征可以在干净的溶剂测量中看到并从数据中减去，数据分析程序可能具有拟合功能来解释这些特征，但在实践中，这可能很困难。如果很难在不影响样本数据的情况下减去这些伪影，则最好在零时间附近裁剪出受损的光谱以消除伪影。这样做会带来不幸的副作用，即删除前大约 300 fs 的数据，但会使以后的拟合更加可靠。在分析相同和不同样本的多个数据集的过程中，初学者将获得直觉，以实现减去背景表面与裁剪掉初始 100-200 fs 数据的平衡。

对于包含低信噪比的光谱部分，可能需要进行常规裁剪。探头光束在某些区域的不稳定性、探头光强度低、样品浓度过高（从而阻挡了大部分入射探头）、泵浦强度低以及样品的吸收横截面是低信噪比的典型罪魁祸首，这可能使拟合数据具有挑战性。在这些情况下，裁剪光学窗口两侧的数据集以达到所需的信噪比水平有助于拟合过程。

一旦数据集被充分裁剪以删除数据集的不良部分，纠正了啁啾声，并平均和减去背景光谱，就可以进行分析了。此过程应生成的数据仅包含与感兴趣的光物理学和光化学最相关的部分。事实上，很明显，这一过程存在一定程度的主观性。数据准备的目标是在去除伪影（使其不会干扰拟合）和删除伪影（以致损害数据集的完整性从而阻碍其解释）之间取得平衡。找到这种平衡需要时间和经验来建立对什么是工件和什么是数据的直觉。在多个不同的日子拟合（和重新拟合）同一组数据，或让两名研究人员拟合相同的数据，可以最大限度地减少人为错误以及数据准备和分析的主观性。

拟合和解释的一般注意事项
在处理原始TA谱图后，必须对它们进行解释和建模，以提取有关感兴趣系统中存在的物种和动力学的信息。这个过程可以被描述为一个三步程序，包括初始光谱解释、定量建模/拟合以及将光谱解释分配给模型/拟合。

初始光谱解释： 在光谱解释步骤中，目标是将 TA 光谱中存在的特征分配给在系统的光物理或光化学演化中访问的电子状态。首先，应确定各种状态。在这项工作中， 状态 是指独特的电子状态，这些电子状态是系统光物理或光化学演化的一部分。例如，由一条特定势能曲线 （PEC） 表示的状态具有一组代表其吸收光谱的特征峰。在单个状态内发生的更改称为 进程。光物理过程在TA光谱中可能表现为峰移或光谱宽度的变化。一个过程的关键方面是该州的人口保持不变（即，该过程发生在给定的 PEC 内）;改变的是状态内的能量分布。一个州人口的变化将被称为 过渡。在过渡期间，系统演化为另一个 PEC（即电子状态）。转变可能包括内部转换 （IC）、系统间交叉 （ISC）、电荷转移、能量转移、新产物的形成或返回基态。以下段落将讨论分配状态、过程和转换的准则。

分配状态
该过程的第一步涉及将光谱特征分配给特定的化学物质或状态。TA 中的 S₁ 状态应显示与使用时间分辨发射光谱法获取的荧光寿命相匹配的寿命。如果三重态的寿命被氧气淬灭，则可以验证其寿命。如果在光物理演化中怀疑存在自由基阴离子或阳离子，则可以进行光谱电化学或化学氧化/还原以生成自由基物种，并且可以获得该物种的吸收光谱并与TA带形进行比较。可以进行电子自旋共振 （ESR） 光谱以验证自由基的存在。由ACS无机化学部主办的精彩教程讲座概述了TA以及分配特征²⁰时的注意事项。在将波段分配给物种后，解释TA光谱的下一步是定性描述系统中发生的动力学过程。这一步至关重要，因为它让研究人员了解哪些模型适合描述他们的系统，并为他们提供一个基线来比较拟合参数。

