Eine Einführung in die Verarbeitung, Anpassung und Interpretation transienter Absorptionsdaten

Zusammenfassung

Dieses Protokoll ist ein Einstieg für Anfänger in die Verarbeitung, Anpassung und Interpretation transienter Absorptionsspektren. Der Schwerpunkt dieses Protokolls liegt auf der Aufbereitung von Datensätzen und der Anpassung sowohl mit Einzelwellenlängenkinetik als auch mit globaler Lebensdaueranalyse. Herausforderungen im Zusammenhang mit transienten Absorptionsdaten und deren Anpassung werden diskutiert.

Zusammenfassung

Die transiente Absorptionsspektroskopie (TA) ist eine leistungsstarke zeitaufgelöste spektroskopische Methode, mit der die Entwicklung von Prozessen im angeregten Zustand durch Änderungen im Absorptionsspektrum des Systems verfolgt werden kann. Frühe Implementierungen der TA waren auf spezialisierte Labors beschränkt, aber die Entwicklung kommerzieller schlüsselfertiger Systeme hat die Technik zunehmend für Forschungsgruppen auf der ganzen Welt verfügbar gemacht. Moderne TA-Systeme sind in der Lage, große Datensätze mit hoher energetischer und zeitlicher Auflösung zu erzeugen, die reich an photophysikalischen Informationen sind. Die Verarbeitung, Anpassung und Interpretation von TA-Spektren kann jedoch aufgrund der großen Anzahl von angeregten Merkmalen und instrumentellen Artefakten eine Herausforderung darstellen. Bei der Erfassung, Verarbeitung und Anpassung von TA-Daten müssen viele Faktoren sorgfältig berücksichtigt werden, um die Unsicherheit darüber zu verringern, welches Modell oder welcher Satz von Anpassungsparametern die Daten am besten beschreibt. Das Ziel der Datenaufbereitung und -anpassung ist es, so viele dieser Fremdfaktoren zu reduzieren und gleichzeitig die Daten für die Analyse zu erhalten. Bei dieser Methode erhalten Anfänger ein Protokoll zur Verarbeitung und Aufbereitung von TA-Daten sowie eine kurze Einführung in ausgewählte Anpassungsverfahren und -modelle, insbesondere die Einzelwellenlängenanpassung und die globale Lebensdaueranalyse. Es werden eine Reihe häufig auftretender Herausforderungen bei der Datenaufbereitung und Methoden zu deren Bewältigung kommentiert, gefolgt von einer Diskussion der Herausforderungen und Grenzen dieser einfachen Anpassungsmethoden.

Einleitung

Die transiente Absorptionsspektroskopie (TA) ist eine zeitaufgelöste spektroskopische Technik, die die Entwicklung von photoangeregten Spezies durch zeitabhängige Änderungen ihres Absorptionsspektrums nach Anregung mit einem Lichtimpuls überwacht. Da es sich bei der TA um eine Absorptionstechnik handelt, können spektroskopische Signale, die aus Zuständen entstehen, die sowohl Strahlungsübergänge (d. h. Zustände, die typischerweise ein Photon emittieren) als auch nicht-strahlende Übergänge (Zustände, die typischerweise nicht fluoreszierend sind und eine interne Umwandlung, eine Kreuzung zwischen Systemen durchlaufen oder an Photoreaktionen teilnehmen) durchlaufen, identifiziert und ihre Entwicklung verfolgt werden ^1,2. Abhängig von den Besonderheiten der Anregungsquelle und der Detektionsmethode ermöglicht TA den Zugang zu Kinetiken von Femtosekunden bis über Mikrosekunden und vom UV bis zum fernen IR, was es zu einem vielseitigen spektroskopischen Werkzeug macht. Die Kommerzialisierung von TA-Spektrometern hat in den letzten Jahrzehnten erhebliche Fortschritte gemacht, was dazu geführt hat, dass mehr Labore und Einrichtungen Zugang zu dieser leistungsstarken Technik haben².

Moderne TA-Systeme sind in der Lage, große Datensätze mit hoher energetischer und zeitlicher Auflösung zu produzieren. Die Datensätze haben im Allgemeinen die Form einer 2D-Matrix von Transmissions- oder Absorptionsdifferenzwerten als Funktion der Wellenlänge und der Zeitverzögerung relativ zum Anregungspuls. Dieser Datensatz kann als zweidimensionale Heatmap oder als dreidimensionale topografische Karte angezeigt werden. Die Interpretation dieser Daten ist komplexer geworden, da Forscher bestrebt sind, den gesamten Datensatz einzubeziehen, wenn sie Anpassungen erstellen, die ihr interessierendes System am besten beschreiben³.

Obwohl TA einen breiten Bereich von Wellenlängen und Zeitskalen abdecken kann, konzentriert sich dieses Protokoll auf eine seiner am weitesten verbreiteten Formen⁴: die Breitbandspektroskopie im UV-sichtbaren Bereich, die von einem gepulsten Femtosekundenlaser angetrieben wird. Ein Schema ^5,6 eines solchen Instruments ist in Abbildung 1 dargestellt. Das Experiment beginnt damit, dass ein Impuls vom Laser entnommen und in zwei Kopien aufgeteilt wird. Eine Kopie des Impulses, die sogenannte "Pumpe", wird verwendet, um die Probe anzuregen. Ein Gerät wie ein optisch-parametrischer Verstärker (OPA) wird typischerweise verwendet, um den Pumpimpuls auf die gewünschte Anregungswellenlänge ^5,7 umzuwandeln. Die zweite Kopie des Impulses, die als "Sonde" bezeichnet wird, tritt in eine mechanische Verzögerungsstufe ein, die die Zeitverzögerung zwischen den Impulsen der Pumpe und der Sonde variieren kann, indem sie die Strecke variiert, die der Impuls zurücklegt. Der Sondenpuls mit einer Wellenlänge wird dann unter Verwendung eines Saphir- oder Calciumfluoridkristalls (CaF₂) in ein Weißlichtkontinuum umgewandelt⁸. Der Weißlichtimpuls wird durch die Probe geleitet und sein Spektrum wird mit einem Breitbanddetektor wie einer CCD-Kamera (Charge-Coupled Device) gemessen. Durch die Messung von Änderungen im Spektrum des Weißlichtpulses mit und ohne Pumpe können Änderungen im Absorptionsspektrum der Probe, die durch die Pumpe, ΔA(T), induziert werden, gemessen werden. Interessierte Leser werden auf diese nützliche Rezension⁹ verwiesen, um weitere Informationen über den Erkennungsprozess zu erhalten.

Bei allen Formen der TA-Spektroskopie werden die ΔA(t)-Spektren berechnet, indem die Differenz zwischen der Grundzustandsabsorption, einer_Sonde, und der des angeregten Zustands, einer_Pumpe+Sonde, mit einer gegebenen Zeitverzögerung, t, zwischen den beiden Impulsen 2,5,9,10 genommen wird.

(1)

Beachten Sie, dass eine_Sonde dem stationären Absorptionsspektrum der Probe entspricht und zeitunabhängig ist. Die Zeitauflösung des Experiments ergibt sich aus der Verzögerung zwischen Pumpe und Sonde, die in A_pump+probe(t) erfasst ist. Eine Simulation dieser Daten ist in Abbildung 2A dargestellt.

Im Gegensatz zu stationären Absorptionsspektren können TA-Spektren aufgrund der Differenz in Gleichung 1 sowohl positive als auch negative Merkmale aufweisen. Positive Merkmale sind das Ergebnis neuer absorbierender Spezies, die durch den Pumppuls erzeugt werden, und können angeregte Chromophorzustände, Triplett-Zustände, geometrische Umlagerungen, Solvatationseffekte oder Photoprodukte im angeregten Zustand^{darstellen 3}. Allgemeine Richtlinien für die Identifizierung dieser Merkmale und ihre Zuordnung zu chemischen Spezies werden in der Diskussion vorgestellt. Negative Merkmale können entweder durch das Grundbleichmittel (GSB) oder die stimulierte Emission (SE) entstehen (Abbildung 2B). Der GSB ist auf den Verlust der Grundbevölkerung nach der Absorption des Pumpimpulses zurückzuführen. Moleküle, die in den angeregten Zustand befördert werden, absorbieren nicht mehr in derselben Region wie ihr Grundzustand; daher wird weniger vom Sondenpuls absorbiert, und die Differenz in Gleichung 1 kann in diesem Bereich negativ sein. Die GSB zeichnet sich dadurch aus, dass sie die gleiche spektrale Form wie die Grundzustandsabsorption hat, jedoch mit einem entgegengesetzten Vorzeichen. SE-Signale resultieren aus der Emission einer angeregten Spezies, die durch den Sondenpuls³ stimuliert wird. Die Emission dieser Spezies führt dazu, dass mehr Licht den Detektor erreicht, was einer geringeren Absorption bei diesen Wellenlängen entspricht. Das SE-Signal hat eine ähnliche spektrale Form wie das spontane Emissionsspektrum der Spezies, jedoch mit einem negativen Vorzeichen und einer anderen Frequenzbewertung¹⁰.

Zusätzlich zu Informationen über Spezies im angeregten Zustand können TA-Spektren eine Reihe von Artefakten und Fremdmerkmalen enthalten, die die zugrunde liegende Dynamik verzerren und die Zuordnung von Absorptionsbanden^{verschleiern können 11}. Eine unsachgemäße Behandlung dieser Artefakte bei der Datenaufbereitung und -analyse kann zur Anwendung ungeeigneter photophysikalischer Modelle auf die Daten und folglich zu irreführenden Schlussfolgerungen führen¹¹. Daher konzentriert sich der erste Teil dieses Protokolls darauf, wie TA-Datensätze nach der Erfassung ordnungsgemäß verarbeitet werden. Das Ziel dieses Abschnitts ist es, Forschern, die neu in der TA sind, eine Reihe von Richtlinien an die Hand zu geben, die dazu beitragen, eine Intuition und Wertschätzung für die rigorose Aufbereitung und Verarbeitung ihrer Daten zu entwickeln.

Nach der Verarbeitung eines Datensatzes steht eine Vielzahl von Werkzeugen und Modellen zur Verfügung, um die Spektren mit unterschiedlichen Komplexitäts- und Genauigkeitsgraden anzupassen und zu interpretieren¹⁰. Das Ziel des zweiten Abschnitts dieses Protokolls ist es, den Leser darauf vorzubereiten, die Einzelwellenlängenanpassung und die globale Analyse auf Daten anzuwenden und eine Anleitung zu geben, wann diese Modelle zur Beschreibung ihrer Daten geeignet sind. Kommerzielle Software zur Vorbereitung und Verarbeitung von TA-Daten ist jetzt leicht verfügbar, wie z. B. Surface Xplorer ^12,13 von Ultrafast-Systemen (kostenlos herunterladen und verwenden, siehe Materialtabelle). Andere kostenlose Alternativen wurden von akademischen Forschern veröffentlicht, wie z. B. Glotaran¹⁴. Glotaran ist ein freies Softwareprogramm, das für die globale und zielgerichtete Analyse von zeitaufgelösten Spektroskopie- und Mikroskopiedaten entwickelt wurde. Es dient als grafische Benutzeroberfläche (GUI) für das R-Paket TIMP¹⁴. Darüber hinaus können Benutzer Programmiersprachen wie Python verwenden, um ihre eigenen Codes zu schreiben, die die Analyse durchführen. Jede dieser passenden Software- und Programmierlösungen hat positive Eigenschaften, die sie zu wichtigen Beiträgen machen. Für die Zwecke dieser Studie können wir nur eine Software für die visuelle Komponente dieser Aktivität vorstellen. Eine ausführliche Diskussion der einzelnen Anpassungssoftware würde den Rahmen dieses Artikels sprengen.

Dieser Artikel bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für (1) die Verarbeitung von TA-Daten, (2) die Anpassung von TA-Daten mit Einzelwellenlängen-Kinetik und globaler Analyse und (3) das Extrahieren von Daten und deren Anpassung an andere Modelle. Ein Satz repräsentativer TA-Daten ist enthalten, die der Leser als Praxis verwenden kann (Ergänzungsdatei 1 und Ergänzungsdatei 2). Die Daten sind eine Messung einer 165-μM-Probe von 1,4-Bis(5-phenyloxazol-2-yl)benzol (POPOP) in Ethanol, das bei 330 nm angeregt und über einen Bereich von -5 ps bis 5,5 ns gesammelt wurde. Zusätzlich wurde eine "leere" Probe, die nur Ethanol enthielt, und keine Probe unter den gleichen experimentellen Bedingungen über einen Bereich von -5 ps bis 5 ps entnommen, die zur Vorbereitung der Daten für die Anpassung verwendet wird (Schritt 1). Die Spektren wurden mit einem ultraschnellen transienten Absorptionsspektrometer aufgenommen. Die Probe wurde in einer 2-mm-Schichtdickenküvette enthalten und ständigem Rühren unterzogen. Das beschriebene Verarbeitungs- und Anpassungsverfahren basiert auf der Surface Xplorer-Software, die Daten im *.ufs-Format anpasst und hier als "Anpassungsprogramm" bezeichnet wird. Programme zum Konvertieren von Datensätzen in anderen Formaten in *.ufs-Dateien sind verfügbar¹⁵. Obwohl die Details dieses Protokolls spezifisch für Surface Xplorer sind, können die folgenden Schritte auf jedes Softwarepaket verallgemeinert werden, egal ob kommerziell oder selbstgebaut. Darüber hinaus können die Ergebnisse der Datenverarbeitung mit diesen anderen Softwarepaketen extrahiert und angepasst werden. Eine unterstützende Informationsdatei (Zusatzdatei 3) enthält zusätzliche Hinweise zur Montage.

Protokoll

1. Daten für die Anpassung vorbereiten

1. Laden Sie den SAMPLE-Datensatz in die Fitting-Software. Die Daten werden wie in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt angezeigt.
2. Wenn gestreutes Anregungslicht innerhalb des optischen Nachweisfensters des Experiments vorhanden ist, verwenden Sie die Option Streulicht subtrahieren (Ergänzende Abbildung 2). Wenn in den Daten kein gestreutes Anregungslicht vorhanden ist, fahren Sie mit Schritt 1.5 fort.
   HINWEIS: Streulicht wird am häufigsten beobachtet, wenn die Anregungswellenlänge innerhalb des optischen Fensters liegt. Streulicht erscheint als scharfes negatives (Bleich-) Merkmal bei der Anregungswellenlänge (oder einer Beugungsordnung oder Wellenlänge, die in der OPA erzeugt wird), die sich nicht mit der Zeit ändert.
3. Klicken Sie auf das Menü Oberfläche und dann auf die Option Streulicht subtrahieren (Ergänzende Abbildung 2). Ein neues Fenster wird angezeigt.
4. Klicken Sie im neuen Fenster auf die Pfeilschaltflächen , um die Anzahl der Hintergrundspektren auf den Durchschnitt einzustellen (Ergänzende Abbildung 3), um eine Hintergrundkorrektur durchzuführen. Die Verwendung von zehn Spektren bietet einen guten Ausgangspunkt und die Anzahl kann nach Belieben angepasst werden. Klicken Sie auf Akzeptieren , um die Subtraktion durchzuführen (fahren Sie mit Schritt 1.7 fort).
   HINWEIS: Hintergrundspektren werden aus den ersten im Datensatz vorhandenen Spektren gezogen und bewegen sich dann zeitlich vorwärts, wobei so viele Hintergrundspektren wie erforderlich verwendet werden, um eine Mittelwertbildung des Hintergrundsignals zu ermöglichen. Wenn Sie jedoch zu viele verwenden, werden Spektren verwendet, die das interessierende Signal enthalten, also verwenden Sie nicht zu viele. Bei Daten aus langen Zeitfenstern wird die Streuungsfunktion möglicherweise nicht am Ende des Zeitfensters der Daten angezeigt. Dies kann auftreten, wenn das Zeitfenster die Kameraintegrationszeit überschreitet, oder aus anderen Gründen, je nachdem, wie das TA-Experiment aufgebaut ist. Um dies zu korrigieren, kann die Option zum Festlegen des Zeitbereichs verwendet werden, wie in der Zusatzdatei 3 beschrieben.
5. Klicken Sie für Daten, bei denen kein Streulicht im optischen Fenster vorhanden ist, auf das Menü Oberfläche und dann auf die Option Hintergrund subtrahieren .
6. Klicken Sie im angezeigten Fenster auf die Pfeilschaltflächen unten rechts für "Anzahl der Spektren" zum Durchschnitt (wählen Sie 10) und klicken Sie auf Akzeptieren.
   HINWEIS: Hintergrundspektren in dieser Option funktionieren genauso wie in der Option "Streulicht subtrahieren". Wenn Sie mit zehn Spektren beginnen, erhalten Sie eine gute Mittelwertbildung. Es können mehr Spektren verwendet werden, aber es muss darauf geachtet werden, nicht zu viele zu verwenden, um zu vermeiden, dass Spektren mit Signalen von Interesse enthalten sind. Das Benutzerhandbuch für Surface Xplorer beschreibt die Unterschiede in der Korrektur für "Streulicht subtrahieren" vs. die grundlegendere Korrektur "Hintergrund subtrahieren". Es ist wichtig, die entsprechende Korrektur für das Artefakt¹⁶ anzuwenden.
7. Daten in der Nähe der Ränder des optischen Fensters können ein sehr geringes Signal-Rausch-Verhältnis aufweisen, das sich aus der Form des Sondenspektrums und/oder der Absorption eines zu großen Teils des weißen Lichts durch die Probe ergibt. Verrauschte Daten in diesen Regionen erschweren die Analyse. Entfernen Sie diese nicht hilfreichen Teile des Spektrums. Klicken Sie auf die Endwellenlängen im Spektrum (untere linke Kachel), geben Sie neue Werte ein (Ergänzende Abbildung 4) und klicken Sie auf Enter. Wählen Sie einen Wellenlängenbereich aus, der die verrauschten Daten an den Rändern des Fensters entfernt. Für die bereitgestellten Daten beträgt der Bereich 340-680 nm.
8. Schließen Sie die Einstellung des Spektralfensters auf den gewünschten Wellenlängenbereich ab. Klicken Sie auf das Menü Oberfläche und dann auf Zuschneiden (Ergänzende Abbildung 5). Ein Popup-Fenster wird angezeigt.
   1. Klicken Sie auf OK. Klicken Sie auf das Menü Datei und dann auf Datei speichern unter. Klicken Sie dann auf OK. Schließen Sie dieses Dataset.
      HINWEIS: Seien Sie vorsichtig beim Zuschneiden, da die Funktion Daten sowohl entlang der Wellenlängen- als auch der Zeitverzögerungsachse beschneidet und alle anderen Daten löscht. Stellen Sie sicher, dass das Zeitverzögerungsfenster den Teil der Daten enthält, der beibehalten werden soll. Außerdem wird dringend empfohlen, alle zugeschnittenen Daten als neue, entsprechend gekennzeichnete Datei zu speichern, um die Rohdatenoberfläche als Backup intakt zu lassen.
9. Für Daten, die auf den Zeitskalen fs oder ps gesammelt wurden, muss eine Chirp-Korrektur angewendet werden. Öffnen Sie die Datenoberfläche nur mit dem Lösungsmittel oder Substrat (keine Probe), das im selben Versuchsaufbau wie die Daten entnommen wurde. Dieses Beispiel wird als "leerer" Experimentlauf bezeichnet. Führen Sie die gleichen Schritte für die "leeren" Daten (von Schritt 1.2 bis Schritt 1.8) aus, die für die Beispieldaten ausgeführt wurden.
   HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, ein solches "leeres" Experiment unter den gleichen Bedingungen wie die Stichprobe durchzuführen, jedoch mit einem kürzeren Zeitfenster (z. B. ~ −5 ps bis 5 ps), um eine hohe Anzahl von Punkten um den Zeitpunkt Null herum zu gewährleisten. Dieser "Blindlauf" sollte je nach Probentyp nur aus Lösungsmittel oder Substrat bestehen und wird verwendet, um die Chirp-Krümmung zu bestimmen. Die Vorbereitung des "Rohlings" bis zu diesem Punkt sollte der gleichen Hintergrundkorrektur und dem gleichen Zuschneiden folgen wie die Beispieldaten. Wenn kein "Leerzeichen" ausgeführt wurde, kann die Chirp-Korrektur direkt am Datensatz durchgeführt werden.
10. Starten Sie den Chirp-Korrekturprozess. Klicken Sie in der Heatmap-Kachel (oben links) auf das Fadenkreuz und ziehen Sie die vertikale Linienkomponente an das blaue Ende des Spektrums. Beginnen Sie mit dem blauen Wellenlängenbereich in der Nähe des Beginns des Spektralfensters. Klicken Sie auf das Menü Kinetik und dann auf Lösungsmittelantwort anpassen.
    HINWEIS: Die Anpassung des Lösungsmittels sollte nur an einer "leeren" Probe durchgeführt werden, die kein Signal nach dem Zeitpunkt Null erzeugt. Der Versuch, diese Anpassungsfunktion auf einen Datensatz anzuwenden, der Daten zu einem Molekül oder Material von Interesse enthält, führt dazu, dass das Programm versucht, die Daten anstelle der IRF (Instrument Response Function) anzupassen. Bei "leeren" Samples sollte das einzige vorhandene Signal ein kohärentes Artefakt sein, das durch Kreuzphasenmodulation entsteht. Die Kreuzphasenmodulation tritt nur dort auf, wo sich die Pump- und Sondenstrahlen überlappen und liefert daher eine Spur der Chirp-Krümmung, die mit der Option "Fit Solvent Response" angepasst werden kann. Das manuelle Platzieren von Punkten ist für Daten ohne begleitendes "Leerzeichen" zur Korrektur erforderlich und wird in der Zusatzdatei 3 ausführlicher beschrieben.