状态内的变化
振动冷却、几何重排或溶剂化是极快的过程（sub-ps 到 10'ps ），可以用 TA 观察到。振动冷却被观察到为TA光谱在几皮秒时间尺度上的快速蓝移21,22,23。几何重排可能发生在 10 的 ps 时间尺度上。在传统的偶极液体中，溶剂化动力学被观察到为几皮秒内光谱的红移和变窄，但高粘度溶剂，如甘油、聚乙二醇 （PEG）、离子液体和深共晶溶剂可以表现出在多个纳秒内发生的溶剂化动力学 24,25,26。

州人口的变化
反应的特征是条带强度的变化，其中强度的降低与其化学物质浓度的降低有关， 反之亦 然。在某些情况下，反应物和产物种类在光谱中都是可见的，而在其他情况下，产物状态太短或红移太远而无法观察到。通常，可以通过光谱中存在等渗点来观察状态间的跃迁。

定量建模/拟合：然后必须将模型拟合到数据中，以便提取有关系统动力学的定量信息。如前所述，有大量的模型可供使用。该协议侧重于两种最常见的方法：单波长拟合和全局分析。单波长方法涉及将光谱中的单个波长迹线拟合为某种功能形式，通常是指数的总和：

(2)

其中 ΔA（t） 是所选波长下的 TA 信号，n 是指数分量的数量， a_i是指数分量 i 的幅度， 时间常 数 τ_i。可以添加多个组件，直到拟合重现实验数据。任何拟合过程的目标都是使用足够的生存期对数据进行建模，以便很好地重现数据，但不会因包含太多组件而过度拟合数据。因此，加权拟合优度参数（如 ）用于帮助确定数据何时拟合在实验不确定度⁵ 内。

在衰减得到令人满意的拟合后，模型的参数可用于表征系统的动力学。然后可以提取和解释生成的时间常数。不幸的是，TA光谱中的大量重叠特征意味着光谱中的单个波长可能包含对应于光谱特征重叠的不同物种的动力学，这意味着从单个波长拟合中提取的时间常数可能代表多个重合过程的复合。此外，带形和位置的任何变化也会影响从单波长拟合中提取的振幅和时间常数。在某些情况下，可以通过称为“带形分析”的拟合方法来规避这些问题，在这种方法中，人们确定或假设系统中每个吸收物质的TA带的功能形式。然后，这些形状通过随时间变化的振幅进行加权，并相加在一起，以重现观察到的光谱。该方法通常用于时间分辨荧光光谱的分析，但TA条带的更复杂的形状和重叠分量使得该方法仅在少数简单情况下站得住脚，详见其他部分¹⁰。

单波长拟合的另一个缺点是，它本质上没有利用现代TA实验提供的宽光谱范围。原则上，人们可以有条不紊地拟合光谱的每个波长，但这种分析既繁琐又耗时且计算成本高昂。为了应对这一挑战，可以使用一种称为“全局分析”的方法同时将一整套 TA 谱拟合到一组共享动态参数⁴ 中。全局分析和一种密切相关的方法（称为目标分析）是成功且广泛使用的方法，但它们也有其独特的缺点和局限性。与任何模型一样，必须了解用于创建模型的假设以及它们带来的局限性。

在全局分析中，TA 光谱由 m x n 矩阵表示，其中 m 表示每个光谱中测量的波长数，n 表示收集的时间点数。然后假设该矩阵可分解为其他两个矩阵的乘积：

(3)

其中 C（t） 是 n x k 矩阵，S（λ） 是 m x k 矩阵。值 k 表示用于再现光谱的不同光谱分量的数量。这些成分中的每一个都代表具有独特光谱特征和动力学的吸收物质。S（λ） 矩阵表示 k 组分的 TA 谱图，C（t） 表示其随时间变化的浓度。在最简单和最常见的全局分析实现中，假设每个分量都具有单指数动力学（等式 2 中的 i = 1，每个分量都有自己的时间常数）。总之，完整的TA谱可以用k个谱分量的总和来表示，每个分量都有自己的特征吸收谱和单指数衰减。