11. Ein neues Fenster "Lösungsmittelantwort anpassen" wird geöffnet. Klicken Sie auf die Schaltfläche Anpassen (Ergänzende Abbildung 6). Die Anpassung erzeugt eine Anpassung an die Instrumentenantwortfunktion unter Verwendung der ersten und zweiten Ableitung einer Gaußschen Ableitung. Klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern und dann auf x , um den Bildschirm zu schließen.
    HINWEIS: Die rote Anpassungslinie sollte über den gesamten Zeitraum gut mit den Datenpunkten (blaue hohle Quadrate) übereinstimmen, vor allem mit dem großen Merkmal, das nahe dem Zeitpunkt Null (0,1-2,0 ps) zu sehen ist. Die Anpassung hat den größten Erfolg, wenn es eine hohe Anzahl von Punkten um den Zeitpunkt Null gibt, was durch die Verwendung eines kurzen Zeitverzögerungsfensters für das "leere" Experiment und die Beibehaltung einer großen Anzahl von Punkten erreicht werden kann. Wenn die Anpassung nicht gut mit den Datenpunkten übereinstimmt, aktivieren Sie das Kontrollkästchen "Gauß (R0) hinzufügen", und wiederholen Sie die Anpassung. Diese Option addiert eine Summe der Gaußschen Ableitungen zur ersten und zweiten Ableitung und passt möglicherweise besser zur IRF-Merkmalsform bei dieser Wellenlänge. Wenn die Lösungsmittelanpassung das IRF-Signal immer noch nicht erfasst, wählen Sie eine andere Wellenlänge.
12. Führen Sie diesen Vorgang (Schritte 1.10-1.11) mindestens fünfmal durch, da fünf Punkte erforderlich sind, um einen Chirp richtig zu korrigieren. Die Punkte sollten nach Möglichkeit über das gesamte Spektralfenster verteilt sein. Einige Lösungsmittel/Substrate erzeugen je nach experimentellen Bedingungen möglicherweise kein beobachtbares Signal in Teilen des Spektralfensters. Weitere Punkte können nach Bedarf hinzugefügt/verwendet werden, um eine akzeptable Anpassung zu erzielen. Wenn Sie fertig sind, schließen Sie den "leeren" Datensatz.
    HINWEIS: Jeder gespeicherte Punkt wird als neue Zeile in eine Excel-Datei im Arbeitsordner geschrieben, sobald der Benutzer auf Speichern klickt. Wenn ein unerwünschter Punkt gespeichert wird, kann der Punkt aus der Excel-Datei entfernt werden, indem die Zeile des unerwünschten Punktes gelöscht wird.
13. Öffnen Sie das zugeschnittene und subtrahierte Hintergrunddataset erneut. Klicken Sie auf das Menü Oberfläche und dann auf die Option Chirp-Korrektur . Dadurch wird ein neuer Bildschirm mit drei Fenstern und einem Menü unten rechts angezeigt (Ergänzende Abbildung 7).
14. Fügen Sie die soeben erstellte Chirp-Korrektur hinzu. Klicken Sie auf die Option Aus Datei hinzufügen , wählen Sie die Excel-Datei aus, die auf "Anpassungskoeffizienten" endet, und klicken Sie auf OK. Die Chirp-Korrekturanpassung wird jetzt im oberen linken Fenster als schwarze Linie mit X-Markierungen angezeigt (Ergänzende Abbildung 8).
    HINWEIS: Die Chirp-Korrektur wird als durchgezogene Linie angezeigt; die X-Marker entlang der Linie sind die Punkte, die aus dem Anpassungslösungsmittelreaktionsprozess generiert werden. Punkte können manuell hinzugefügt werden, indem Sie das Fadenkreuz anpassen und auf Hinzufügen klicken. Punkte können auch entfernt werden, indem Sie sie markieren und auf Entfernen klicken. Weitere Punkte können von Hand bearbeitet werden, indem Sie Werte in die Liste unten rechts eingeben. Schließlich kann die aktuelle Korrektur auf Wunsch auch als Datei zur späteren Wiederverwendung über die Schaltfläche In Datei speichern gespeichert werden.
15. Klicken Sie auf die Schaltfläche Vorschau der Chirp-Korrektur . Dadurch wird vorübergehend die Chirp-Korrektur angewendet. Beachten Sie die Korrektur im oberen linken Fenster, um sicherzustellen, dass die Daten zeitlich abgeflacht wurden und keine Krümmung mehr zu beobachten ist.
    1. Wenn Sie mit der Chirp-Korrektur zufrieden sind, klicken Sie auf die Schaltfläche Übernehmen & Beenden . Wenn Sie nicht zufrieden sind, wiederholen Sie die Schritte 1.10-1.14 und wählen Sie mehr (oder andere) Wellenlängen für die Chirp-Korrekturanpassung, bis eine zufriedenstellende Korrektur erhalten ist.
       HINWEIS: Durch Anwenden der Chirp-Korrektur wird die Zeit Null an die begradigte Linie angepasst, wie sie in der Vorschau angezeigt wird. Möglicherweise liegt eine zeitliche Fehlausrichtung zwischen dem "Leerzeichen" und der Datenoberfläche vor.
16. Klicken Sie auf das Menü Datei und dann auf Datei speichern unter. Geben Sie einen geeigneten Namen für die Datei ein, um anzuzeigen, dass eine Chirp-Korrektur angewendet wurde. Klicken Sie dann auf OK.
17. Einige Streuungs-Features in den Daten werden bei der Hintergrundsubtraktion möglicherweise nicht vollständig entfernt. Diese Merkmale wirken sich auf die Anpassung aus und führen zu fehlerhaften Anpassungsergebnissen. Suchen Sie solche Features in den Daten, die entfernt werden sollen. Das Streumerkmal kann am einfachsten im negativen Zeitbereich identifiziert werden.
    1. Klicken Sie in der oberen linken Heatmap-Kachel auf das Fadenkreuz und ziehen Sie es in den negativen Zeitbereich. Bleiben Sie innerhalb des negativen Zeitbereichs, und verwenden Sie das Fadenkreuz, um die Wellenlängen zu bestimmen, bei denen das Streuelement beginnt und endet. Beachten Sie den Wellenlängenbereich des Streumerkmals (für den bereitgestellten Datensatz beträgt der Merkmalsbereich 654 nm bis 672 nm).
       HINWEIS: Wenn Sie bestimmen, ob ein Feature entfernt werden soll, ziehen Sie das horizontale Fadenkreuz durch die Zeitachsen nach oben und unten, um den Spektralbereich des Features zu visualisieren. Streuende Merkmale haben typischerweise sehr verrauschte kinetische Kurven mit einer Wellenlänge, so dass der Spektralbereich des Merkmals auch mit Hilfe der kinetischen Spuren verifiziert werden kann.
18. Beginnen Sie mit der unteren (blauen) Wellenlänge (d. h. 654 nm), klicken Sie auf die Wellenlänge am rechten Ende des Spektrums (untere linke Kachel), und geben Sie den Wert der unteren (blauen) Feature-Ausdehnung ein.
19. Schneiden Sie die Daten zu, indem Sie auf das Menü Oberfläche und dann auf Zuschneiden klicken. Klicken Sie im Popup-Menü auf OK . Speichern Sie die zugeschnittenen Daten mit einem eindeutigen Dateinamen, um anzugeben, um welche Seite der Daten es sich handelt (blau oder links wird empfohlen). Schließen Sie die Datei.
20. Öffnen Sie die Datei mit der angewendeten Chirp-Korrektur, die in Schritt 1.16 gespeichert wurde. Fahren Sie mit der höheren (roten) Wellenlängenausdehnung des Features fort. Klicken Sie auf die Wellenlänge am linken Ende des Spektrums (untere linke Kachel), und geben Sie den Wert der höheren Ausdehnung des Features ein.
21. Schneiden Sie die Daten zu, indem Sie auf das Menü Oberfläche und dann auf Zuschneiden klicken. Klicken Sie im Popup-Menü auf OK . Speichern Sie die zugeschnittenen Daten mit einem eindeutigen Dateinamen, um anzugeben, um welche Seite der Daten es sich handelt (Rot oder Rechts wird empfohlen).
22. Kombinieren Sie die beiden Dateien, indem Sie auf das Menü Datei und dann auf Mehrere Flächen kombinieren klicken. Wählen Sie im neuen Fenster beide Seiten der Daten aus (d. h. Rechts und Links oder Blau und Rot). Verwenden Sie Strg + Klick , um jede Datei auszuwählen. Vergewissern Sie sich, dass beide Dateien im Feld "Dateiname:" ausgewählt sind, und klicken Sie dann unten rechts auf OK. Wenn der Fortschrittsbalken beendet ist, wurden die Daten kombiniert.
    HINWEIS: Auf diese Weise können beliebig viele Dateien kombiniert werden. Daten können über mehrere Schnitte sowohl in der Zeit- als auch in der Wellenlängenachse zusammengefügt werden.
23. Klicken Sie auf das Menü Datei , dann auf Datei speichern unter und wählen Sie einen eindeutigen Dateinamen, um anzugeben, dass es sich um eine Kombination handelt (kombiniert oder zusammengesetzt empfohlen). Klicken Sie dann auf OK , um die Datei zu speichern.
    HINWEIS: In Abschnitt 3 finden Sie Informationen zum Speichern von Daten aus dem Rohdatenfenster für die spätere Anzeige und Darstellung. Die Daten in der Heatmap (obere linke Kachel) sollten wie in Abbildung 3 angezeigt werden und können nun angepasst werden. Die Visualisierung der repräsentativen Spektren, wie in Abbildung 3 gezeigt, wird in Schritt 3.1.2 beschrieben.

2. Durchführen eines Anfits

1. Laden Sie die ordnungsgemäß vorbereitete Datenoberfläche.
2. Entscheiden Sie, welche Anpassung durchgeführt werden soll, und wechseln Sie zum entsprechenden Abschnitt.
   HINWEIS: Dieses Protokoll bietet zwei Optionen für die Datenanpassung: Schritt 2.3 stellt die kinetische Leiterbahnanpassung mit einer Wellenlänge und Schritt 2.4 die Anpassung der globalen Analyse dar.
3. Einzelne Wellenlängenanpassung
   1. Um eine einzelne kinetische Anpassung einzurichten, bewegen Sie den Cursor (entweder in der oberen oder unteren linken Kachel) auf die gewünschte Wellenlänge. Klicken Sie auf das Menü Kinetik und dann auf Kinetik anpassen. Beginnen Sie für das bereitgestellte Dataset mit 632 nm.
   2. Beachten Sie im neuen Fenster, das sich öffnet (Ergänzende Abbildung 9), dass die wichtigsten Anpassungsparameter und Ausgangswerte oben links im Fenster unter dem Programmlogo im Feld neben diesem Bereich unter dem Text "current fit @ wavelength" eingestellt sind.
   3. Klicken Sie auf die Pfeilschaltflächen , um die Anzahl der Lebensdauern (d. h. die Anzahl der exponentiellen Zerfälle, die zur Anpassung der Daten verwendet werden) im Feld "Endliche Lebensdauer" anzupassen. Wählen Sie für das bereitgestellte Dataset 2 Lebensdauern aus. Ein bis 3 Lebenszeiten sind als Ausgangspunkt typisch.
   4. Wenn das Datensignal über das gesammelte Zeitfenster hinausgeht, sollte eine "unendliche" Lebensdauerkomponente enthalten sein. Klicken Sie dazu auf das Kontrollkästchen Unendliche Lebensdauer verwenden . Wenn die Daten vollständig auf die Baseline zerfallen, aktivieren Sie dieses Kontrollkästchen nicht. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen für das bereitgestellte Dataset nicht.
      HINWEIS: Die "unendliche Lebensdauer" ermöglicht es, einen Signaloffset beizubehalten (d. h. das Programm erzwingt nicht, dass die Anpassung auf die Basislinie zurückfällt). Die Verwendung einer unendlichen Komponente ist erforderlich, wenn das Signal bei dieser Wellenlänge innerhalb des Zeitbereichs des Experiments nicht auf die Basislinie zerfällt.
   5. Geben Sie Schätzwerte für die Lebensdauer und die zugehörigen Amplituden, die Ansprechzeit des Geräts und die Zeit Null ein, um den Anpassungsprozess zu unterstützen (Ergänzende Abbildung 10). Klicken Sie auf den gewünschten Parameter. Klicken Sie in das Wertefenster, geben Sie einen Schätzwert ein, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche für die anfängliche Schätzwertangabe , um den Wert festzulegen. Für das bereitgestellte Dataset sind die entsprechenden Schätzwerte: 0 = 0 ps, IRF = 0,25 ps, A1 = 0,6, t1 = 100 ps, A2 = 0,08, t2 = 1100 ps.
      HINWEIS: "0" ist die Schätzung der Zeit Null, "IRF" ist die Reaktionszeit des Instruments, "A" bezieht sich auf die Amplitude einer bestimmten Exponentialzeit (siehe Gleichung 3) und "t" ist die Lebensdauer-/Zeitkonstante. Die Bereitstellung guter Schätzwerte hilft dem Programm, eine angemessene Anpassung zu erzielen. Wählen Sie "A"-Werte aus, die innerhalb der Werte des A-Bereichs im Datensatz liegen. Wählen Sie "t"-Werte für Zeitbereiche aus, in denen eine signifikante Änderung in der kinetischen Spur beobachtet wird. Der beste Weg, um eine Intuition darüber zu erlangen, wie sich Schätzwerte auf die Anpassung auswirken, besteht darin, mehrere Sätze von Schätzwerten auszuprobieren und die von ihnen erzeugten Anpassungen zu beobachten. Wenn einer oder mehrere dieser Parameter bekannt sind, kann dieser Parameter so eingestellt und "fixiert" werden, dass er sich nicht mit der Anpassung ändert (Ergänzende Abbildung 11).
   6. Wenn alle Schätzparameter eingegeben wurden, klicken Sie auf die Schaltfläche Anpassen . Eine repräsentative Anpassung ist in Abbildung 4 dargestellt.
      HINWEIS: Durch das Anwenden der Anpassung wird das Datendiagramm mit der Anpassungslinie und einem Restdiagramm gefüllt, das zur Bewertung der Qualität der Anpassung verwendet werden kann. Anpassungsparameter wie die Lebensdauer und die zugehörigen Amplituden, die Zeit Null und die Reaktionszeit des Geräts werden ebenfalls in das Feld oben links eingetragen. Verwenden Sie mehrere verschiedene Anpassungsparameter, um die Anzahl der Lebensdauern und den Ein-/Ausschluss einer "unendlichen" Zeitkomponente zu bestimmen, die die beste Anpassung an die Daten ergibt.
   7. Speichern Sie die Passung, indem Sie auf die Schaltfläche Speichern klicken (Ergänzende Abbildung 9).
      HINWEIS: In Abschnitt 3 finden Sie Informationen zum Speichern von Daten aus dem Rohdatenfenster für die spätere Anzeige und Darstellung.
4. Globale Analyseanpassung
   1. Klicken Sie auf das Menü Oberfläche und dann auf die Option Hauptkomponenten über SVD . Es erscheint ein neues Fenster (Ergänzende Abbildung 12).
      HINWEIS: Im oberen rechten Fenster werden die kinetischen Hauptspuren angezeigt, und unten links werden die Hauptspektren angezeigt. Die obere linke Kachel zeigt ein Diagramm der Restfläche, die durch die Differenz zwischen der ursprünglichen Fläche und einer von den ausgewählten Hauptkomponenten erzeugten Fläche erstellt wurde.
   2. Klicken Sie auf die Pfeilschaltflächen , um die "Anzahl der Hauptkomponenten" einzustellen (Ergänzende Abbildung 12). Wählen Sie für das bereitgestellte Dataset 15 aus.
      HINWEIS: Wenn Sie sich für die Anzahl der zu wählenden Hauptkomponenten entscheiden, besteht eine Möglichkeit darin, die Anzahl weiter zu erhöhen, bis sowohl die Hauptspektren als auch die kinetischen Hauptspuren einem Rauschmuster ähneln. Eine andere Möglichkeit, um zu bestimmen, wie viele Hauptkomponenten ausgewählt werden sollen, besteht darin, sich die Gewichtungskoeffizientenwerte anzusehen, die links neben der Legende in der Kachel oben rechts angezeigt werden. Fügen Sie weitere Hauptkomponenten hinzu, bis dieser Wert 0,01 erreicht. Im Allgemeinen ist es ratsam, noch ein paar weitere hinzuzufügen. Dies kann dazu führen, dass bis zu 15 oder mehr Hauptkomponenten ausgewählt werden.
   3. Klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern . Gespeicherte Hauptkomponenten sind erforderlich, um mit dem nächsten Schritt fortzufahren.
      HINWEIS: Jede Hauptkomponente ist eine Darstellung der ursprünglichen Datenoberfläche mit reduzierter Komplexität. Die Verwendung von Hauptkomponenten führt zu einer vereinfachten Oberfläche im Vergleich zu den zu analysierenden Rohdaten. Die Berücksichtigung der meisten Hauptmerkmale der Datenoberfläche ist sehr wichtig, um eine genaue Anpassung zu erhalten, daher ist es wichtig, genügend Hauptkomponenten zu verwenden, um diese Merkmale zu erfassen. Die Verwendung von mehr Hauptkomponenten beeinträchtigt die Passform nicht. Wenn Sie Zweifel daran haben, wie viele Hauptkomponenten ausgewählt werden sollen, verwenden Sie daher mehr Hauptkomponenten anstelle von weniger. Denken Sie daran, dass die Verwendung von zu vielen die Anpassungssoftware verlangsamen kann.
   4. Nach dem Speichern der Hauptkomponenten kehrt das Programm zum Hauptbildschirm zurück und es kann nun versucht werden, die globale Anpassung zu versuchen. Klicken Sie auf das Menü Oberfläche und dann auf die Option Globale Anpassung . Es öffnet sich ein neues Fenster (Ergänzende Abbildung 13).
      HINWEIS: Die kinetischen Hauptspuren werden in der oberen rechten Kachel angezeigt. Die obere linke Kachel zeigt eine Oberfläche der angepassten Oberfläche im Vergleich zur Rohoberfläche an. Die untere linke Kachel zeigt die durch die Anpassung erzeugten zerfallsassoziierten Differenzspektren (DADS) an. Schließlich können in der unteren rechten Kachel die Anpassungsparameter festgelegt werden, einschließlich der Anzahl der zu verwendenden Exponentialfunktionen und der Frage, ob eine unendliche Funktion verwendet werden soll.
   5. Verwenden Sie die Pfeiltasten neben der "Anzahl der exp.", um die Anzahl der Exponentialfunktionen festzulegen, die in die Anpassung einbezogen werden sollen. Wenn das Datensignal über das gesammelte Zeitfenster hinausgeht, sollte eine "unendliche" Lebensdauerkomponente enthalten sein. Klicken Sie dazu auf das Kontrollkästchen Offset (Ainf) verwenden . Wählen Sie für das bereitgestellte Dataset 2 aus, und klicken Sie nicht auf das Kontrollkästchen. Wenn die Daten vollständig auf die Baseline zerfallen, aktivieren Sie dieses Kontrollkästchen nicht.
      HINWEIS: Anpassungsparameter können vor dem Ausführen einer Anpassung festgelegt werden, indem Sie auf die Beschriftungsspalte im Feld unten rechts unter globale Anpassungskoeffizienten klicken. Das Etikett wird rot und ändert sich, um eine (feste) Anzeige auf dem Etikett zu haben. Jeder Wert, der in das Feld rechts eingegeben wird, wird für diesen Parameter verwendet und nicht für die Anpassung frei variiert. Bei der Festlegung von Werten für eine Anpassung ist Vorsicht geboten, da dies die Anpassungsergebnisse verzerren kann.
   6. Klicken Sie auf die Schaltfläche Anpassen . Der Anpassungsfortschritt wird über einen kleinen Ladebalken in der Mitte des Bildschirms angezeigt. Nach Abschluss des Anpassungsfortschritts werden die Fenster mit Daten aus der Anpassung gefüllt (Abbildung 5 und ergänzende Abbildung 14). Untersuchen Sie die Anpassungsergebnisse visuell.
      HINWEIS: Informationen sowohl aus der kinetischen Hauptanpassung als auch aus DADS werden verwendet, um festzustellen, ob die Anpassung es wert ist, gespeichert zu werden, oder ob sie zu schlecht ist. Wenn die Anpassung der Hauptspuren gut mit den Daten übereinstimmt und das Diagramm keine oder nur sehr wenige Features enthält, kann die Anpassung im Allgemeinen akzeptiert werden. Es ist einfach, mehrere Passungen zu überprüfen, indem Sie die Anzahl der Lebensdauern ändern und/oder die Schaltfläche "Offset (Ainf) verwenden" aktivieren/deaktivieren. Die beste Passung, die nach der Überprüfung mehrerer Variationen der Anpassungsparameter erzielt wurde, sollte akzeptiert werden.
   7. Klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern . Dadurch wird die aktuell angezeigte Passform zusammen mit den Daten in einer Excel-Datei gespeichert.
      HINWEIS: Die Excel-Datei wird am selben Dateispeicherort wie das Dataset gespeichert. Wenn zusätzliche Anpassungen durchgeführt werden und gespeichert werden müssen, überschreiben sie alle vorherigen Versionen. Geben Sie daher vor dem Generieren und Speichern einer neuen Anpassung einer alten Anpassung einen eindeutigen Namen. Zu den Parametern, die aus der Anpassung gespeichert werden, gehören nur die Zeit Null, IRF, Lebensdauern und die zugehörigen DADS. Diese Datei enthält keine Informationen über den Plot oder die Anpassung an die kinetischen Hauptspuren. Das Speichern der Hauptkinetikspuren wird in Schritt 3.3 beschrieben. In Schritt 3.0 finden Sie Informationen zum Speichern von Daten aus dem Rohdatenfenster für die spätere Anzeige und Darstellung.

3. Extrahieren von Rohdaten und Passungen aus der Anpassungssoftware zum Plotten

HINWEIS: Rohdaten oder Anpassungen, die aus der Anpassung einzelner Wellenlängen oder der globalen Analyse erstellt wurden, können in CSV-Dateien exportiert werden, die in einer Reihe anderer Programme geöffnet werden können.