当 TA 谱拟合时，用户猜测需要多少个分量（即 k 的值），并猜测与这些物质的单指数衰减相关的时间常数。然后，拟合器生成 C_guess（t） 并求解 S_拟合 （t） 的方程 3。接下来，将 S_拟合 （λ） 和 C_guess（t） 相乘，如公式 3 所示，以创建拟合光谱 ΔA（λ，t）_拟合。最后，将残差 ΔA（λ，t）_exp − A（λ，t）_拟合最小化，并返回最佳 S_拟合 （λ） 和时间常数。全局分析相对简单，使用少量时间常数和固定光谱分量来表示一整套光谱，使其成为解开TA光谱中遇到的复杂带形和动力学的有吸引力（且成功）的方法。但是，必须注意确保全局分析是适合现有系统的模型。

公式 3 所示，全局分析中的一个关键假设是动力学的波长和时间部分的完全可分离性，这种特性称为“双线性”。该假设要求 分量带形与时间无关（即，它们具有固定的光谱形状，不会随时间变化或移动）。在实验过程中唯一变化的是每个成分的相对总体，用C（t）表示。在长时间尺度上，~1 ns 左右，这个假设通常成立，全局分析可以毫不费力地使用。另一方面，激发态过程，如振动冷却和溶剂化动力学，在飞秒TA可访问的超快时间尺度上很突出，导致物种光谱特征的瞬态变化和双线性的崩溃。这并不意味着全局分析不能重现数据集，事实上，只要使用足够数量的组件，它总能产生令人满意的拟合。问题在于解释组分光谱并将时间常数分配给特定的激发态过程，因为组分可能不再对应于不同的吸收物质。因此，在将全局分析应用于无法假设双线性的情况时，必须始终小心。

将光谱解释分配给模型/拟合：获得拟合后，必须将光谱解释映射到拟合中获得的生存期。拟合的寿命被分配给在光谱的初始解释中确定的过程和反应。然而，光谱的初步评估和模型获得的拟合寿命数可能不会立即相互映射。在这种（常见）情况下，装配工需要回过头来评估最初的解释。也许在最初的评估中遗漏了振动冷却或其他过程，但在建模和拟合过程中被发现。或者，也许两组不同的拟合参数可以很好地再现数据，并且初始解释可以指导选择哪一组拟合参数。在最后一步中，钳工必须在解释和钳合之间来回走动，以找到一个描述，从而对系统的物种和动力学进行合理的光物理分配。还可以探索包含顺序拟合模型的其他拟合程序，例如目标分析，以补充全局分析和本文⁴ 中介绍的拟合软件产生的拟合。

总之，该协议讨论了瞬态吸收数据的制备和拟合。其目的是强调与该进程相关的挑战，并就如何以实际方式避免或减轻这些挑战发表意见。拟合 TA 数据，就像拟合技术领域遇到的大多数数据一样，可能很棘手，有时甚至是主观的。因此，了解数据的过程和局限性、数据准备以及用于对数据进行建模和赋予意义的数学工具至关重要。科学家必须以批判的眼光处理数据和建模。

人们可以尝试减轻他们适合的主观性。例如，可以从不同的起点和不同日期准备和拟合数据，以确保产生相同的拟合。可以比较不同日期使用不同样品制备采集的数据。多个研究人员可以拟合相同的数据并比较他们的结果。随着时间的流逝，研究人员可以对他们获得的数据建立直觉（基于他们的实验设置和实验参数的细节），这将使他们对自己的拟合更有信心。

关于 TA 数据拟合和本文讨论的模型的详细信息，有很多东西需要了解。热忱推荐几篇优秀的评论文章，深入研究这个话题 ^4,10,27。该协议旨在成为初学者进入分析和拟合过程的入口，激发对更深入地了解该过程的兴趣。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
EtOH 200% Proof	Decon Laboratories Inc	CAS 64-17-5	Solvent used to prepare Sample
Helios transient absorption spectrometer	Ultrafast systems	https://ultrafast.systems/products/spectrometers-accessories/helios/	Transient absorption spectrometer
POPOP  1,4-Bis[2-(5-phenyloxazolyl)]benzene	Tokyo Chemical Industry	CAS 1806-34-4	Sample used for Examples
Surface Xplorer	Ultrafast systems	https://ultrafast.systems/products/spectrometers-accessories/surface-xplorer/	Fitting program