1. Extrahieren von Rohdaten zum Plotten
   1. Um die Heatmap des Datensatzes zu exportieren, klicken Sie auf das Menü Datei und dann auf In CSV exportieren (Ergänzende Abbildung 15). Es öffnet sich ein Fenster, klicken Sie auf OK , um die CSV-Datei im selben Verzeichnis wie die geöffnete Datendatei mit dem gleichen Namen wie die Datendatei zu speichern.
      HINWEIS: Alternativ können Rohdaten exportiert werden, indem Sie mit der rechten Maustaste auf das Heatmap-Fenster klicken und auf Daten in die Zwischenablage exportieren klicken. Dadurch werden die Daten vorübergehend gespeichert, sodass sie in ein Softwaredokument nach Wahl des Benutzers eingefügt werden können. Fügen Sie die Daten in eine Excel-Datei ein und speichern Sie die Daten.
   2. Im Fenster können mehrere Spektren zum Vergleich oder zum Erstellen einer Abbildung angezeigt werden. Ziehen Sie den horizontalen Cursor (in der Heatmap oben links) auf einen gewünschten Zeitpunkt. Drücken Sie Strg + S , um das Spektrum auszuwählen und im Spektralfenster (unten links) zu speichern. Fügen Sie so viele Zeitpunkte wie nötig hinzu, um den Verlauf der Daten (5-10 Spektren) anzuzeigen, wie in Abbildung 3 zu sehen.
      HINWEIS: Die Anzahl der Spektren, die zur Darstellung der Daten ausgewählt wurden, und die zeitliche Anordnung dieser Spektren können stark von der spezifischen Probe und den experimentellen Bedingungen abhängen. Die obige Empfehlung ist eine allgemeine Richtlinie, aber die Besonderheiten des Experiments sollten bestimmen, welche Teile des Datensatzes hervorgehoben werden.
   3. Exportieren Sie als Daten, indem Sie mit der rechten Maustaste auf das Fenster mit den Spektren klicken. Klicken Sie auf die Option Daten in die Zwischenablage exportieren . Die Daten werden vorübergehend gespeichert. Fügen Sie diese Daten in das gewünschte Softwaredokument (z. B. Excel) ein und speichern Sie.
   4. Mehrere kinetische Kurven können im Kinetikfenster auf die gleiche Weise wie im Spektrenfenster angezeigt werden. Ziehen Sie den vertikalen Cursor (in der Heatmap oben links) auf eine gewünschte Wellenlänge. Drücken Sie Strg + X , um die Zeitspur auszuwählen und im Kinetikfenster (oben rechts) zu speichern. Fügen Sie beliebig viele Zeitpunkte hinzu. Dadurch wird die aktuelle kinetische Verfolgung vorübergehend im Fenster gespeichert.
   5. Exportieren Sie als Daten, indem Sie mit der rechten Maustaste auf das Fenster mit den kinetischen Kurven klicken. Klicken Sie auf die Option Daten in die Zwischenablage exportieren . Die Daten werden vorübergehend gespeichert. Fügen Sie diese Daten in das gewünschte Softwaredokument (z. B. Excel) ein und speichern Sie.
2. Extrahieren von Daten aus einer einzelnen Wellenlängenanpassung für die Anzeige
   1. Klicken Sie auf das Menü Kinetik und dann auf Kinetik anpassen , um das Fenster mit den angepassten Daten zu öffnen.
   2. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Anpassungsfenster (d. h. die zentrale Kachel im Einzelanpassungsfenster). Klicken Sie auf Daten in die Zwischenablage exportieren. Dadurch wird es vorübergehend gespeichert, damit es in ein anderes Softwareprogramm eingefügt werden kann.
      HINWEIS: Das Residuendiagramm unter den Anpassungsdaten kann nicht exportiert werden und muss stattdessen aus den Anpassungsdaten neu erstellt werden. Die Anpassung exportiert sowohl die Rohdaten als auch die Anpassungslinie, die dann zum Neuerstellen des Rests verwendet werden kann. Das Residuum wird erstellt, indem der Anpassungswert zu jedem Zeitpunkt von den Daten subtrahiert und ein Diagramm erstellt wird, das dem im Fenster "Kinetik anpassen" gezeigten Diagramm ähnelt.
   3. Fügen Sie diese Daten in das gewünschte Softwaredokument (z. B. Excel) ein und speichern Sie.
      HINWEIS: Beim Exportieren in die Zwischenablage werden nur die Rohdaten und die Anpassungsliniendaten für jede Exponentiallinie enthalten, die in der Anpassung verwendet wird. Die Parameter der Anpassung, wie z. B. die Lebensdauer, Amplituden und dergleichen, werden nicht berücksichtigt und müssen durch Kopieren der Werte aus der Anpassungssoftware exportiert werden.
3. Extrahieren von Daten aus der globalen Lebensdaueranalyse zur Anzeige und Analyse
   1. Klicken Sie auf das Menü Oberfläche und dann auf die Option Globale Anpassung , um das Fenster mit den angepassten Daten zu öffnen.
   2. Die Genauigkeit für die Werte der optischen Dichte und der Zeitverzögerungs-/Wellenlängenachse muss für die Hauptkomponenten (obere rechte Kachel) bzw. DADS (untere linke Kachel) angepasst werden. Bewegen Sie den Mauszeiger über das Hauptkomponentenfenster, bis das Einstellungsfeld unten rechts angezeigt wird.
   3. Klicken Sie schnell auf die Schaltfläche x.xx , fahren Sie mit der Maus über "Präzision" und klicken Sie im Menü auf 6 , um die Anzahl der Dezimalstellen festzulegen.
   4. Bewegen Sie den Mauszeiger über das Hauptkomponentenfenster, bis das Einstellungsfeld unten rechts angezeigt wird. Klicken Sie schnell auf die y.yy-Schaltfläche , fahren Sie mit der Maus über "Präzision" und klicken Sie im Menü auf 6 , um die Anzahl der einzubeziehenden Dezimalstellen festzulegen.
   5. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Fenster Principal Kinetic Traces . Klicken Sie auf Daten in die Zwischenablage exportieren. Dadurch wird es vorübergehend gespeichert, damit es in ein anderes Softwareprogramm eingefügt werden kann.
   6. Fügen Sie diese Daten in das gewünschte Softwaredokument (z. B. Excel) ein und speichern Sie.
      HINWEIS: Die Daten werden als eine Reihe von Spalten gespeichert, die zuerst die Zeitverzögerungen, dann die kinetischen Hauptspuren gefolgt von der Anpassungslinie enthalten. Es gibt einen Satz für jede Hauptkomponente, die bei der Vorbereitung der globalen Analyse ausgewählt wird. Die DADS-Spektren wurden bereits im Rahmen des Anpassungsverfahrens in Schritt 2.4.7 gespeichert.

Ergebnisse

Die Aufbereitung und Analyse einer Probe von 1,4-Bis[2-(5-phenyloxazolyl)]benzol, POPOP in Ethanol wurde nach dem oben beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die Messungen wurden mit einem ultraschnellen transienten Absorptionsspektrometer durchgeführt, wie in Abbildung 1 beschrieben, mit flüssigen Lösungen in 2-mm-Küvetten unter Verwendung eines verstellbaren Küvettenhalters und eines Magnetrührers, um das Mischen zu gewährleisten. Die Proben wurden unter Umgebungsbedingungen ohne zusätzliche Kontrollen für Temperatur oder Atmosphäre gemessen. Das optische Fenster von 340 nm bis 680 nm wurde mit einem Calciumfluoridkristall erzeugt. Zweihundertfünfzig (250) Zeitpunkte wurden zwischen -5 ps und ~5500 ps gesammelt, und drei Scans wurden gemittelt, um den endgültigen Datensatz zu generieren ( Abbildung 3). Die POPOP-Daten wurden wie im Protokoll beschrieben aufbereitet. Ein Beispiel für eine suboptimale Chirp-Korrektur ist in der ergänzenden Abbildung 16 dargestellt. Eine kinetische Anpassung mit einer Wellenlänge wurde auf POPOP durchgeführt, wobei 632 nm als interessierende Wellenlänge ausgewählt wurden. Zusätzlich wurde eine globale Analyse von POPOP durchgeführt, wie im Protokoll beschrieben.

Die kinetische Anpassung von POPOP bei 632 nm mit einer Wellenlänge ergab zwei Lebensdauern. Diese Lebensdauern durften variieren und es wurden keine weiteren Anpassungen vorgenommen. Die endgültigen Parameter waren wie folgt: t0 = −0,1176 ps, IRF = 0,436 ps, A1 = 0,0956, t1 = 1,614 ps, A2 = 0,0646, t2 = 522,2 ps (Abbildung 4). Diese Ergebnisse stimmen gut mit der später durchgeführten globalen Analyse und den gemeldeten Emissionslebensdauerwerten für POPOP (τ = 1,35 ns)¹⁷ überein. Ein Beispiel für eine Einzelwellenlängenanpassung mit zu wenigen Lebensdauerkomponenten ist in der ergänzenden Abbildung 16 dargestellt und diskutiert.

Die Anpassung der globalen Analyse an POPOP wurde durchgeführt, nachdem bei der SVD 15 Hauptkomponenten (PCs) ausgewählt wurden. Nach der Anpassung wurden zwei Standzeiten ausgewählt, es wurden keine Parameter festgelegt. Die endgültigen Parameter, die durch die Anpassung erhalten wurden, waren wie folgt: t0 = −0,1586 ps, tp (IRF) = 0,4408 ps, t1 = 1459 ps, t2 = 267,5 ps. Die zerfallsassoziierten Differenzspektren sind in Abbildung 5 dargestellt. Die Ergebnisse stimmten gut mit denen der einfachen kinetischen Anpassung bei 632 nm und den Lebensdauerwerten für POPOP¹⁷ überein. Zwei Beispiele für suboptimale globale Analysen werden in der ergänzenden Abbildung 16 gezeigt und diskutiert.

Abbildung 1: Schematische Darstellung des in diesem Protokoll beschriebenen Femtosekunden-Breitband-Transientenabsorptionsinstruments. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Simulation von TAS-Daten und Beiträgen zum TAS-Signal. (A) Gaußsche Kurven, die ein Grundzustandsabsorptionsspektrum (blau gestrichelte Linie) und ein angeregtes Zustandsspektrum (rot gestrichelte Linie, rotverschoben vom Grundzustandsspektrum) simulieren. Die Differenzspektren dieser beiden Spektren (violett, durchgezogene Linie) sind das Differenzspektrum, wie es in TA gesehen wird. Die Unterschiede zwischen den Spektren des Grund- und des angeregten Zustands wurden zur Veranschaulichung übertrieben. (B) Ein repräsentatives TA-Differenzspektrum von POPOP bei 1,04 ps nach Anregung bei 330 nm. Die gestrichelten Linien zeigen die Grundzustandsabsorption und die stationäre Emission von POPOP. Hervorgehobene Regionen zeigen gemeinsame TA-Merkmale, Grundzustandsbleiche (GSB), stimulierte Emission (SE) und Absorption im angeregten Zustand (ESA), die in diesen Daten beobachtet wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Vorbereitete Daten für POPOP, die sich aus der Anwendung von Schritt 1 - Aufbereitung der Daten ergeben. Die Daten werden als korrigierte Heatmap und repräsentative Spektren angezeigt. Diese Ergebnisse zeigen, wie die Daten aussehen sollten, nachdem die Korrekturen angewendet wurden und man bereit ist, eine Anpassung auf den Datensatz anzuwenden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Ergebnisse der Einzelwellenlängenanpassung von POPOP bei 632 nm nach Anwendung von Schritt 2.3 - Einzelwellenlängenanpassung . Die Abbildung zeigt (oberer Abschnitt) die erhaltenen Lebensdauern in Tabellenform, (mittlerer Abschnitt) die Daten (blaue Punkte) und die Anpassung an die Daten (rote Anpassungslinie) und (unterer Abschnitt) das Residuendiagramm. Beachten Sie, dass im Abschnitt "Stromanpassung" die Amplituden (A) als ΔA-Werte aus den Daten angezeigt werden, die den Beitrag dieser spezifischen Lebensdauerkomponente bei t0 darstellen. Wenn die aktuelle Anpassung jedoch gespeichert wird und in der Tabelle "Anpassungskoeffizienten" angezeigt wird, werden standardmäßig die normalisierten Amplituden angezeigt. Diese Einstellung kann geändert werden, indem Sie das Kontrollkästchen neben der Beschriftung "Passungskoeffizienten" "Normalisiert" deaktivieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Ergebnisse der globalen Analyseanpassung von POPOP, die nach Schritt 2.4 der Anpassung erhalten wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Beispiel für stimulierte Raman-Streuung, die in experimentellen TA-Daten beobachtet wurde. In diesem Datensatz (nicht in den im Tutorial gezeigten POPOP-Daten) wurde die Probe bei 550 nm angeregt (gekennzeichnet durch die gestrichelte Linie). Raman-Streuung tritt um den Zeitpunkt Null auf und erscheint im Allgemeinen sowohl blau (Anti-Stokes-Raman-Streuung) als auch rot (Stokes-Raman-Streuung) der Pumpenanregungswellenlänge. Die stimulierte Raman-Streuung ist kurzlebig, typischerweise nur um ~200 fs, da sie als Ergebnis der Wechselwirkung des Sondenstrahls mit der Probe zur gleichen Zeit wie der Pumpstrahl auftritt und dadurch den Raman-Prozess stimuliert. Das Feature lässt sich jedoch nicht vermeiden und sollte beim Zuschneiden entfernt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: Hauptmenü beim ersten Laden der Daten. Im Allgemeinen gibt es in dieser Anpassungssoftware Optionsfelder, die in der unteren rechten Ecke eines Fensters erscheinen, wenn der Mauszeiger über das Fenster bewegt wird. Diese Felder ermöglichen die Änderung der Cursorinteraktion mit dem Fenster, entweder das Verschieben der Auswahl, das Zoomen oder das Schwenken der ausgewählten Fenster. Es gibt auch Optionen zum Anpassen der Genauigkeit sowohl der x-Achsen- als auch der y-Achsenskala für das Fenster sowie zum Umschalten der Anzeige von linear auf logarithmisch. Die Achsen können auch verriegelt oder entriegelt werden. Während eine Achse gesperrt ist, bleibt sie in der angegebenen Zoomstufe oder im angegebenen Wertebereich. Wenn er entsperrt ist, wird der Bereich so umgeschaltet, dass er den vollständigen Datensatz enthält. Andere Optionen ermöglichen es, die Anzeige von Zahlen und die Einfärbung von Rastern anzupassen, falls vorhanden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Flächenmenü zur Durchführung der Streulichtsubtraktion. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Subtrahieren Sie den Streulichtschirm - stellen Sie die Spektren auf den Durchschnitt ein. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 4: Einstellung des Zuschneidebereichs. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 5: Zuschneiden des Datensatzes. Beschnittene Daten werden dauerhaft entfernt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 6: Passen Sie das Lösungsmittelreaktionsfenster und ein Beispiel für die Anpassung der Lösungsmittelantwort (in roter Linie) an die Daten an (blaue Punkte). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 7: Chirp-Korrekturfenster mit "leeren" Beispieldaten. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 8: Chirp-Korrektur zusammen mit dem Datensatz. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 9: Fenster "Einzelne kinetische Einpassung". Darüber hinaus kann der Benutzer mit einem Schieberegler oben die Wellenlänge auswählen, bei der die Anpassung durchgeführt werden soll. Die Auswahl einer geeigneten Wellenlänge erfordert Kenntnisse der Spektroskopie des Systems, um zu erkennen, wo Prozesse von Interesse auftreten. Beispiele sind Ladungstransferprodukte, Triplettbildung oder Photoproduktbildung, von denen bekannt ist, dass ihre spektralen Eigenschaften mit bestimmten Wellenlängen korrelieren. Diese spezifischen Wellenlängen können angepasst werden, um die Lebensdauer dieser spezifischen Ereignisse zu erhalten. Darüber hinaus kann eine Auswahl von Wellenlängen verwendet werden, um ein ausgewähltes globales Anpassungsmodell zu validieren. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 10: Einstellen von Parametern für die einzelne kinetische Einpassung. Einzelne Passungsparameter können auf Wunsch von Hand festgelegt oder geändert werden, um die Passung zu verfeinern und die Standardabweichung des Rests zu minimieren. Hinweis: Parameter können einfach angepasst werden, indem Sie auf den Wert im Feld klicken und dann mit einem Schieberegler anpassen oder manuell einen Wert eingeben. Die angezeigte Anpassung wird in Echtzeit angepasst, wenn sich die Werte ändern. Wenn eine akzeptable Anpassung erreicht ist, kann die Anpassung durch Rechtsklick auf den Anpassungsbildschirm exportiert werden, wodurch die Daten in die Zwischenablage exportiert werden können, um sie in ein gewünschtes Programm oder als Bild zur schnellen Anzeige einzufügen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 11: Das Einschränken und Fixieren von Werten von Parametern für die einzelne kinetische Anpassung kann durchgeführt werden, wenn ein oder mehrere Parameter bekannt sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 12: Einzelwertzerlegungsfenster mit Hauptkomponenten, die zeigen, wie die Leiterbahn und die Komponenten aussehen, wenn genügend Hauptkomponenten hinzugefügt werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 13: Fenster "Globale Anpassung" vor der Generierung der globalen Analyseanpassung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 14: Fenster "Globale Anpassung" mit den Ergebnissen der Anpassung der globalen Analyse. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 15: Dateimenü zum Speichern und Exportieren von Dateien. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 16: Beispiele für suboptimale Chirp-Korrektur und -Anpassung. (A) zeigt eine schlechte einfache kinetische Passung. Die Art des strukturierten Residuals, das in Feld A angezeigt wird, zeigt in der Regel an, dass eine zusätzliche Lebensdauer erforderlich ist, um die Daten anzupassen. Beachten Sie, dass das Residuum bei kürzeren Zeiten unter Null sinkt und bei längerer Lebensdauer über die Nulllinie angehoben wird. (B) demonstriert eine korrekte Chirp-Korrektur mit der Vorschauschaltfläche, bei der Features begradigt werden und keine Krümmung in den Daten vorhanden ist. (C) zeigt eine falsche Chirp-Korrektur, bei der im blauen Teil des Spektrums eine merkliche Krümmung vorhanden ist, was darauf hindeutet, dass die Chirp-Funktion in diesem Bereich überkorrigiert ist. (D) zeigt eine schlechte Anpassung der globalen Lebensdaueranalyse, bei der eine Überanpassung (einschließlich zu vieler Parameter) zu "symmetrischen" DADS (die wie Spiegelbilder voneinander über die x-Achse aussehen) ähnlicher Lebensdauerbereiche geführt hat, die sich im Wesentlichen gegenseitig aufheben. Wenn diese Merkmale beachtet werden, sollte die Passung nicht verwendet werden. (E) zeigt eine schlechte globale Anpassung, bei der zu viele Parameter zu einer sehr kurzen Lebensdauer mit einer sehr großen Amplitude geführt haben. Das in (E) vorhandene Problem kann auch auftreten, wenn Artefakte um den Zeitpunkt Null herum nicht richtig korrigiert werden und sich die Anpassung auf die Minimierung des Residuums konzentriert, indem die sehr kurze Lebensdauer (eine, die physikalisch nicht sinnvoll ist) überbetont wird. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 17: Beispiel für TAS-Daten mit Raman-Streuung. Die Streuung ist um den Zeitpunkt Null herum vorhanden und fällt mit der Wellenlänge der Pumpenanregung zusammen. Die Streuung besteht aus einer Reihe von scharfen Peaks mit einem sehr intensiven positiven Peakblau der Pumpanregung und einem negativen Peakrot der Pumpanregung. Diese Funktion kann nicht sinnvoll verhindert werden und sollte aus den Daten herausgeschnitten werden, um eine Beeinträchtigung der Anpassungsergebnisse zu vermeiden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 1: Datei, die den Datensatz für dieses Tutorial enthält (POPOP data_POPOP-inEtOH.ufs). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 2: Datei, die ein leeres Dataset für dieses Tutorial enthält (POPOP data_BLANK.ufs). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 3: Unterstützende Informationsdateien mit zusätzlichen Kommentaren zur Anpassung der Lösungsmittelreaktion, zur Korrektur von Scatting und zum Subtrahieren von Oberflächen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Allgemeine Überlegungen zur Datenaufbereitung
Die Anpassung von TA-Daten mag auf den ersten Blick relativ einfach erscheinen, und es könnte erwartet werden, dass eine klare richtige "Antwort" für einen bestimmten Datensatz resultieren sollte. Wie im Protokoll hervorgehoben, gibt es jedoch viele Faktoren bei der Datenerfassung, Datenaufbereitung und Datenanalyse, die sorgfältig berücksichtigt werden müssen und zu Unsicherheit darüber führen können, welches Modell oder welcher Satz von Anpassungsparametern die Daten am besten beschreibt. Das Ziel der Datenaufbereitung und -anpassung besteht darin, so viele dieser Fremdfaktoren wie möglich zu reduzieren und gleichzeitig die Daten für die Analyse zu erhalten. Die anstehende Aufgabe mag für einen Anfänger entmutigend erscheinen, da es viel zu beachten gibt. Um eine Intuition für den Anpassungsprozess aufzubauen, wird der Anfänger ermutigt, dieselben Daten mehrmals von Grund auf auf leicht unterschiedliche Weise vorzubereiten, um zu überprüfen, wie dramatisch sich die Schritte der Datenaufbereitung auf die beste Anpassung auswirken. Darüber hinaus können zwei verschiedene Forscher dieselben Daten aufbereiten und anpassen und die Ergebnisse vergleichen. Dieser Prozess kann die ersten Male zeitaufwändig sein, ermöglicht es dem Anfänger jedoch, eine Intuition dafür zu entwickeln, wie Daten für zukünftige Proben konsistent vorbereitet werden können. Wie jede Fähigkeit wird auch diese Datenaufbereitung und -anpassung Zeit in Anspruch nehmen, und der Anfänger wird ermutigt, geduldig und diszipliniert zu sein, wenn er mit dem Prozess experimentiert und ihn lernt. Der in dieser Studie verwendete Datensatz wird bereitgestellt, um dem Anfänger die Möglichkeit zu geben, direkt neben das Tutorial zu passen und die Ergebnisse direkt mit denen des Tutorials zu vergleichen.

Die Daten können Hintergrundmerkmale enthalten, die bei ständigen Zeitverzögerungen vorhanden sind (Ergänzende Abbildung 2 und Ergänzende Abbildung 3), wie z. B. Streuung des Pumpstrahls und spontane Emission der Probe. Diese unerwünschten Merkmale müssen entfernt werden, um das transiente Absorptionssignal von der interessierenden Spezies zu isolieren¹¹. Das Entfernen solcher Merkmale erfolgt durch Auswählen, Mittelung und Entfernen des Beitrags einer Reihe von Spektren mit negativer Zeitdifferenz. Bei der Auswahl von Hintergrundspektren ist darauf zu achten, dass keine Features, die Teil des interessierenden Prozesses sein könnten, entfernt werden können. Hintergrundmerkmale, die sich aus dem Lösungsmittel ergeben, wie z. B. die Absorption von Verunreinigungen oder das Lösungsmittel selbst, können ebenfalls in den TA-Daten beobachtet werden. Wenn das Lösungsmittel ein Signal erzeugt, muss ein "leerer" Datensatz, der nur das Lösungsmittel enthält, unter genau den gleichen experimentellen Bedingungen wie die Probe ausgeführt werden, vom Probendatensatz abgezogen werden. Einzelheiten zu diesem Verfahren sind in der Zusatzdatei 3 enthalten.

Die Chirp-Korrektur ist ein weiterer Faktor, den Sie sorgfältig berücksichtigen sollten. Chirp tritt auf, wenn sich der Sondenpuls zur Probe bewegt und sich aufgrund von Unvollkommenheiten in den Lenkspiegeln oder durch den Durchgang durch dispersive Optiken wie Linsen oder Filter verbreitert. Das Endergebnis ist, dass Photonen mit niedrigerer Energie im Sondenpuls (d. h. die rote Seite des Sondenspektrums) vor Photonen mit höherer Energie (d. h. der blauen Seite des Sondenspektrums) an der Probe ankommen. Dies führt dazu, dass der "Zeitnullpunkt" der TA-Spektren über mehrere Femtosekunden oder Pikosekunden¹⁸ verschmiert wird, was sich als deutliche Kurve im Rohdatensatz manifestiert, die in den blauen Wellenlängen beginnt und dann abflacht, wenn sie sich den roten Wellenlängen nähert (Ergänzende Abbildung 7). Chirp ist am deutlichsten auf kürzeren Zeitskalen, wie z. B. solchen, auf die ultraschnelle TA zugreift. Diese wellenlängenabhängige Zeit Null kann wie im Protokoll beschrieben korrigiert werden, aber die Anwendung dieses Prozesses kann schwierig und subjektiv sein. Eine "leere" Probe oder Messung der Lösungsmittel-Kerr-Reaktion kann die subjektive Natur der manuellen Auswahl von Punkten für die Chirp-Korrektur minimieren, die zur Erzeugung der polynomialen Anpassung erforderlich ist, die zur Anpassung und Korrektur des Chirps verwendet wird. Das Ziel der Chirp-Korrektur ist es, die eindeutige "Kurve" der Zeit Null zu entfernen. Es kann mehrere Versuche erfordern, den Chirp anzupassen, um die besten chirpkorrigierten Daten zu erhalten. Die Daten können mehrfach mit verschiedenen Chirp-Korrekturen angepasst werden, um ein Verständnis für die Auswirkungen der Chirp-Korrektur auf die Werte der kurzen TA-Lebensdauer zu erhalten.

Artefakte, die zum "Zeitpunkt Null" erscheinen
In TA-Daten können mehrere Artefakte nahe dem "Zeitpunkt Null" beobachtet werden, darunter Rayleigh-Streuung, stimulierte Raman-Streuung und Kreuzphasenmodulation. Die Rayleigh-Streuung des Pumpstrahls ist eine elastische Streuung, die ohne Energieänderung entsteht. Diese Funktion wird bei der gleichen Wellenlänge wie der Pumpimpuls angezeigt. Stimulierte Raman-Streuung kann das Pumpstreusignal¹⁹ begleiten. Die Raman-Streuung, die aus der inelastischen Streuung eines Pumpphotons resultiert, erzeugt Peaks sowohl bei höherer (Anti-Stokes) als auch bei niedrigerer (Stokes) Energie als die einfallende Pumpenergie. In TA-Daten wird eine stimulierte Raman-Streuung aufgrund der gleichzeitigen Bestrahlung der Probe mit den Pump- und Sondenstrahlen beobachtet. Wenn der Sondenstrahl gleichzeitig mit dem Pumpstrahl mit der Probe interagiert, stimuliert er den Raman-Prozess. Daher tritt die stimulierte Raman-Streuung um den Zeitpunkt Null herum auf und führt zu zusätzlichen Peaks in den Spektren innerhalb der ersten paar hundert Femtosekunden (Abbildung 6, beobachtet im dunkleren blauen Spektrum im hervorgehobenen Bereich und ergänzende Abbildung 17). Die Kreuzphasenmodulation entsteht durch die Modulation des Brechungsindex des Lösungsmittels durch Wechselwirkung mit dem intensiven elektrischen Feld eines Pulses.

Die stimulierte Raman-Streuung kann von der Kreuzphasenmodulation unterschieden werden, da die Raman-Peaks bei bestimmten Frequenzen auftreten, die den Schwingungsmoden des Lösungsmittels entsprechen. Da es sich um einen Raman-Prozess handelt, können sowohl Stokes- als auch Anti-Stokes-Linien auf beiden Seiten der Anregung beobachtet werden. Chlorierte Lösungsmittel wie Methylenchlorid zeigen aufgrund der großen Polarisierbarkeit von Chlor sehr ausgeprägte Raman-Banden. Die spektralen Signaturen der Kreuzphasenmodulation sind einzigartig für ein Lösungsmittel, aber nicht so leicht vorherzusagen wie Raman-Streumerkmale.

Abhängig von der Kinetik der zu messenden Probe können sich Rayleigh-Streuung, Raman-Streuung und Cross-Phasen-Modulation mit frühen Merkmalen der TA-Daten überschneiden und es kann schwierig sein, sie aus den Daten zu entfernen. Im Prinzip können diese Merkmale in einer sauberen Lösungsmittelmessung gesehen und von den Daten subtrahiert werden, Datenanalyseprogramme können Anpassungsfunktionen haben, um diese Merkmale zu berücksichtigen, aber in der Praxis kann dies schwierig sein. Wenn es zu schwierig ist, diese Artefakte zu subtrahieren, ohne die Beispieldaten zu beeinträchtigen, ist es möglicherweise besser, die kompromittierten Spektren um den Zeitpunkt Null herum auszuschneiden, um die Artefakte zu eliminieren. Dies hat den unglücklichen Nebeneffekt, dass die ersten etwa 300 fs Daten entfernt werden, aber die Anpassung wird später zuverlässiger. Im Laufe der Analyse mehrerer Datensätze derselben und unterschiedlicher Stichproben gewinnt der Anfänger eine Intuition, um dieses Gleichgewicht zwischen Subtrahieren der Hintergrundoberfläche und dem Ausschneiden der anfänglichen 100-200 fs-Daten zu erreichen.

Ein allgemeines Zuschneiden kann für Teile der Spektren erforderlich sein, die ein geringes Signal-Rausch-Verhältnis enthalten. Instabilität im Sondenstrahl in bestimmten Bereichen, geringe Intensität des Sondenlichts, zu hohe Probenkonzentrationen (wodurch ein Großteil der einfallenden Sonde blockiert wird), niedrige Pumpintensität und der Absorptionsquerschnitt der Probe sind typische Ursachen für ein geringes Signal-Rausch-Verhältnis, das die Anpassung der Daten erschweren kann. In diesen Fällen kann das Zuschneiden des Datensatzes auf beiden Seiten des optischen Fensters, um ein gewünschtes Signal-Rausch-Verhältnis zu erreichen, den Anpassungsprozess unterstützen.

Ein Datensatz ist bereit für die Analyse, sobald er ausreichend beschnitten wurde, um schlechte Abschnitte des Datensatzes zu entfernen, der Chirp korrigiert und Hintergrundspektren gemittelt und subtrahiert wurden. Dieses Verfahren sollte zu Daten führen, die nur die Teile enthalten, die für die interessierende Photophysik und Photochemie am relevantesten sind. Es ist in der Tat klar, dass dieser Prozess ein gewisses Maß an Subjektivität aufweist. Das Ziel bei der Datenaufbereitung besteht darin, ein Gleichgewicht zwischen dem Entfernen von Artefakten zu finden, damit sie die Anpassung nicht stören, aber nicht so viel, dass die Integrität des Datensatzes beeinträchtigt und dadurch seine Interpretation behindert wird. Dieses Gleichgewicht zu finden, erfordert Zeit und Erfahrung, um die Intuition dafür aufzubauen, was ein Artefakt und was Daten sind. Das Anpassen (und erneute Anpassen) desselben Datensatzes an mehreren verschiedenen Tagen oder das Anpassen derselben Daten durch zwei Forscher kann eine Möglichkeit sein, menschliche Fehler und die Subjektivität der Datenaufbereitung und -analyse zu minimieren.

Allgemeine Überlegungen zur Anpassung und Auslegung
Nachdem die rohen TA-Spektren verarbeitet wurden, müssen sie interpretiert und modelliert werden, um Informationen über die Spezies und die Dynamik im interessierenden System zu extrahieren. Dieser Prozess kann als dreistufiges Verfahren beschrieben werden, das die anfängliche spektrale Interpretation, die quantitative Modellierung/Anpassung und die Zuordnung der spektralen Interpretation zum Modell/Fitting umfasst.

Erste spektrale Interpretation: Im Schritt der spektralen Interpretation besteht das Ziel darin, in den TA-Spektren vorhandene Merkmale elektronischen Zuständen zuzuordnen, auf die in der photophysikalischen oder photochemischen Entwicklung des Systems zugegriffen wird. Zu Beginn sollten verschiedene Zustände identifiziert werden. In dieser Arbeit beziehen sich Zustände auf einzigartige elektronische Zustände, die Teil der photophysikalischen oder photochemischen Entwicklung des Systems sind. Ein Zustand, der beispielsweise durch eine spezifische potentielle Energiekurve (PEC) dargestellt wird, besitzt eine Reihe charakteristischer Peaks, die sein Absorptionsspektrum darstellen. Eine Änderung, die innerhalb eines einzelnen Zustands auftritt, wird als Prozess bezeichnet. Ein photophysikalischer Prozess kann in TA-Spektren als Peakverschiebung oder als Änderung der Breite des Spektrums auftreten. Der Schlüsselaspekt eines Prozesses ist, dass die Bevölkerung des Staates gleich bleibt (d. h. der Prozess findet innerhalb eines bestimmten PEC statt); Es ist die Verteilung der Energie innerhalb des Staates, die sich ändert. Eine Veränderung der Bevölkerung eines Staates wird als Übergang bezeichnet. Während eines Übergangs entwickelt sich das System zu einem anderen PEC (d. h. einem elektronischen Zustand). Übergänge können interne Umwandlung (IC), Intersystemkreuzung (ISC), Ladungsübertragung, Energieübertragung, Bildung neuer Produkte oder Rückkehr in den Grundzustand umfassen. Richtlinien für die Zuweisung von Zuständen, Prozessen und Übergängen werden in den folgenden Abschnitten erläutert.

Zustände zuweisen
Der erste Schritt in diesem Prozess besteht darin, spektrale Merkmale bestimmten chemischen Spezies oder Zuständen zuzuweisen. Der S_1-Zustand in TA sollte eine Lebensdauer aufweisen, die der Fluoreszenzlebensdauer entspricht, die mit der zeitaufgelösten Emissionsspektroskopie gemessen wurde. Ein Triplett-Zustand kann verifiziert werden, wenn seine Lebensdauer durch Sauerstoff gelöscht wird. Wenn ein radikales Anion oder Kation in der photophysikalischen Entwicklung vermutet wird, kann Spektroelektrochemie oder chemische Oxidation/Reduktion durchgeführt werden, um die Radikalspezies zu erzeugen, und ein Absorptionsspektrum dieser Spezies kann erhalten und mit der TA-Bandform verglichen werden. Die Elektronenspinresonanzspektroskopie (ESR) kann durchgeführt werden, um das Vorhandensein freier Radikale zu überprüfen. Ein ausgezeichneter Tutorial-Vortrag, der von der ACS-Abteilung für Anorganische Chemie veranstaltet wird, gibt einen Überblick über TA und solche Überlegungen bei der Zuweisung von Merkmalen²⁰. Nachdem den Arten Banden zugewiesen wurden, besteht der nächste Schritt bei der Interpretation von TA-Spektren darin, die im System ablaufenden dynamischen Prozesse qualitativ zu beschreiben. Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung, da er dem Forscher eine Vorstellung davon gibt, welche Modelle für die Beschreibung seines Systems geeignet sind, und ihm eine Grundlage für den Vergleich der Anpassungsparameter gibt.

Änderungen innerhalb eines Zustands
Schwingungskühlung, geometrische Umlagerung oder Solvatation sind extrem schnelle Prozesse (sub-ps bis 10's ps), die mit TA beobachtet werden können. Schwingungskühlung wird als schnelle Blauverschiebung des TA-Spektrums auf einer Zeitskala von mehreren Pikosekunden beobachtet 21,22,23. Geometrische Neuanordnungen können auf der Zeitskala von 10 ps auftreten. Die Solvatationsdynamik wird in herkömmlichen dipolaren Flüssigkeiten als Rotverschiebung und Verengung des Spektrums über mehrere Pikosekunden beobachtet, aber hochviskose Lösungsmittel wie Glycerin, Polyethylenglykol (PEG), ionische Flüssigkeiten und tiefe eutektische Lösungsmittel können eine Solvatationsdynamik aufweisen, die über mehrere Nanosekunden auftritt 24,25,26.

Veränderungen in der Bevölkerung eines Bundesstaates
Reaktionen sind durch eine Änderung der Intensität eines Bandes gekennzeichnet, wobei eine Abnahme der Intensität mit einer Abnahme der Konzentration seiner chemischen Spezies verbunden ist und umgekehrt für eine Erhöhung. In einigen Fällen sind sowohl der Reaktant als auch die Produktspezies in den Spektren sichtbar, während in anderen die Produktzustände zu kurzlebig oder zu weit rotverschoben sind, um beobachtet zu werden. Oft können Zustandsübergänge durch das Vorhandensein eines isosbestischen Punktes in den Spektren beobachtet werden.

Quantitative Modellierung/Anpassung: Ein Modell muss dann an die Daten angepasst werden, um quantitative Informationen über die Dynamik des Systems zu extrahieren. Wie bereits in der Einleitung beschrieben, gibt es eine Vielzahl von Modellen, die verwendet werden können. Dieses Protokoll konzentriert sich auf zwei der gebräuchlichsten Methoden: Einzelwellenlängenanpassung und globale Analyse. Bei der Einzelwellenlängenmethode werden einzelne Wellenlängenspuren aus den Spektren an eine funktionale Form angepasst, typischerweise eine Summe von Exponentialen:

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wobei ΔA(t) das TA-Signal bei einer gewählten Wellenlänge ist, n die Anzahl der exponentiellen Komponenten und a_idie Amplitude der exponentiellen Komponente i mit einer Zeitkonstante τ_i. Es können mehrere Komponenten hinzugefügt werden, bis die Anpassung die experimentellen Daten reproduziert. Das Ziel eines jeden Anpassungsprozesses besteht darin, die Daten mit ausreichender Lebensdauer zu modellieren, um die Daten gut zu reproduzieren, aber die Daten nicht durch zu viele Komponenten anzupassen. Daher werden gewichtete Anpassungsgüteparameter wie verwendet, um zu bestimmen, wann die Daten innerhalb experimenteller Unsicherheiten⁵ angepasst sind.

Nachdem der Zerfall zufriedenstellend angepasst wurde, können die Parameter des Modells verwendet werden, um die Dynamik des Systems zu charakterisieren. Die resultierenden Zeitkonstanten können dann extrahiert und interpretiert werden. Leider bedeutet die große Anzahl überlappender Merkmale in TA-Spektren, dass eine einzelne Wellenlänge im Spektrum eine Dynamik enthalten kann, die verschiedenen Spezies entspricht, deren spektrale Signaturen sich überlappen, was bedeutet, dass die aus einer einzigen Wellenlängenanpassung extrahierten Zeitkonstanten eine Zusammensetzung mehrerer zusammenfallender Prozesse darstellen können. Darüber hinaus beeinflussen Änderungen der Bandform und -position auch die Amplituden und Zeitkonstanten, die aus der Einzelwellenlängenanpassung extrahiert werden. Diese Probleme können in einigen Fällen durch eine Anpassungsmethode namens "Bandformanalyse" umgangen werden, bei der man eine funktionelle Form für die TA-Banden jeder absorbierenden Spezies im System bestimmt oder annimmt. Diese Formen werden dann mit zeitabhängigen Amplituden gewichtet und summiert, um das beobachtete Spektrum zu reproduzieren. Dieses Verfahren wird häufig bei der Analyse von zeitaufgelösten Fluoreszenzspektren verwendet, aber die komplizierteren Formen und überlappenden Komponenten von TA-Banden machen diese Methode nur in wenigen einfachen Fällen haltbar, wie an anderer Stelle^{beschrieben 10}.

Ein weiterer Nachteil der Einzelwellenlängenanpassung besteht darin, dass sie den breiten Spektralbereich moderner TA-Experimente nicht an sich nutzt. Man könnte im Prinzip jede einzelne Wellenlänge der Spektren methodisch anpassen, aber eine solche Analyse ist umständlich, zeitaufwändig und rechenintensiv. Um dieser Herausforderung zu begegnen, kann eine Methode namens "globale Analyse" verwendet werden, um gleichzeitig einen ganzen Satz von TA-Spektren an einen Satz gemeinsamer dynamischer Parameter^{anzupassen 4}. Die globale Analyse und eine eng verwandte Methode namens Zielanalyse sind erfolgreiche und weit verbreitete Methoden, aber sie haben auch ihre eigenen einzigartigen Nachteile und Einschränkungen. Wie bei jedem Modell ist es unerlässlich, die Annahmen zu verstehen, die zu seiner Erstellung verwendet werden, sowie die Einschränkungen, die sie mit sich bringen.

In der globalen Analyse werden TA-Spektren durch eine m x n-Matrix dargestellt, wobei m die Anzahl der in jedem Spektrum gemessenen Wellenlängen und n die Anzahl der gesammelten Zeitpunkte darstellt. Es wird dann angenommen, dass diese Matrix in das Produkt zweier anderer Matrizen zerlegbar ist:

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wobei C(t) eine n durch k-Matrix und S(λ) eine m durch k-Matrix ist. Der Wert k stellt die Anzahl der unterschiedlichen Spektralkomponenten dar, die zur Reproduktion der Spektren verwendet werden. Jede dieser Komponenten repräsentiert eine absorbierende Spezies mit einer einzigartigen spektralen Signatur und Dynamik. Die S(λ)-Matrix repräsentiert die TA-Spektren der k Komponenten und C(t) ihre zeitabhängigen Konzentrationen. In der einfachsten und gebräuchlichsten Implementierung der globalen Analyse wird angenommen, dass jede Komponente eine einfache exponentielle Kinetik aufweist (i = 1 in Gleichung 2, wobei jeder Komponente eine eigene Zeitkonstante zugewiesen wird). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das gesamte TA-Spektrum durch die Summe der k Spektrenkomponenten dargestellt werden kann, von denen jede ihr eigenes charakteristisches Absorptionsspektrum und einen einzelnen exponentiellen Zerfall aufweist.

Wenn die TA-Spektren angepasst sind, schätzt der Benutzer, wie viele Komponenten (d. h. ein Wert für k) benötigt werden, und schätzt die Zeitkonstante, die mit einem einfach-exponentiellen Zerfall dieser Spezies verbunden ist. Der Monteur generiert dann_{C guess}(t) und löst Gleichung 3 für S_fit(t). Als nächstes werden S_fit(λ) und C_guess(t) wie in Gleichung 3 multipliziert, um die angepassten Spektren, ΔA(λ,t)fit, _zu erstellen. Schließlich werden die Residuen ΔA(λ,t)_exp − A(λ,t)_fit minimiert und die optimale_S-Anpassung (λ) und die Zeitkonstanten zurückgegeben. Die relative Einfachheit der globalen Analyse, die einen ganzen Satz von Spektren mit einer Handvoll Zeitkonstanten und festen spektralen Komponenten darstellt, macht sie zu einer attraktiven (und erfolgreichen) Methode, um die komplizierten Bandformen und Dynamiken der TA-Spektroskopie zu entwirren. Es muss jedoch darauf geachtet werden, dass die globale Analyse ein geeignetes Modell für das vorliegende System ist.

Eine Schlüsselannahme in der globalen Analyse, die in Gleichung 3 dargestellt wird, ist die vollständige Trennbarkeit der Wellenlängen- und Zeitanteile der Dynamik, eine Eigenschaft, die als "Bilinearität" bezeichnet wird. Diese Annahme erfordert, dass die Bandformen der Komponenten zeitunabhängig sind (d. h. sie haben eine feste spektrale Form, die sich nicht mit der Zeit ändert oder verschiebt). Das einzige, was sich während des Experiments ändert, sind die relativen Populationen jeder Komponente, die durch C(t) dargestellt werden. Auf langen Zeitskalen, ~1 ns oder so, gilt diese Annahme in der Regel und die globale Analyse kann ohne große Bedenken verwendet werden. Auf der anderen Seite führen Prozesse im angeregten Zustand wie Schwingungskühlung und Solvatationsdynamik, die auf den ultraschnellen Zeitskalen, die durch Femtosekunden-TA zugänglich sind, zu zeitabhängigen Änderungen der spektralen Signatur einer Spezies und zu einem Zusammenbruch der Bilinearität. Dies bedeutet nicht, dass die globale Analyse einen Datensatz nicht reproduzieren kann, tatsächlich kann sie immer eine zufriedenstellende Anpassung liefern, vorausgesetzt, es wird eine ausreichende Anzahl von Komponenten verwendet. Das Problem liegt dann in der Interpretation der Komponentenspektren und der Zuordnung der Zeitkonstanten zu bestimmten Prozessen im angeregten Zustand, da die Komponenten möglicherweise nicht mehr bestimmten absorbierenden Spezies entsprechen. Daher ist bei der Anwendung der globalen Analyse auf Situationen, in denen keine Bilinearität angenommen werden kann, immer Vorsicht geboten.

Zuweisen der spektralen Interpretation zum Modell/Fitting: Sobald eine Anpassung erhalten wurde, muss die spektrale Interpretation auf die in der Anpassung erhaltenen Lebensdauern abgebildet werden. Die Lebensdauern aus der Anpassung werden sowohl Prozessen als auch Reaktionen zugeordnet, die bei der ersten Interpretation der Spektren identifiziert wurden. Die anfängliche Bewertung aus den Spektren und die Anzahl der angepassten Lebensdauern, die das Modell erhält, werden jedoch möglicherweise nicht sofort aufeinander abgebildet. In dieser (häufigen!) Situation muss der Monteur zurückgehen und die ursprüngliche Interpretation bewerten. Vielleicht gab es eine Vibrationskühlung oder einen anderen Prozess, der bei der Erstbewertung übersehen wurde, aber bei der Modellierung und Anpassung identifiziert wurde. Oder vielleicht könnten zwei verschiedene Sätze von Anpassungsparametern die Daten gut reproduzieren, und die anfängliche Interpretation kann bestimmen, welcher Satz von Anpassungsparametern ausgewählt wird. In diesem letzten Schritt muss der Monteur zwischen Interpretation und Anpassung hin und her gehen, um eine Beschreibung zu finden, die zu einer plausiblen photophysikalischen Zuordnung der Spezies und Dynamik des Systems führt. Andere Anpassungsprogramme, die sequentielle Anpassungsmodelle enthalten, wie z. B. die Zielanalyse, können ebenfalls untersucht werden, um die Anpassungen zu ergänzen, die durch die globale Analyse und die in diesem Artikel^vorgestellte Anpassungssoftware 4 ergeben werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll die Aufbereitung und Anpassung von transienten Absorptionsdaten behandelt. Ziel ist es, die mit dem Prozess verbundenen Herausforderungen aufzuzeigen und Wege zu kommentieren, wie diese Herausforderungen auf praktische Weise vermieden oder gemildert werden können. Die Anpassung von TA-Daten kann, wie die Anpassung der meisten Daten in technischen Bereichen, schwierig und manchmal subjektiv sein. Daher ist es wichtig, sich des Prozesses und der Grenzen der Daten, der Datenaufbereitung und der mathematischen Werkzeuge bewusst zu sein, die zur Modellierung und Bedeutungszuweisung der Daten verwendet werden. Wissenschaftler müssen Daten und Modellierung mit kritischem Blick angehen.

Man kann versuchen, die Subjektivität ihrer Anfälle zu mildern. So können die Daten beispielsweise von verschiedenen Startpunkten und an verschiedenen Tagen aufbereitet und angepasst werden, um sicherzustellen, dass die gleiche Anpassung hergestellt wird. Daten, die an verschiedenen Tagen mit unterschiedlicher Probenvorbereitung aufgenommen wurden, können verglichen werden. Mehrere Forscher können dieselben Daten anpassen und ihre Ergebnisse vergleichen. Im Laufe der Zeit können Forscher eine Intuition für die Daten entwickeln, die sie erhalten (basierend auf den Besonderheiten ihres Versuchsaufbaus und ihrer experimentellen Parameter), die es ihnen ermöglicht, mehr Vertrauen in ihre Passungen zu haben.

Es gibt viel über die Anpassung von TA-Daten und die Details der in diesem Artikel besprochenen Modelle zu lernen. Es werden mehrere ausgezeichnete Übersichtsartikel empfohlen, die sich eingehend mit diesem Thema befassen ^4,10,27. Dieses Protokoll soll einem Anfänger den Einstieg in den Analyse- und Anpassungsprozess erleichtern, der das Interesse an einem tieferen Verständnis des Prozesses weckt.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
EtOH 200% Proof	Decon Laboratories Inc	CAS 64-17-5	Solvent used to prepare Sample
Helios transient absorption spectrometer	Ultrafast systems	https://ultrafast.systems/products/spectrometers-accessories/helios/	Transient absorption spectrometer
POPOP  1,4-Bis[2-(5-phenyloxazolyl)]benzene	Tokyo Chemical Industry	CAS 1806-34-4	Sample used for Examples
Surface Xplorer	Ultrafast systems	https://ultrafast.systems/products/spectrometers-accessories/surface-xplorer/	Fitting program