原代人乳腺上皮细胞的分离和培养

摘要

本研究报告了一种更简单、省时且经济的方案，可从少量乳腺组织中有效地分离和生长原代人乳腺上皮细胞 （HMEC）。该方案适用于快速生产用于实验室和临床应用的初级 HMEC。

摘要

乳腺是乳房的基本结构，在生殖中起着至关重要的作用。人乳腺上皮细胞 （HMEC） 是乳腺癌和其他乳腺相关炎症性疾病的起源细胞，引起了相当大的关注。然而，由于其高度分化、角化性质和较短的寿命，出于研究目的在 体外 分离和培养原代 HMEC 一直具有挑战性。因此，开发一种简单有效的分离和培养 HMEC 的方法对于乳腺生物学和乳腺相关疾病的研究具有重要的科学价值。在这项研究中，我们成功地从少量乳腺组织中分离出原代 HMECs，方法是用酶混合物消化，并在含有 Rho 相关激酶 （ROCK） 抑制剂 Y-27632 的 5% 胎牛血清-DMEM 中进行初始培养，然后在无血清角质形成细胞培养基中扩增。这种方法选择性地促进上皮细胞的生长，从而获得优化的细胞产量。这种方法的简单性和便利性使其适用于实验室和临床研究，这应该为这些重要的研究领域提供有价值的见解。

引言

乳腺癌是全球女性诊断出的主要癌症类型，也是癌症死亡的主要原因¹。乳腺癌的发病机制很复杂，涉及遗传、环境和生活方式等多种因素。HMEC 是活性产奶细胞，是乳腺组织最重要的成分之一，很可能是参与乳腺癌致癌的原始细胞。因此，HMEC 在乳腺癌研究中受到了研究人员的最大关注²。此外，原代细胞能够提供复杂细胞过程的生物学相关特征，因为它们保留了遗传稳定性、正常形态和更完整的基本细胞功能，而永生化细胞系无法实现³。因此，原代 HMEC 的分离和培养是研究大多数乳腺相关疾病（如乳腺癌和乳腺炎症性疾病）的重要步骤。

目前，已经建立了一个稳定且可重复的系统，用于分离、培养和鉴定大鼠、奶牛、猪和山羊的乳腺上皮细胞 4,5,6,7。然而，由于复杂的微环境和低细胞产量，原代 HMEC 的分离和培养具有挑战性。几十年来，科学家们一直在寻找分离和培养 HMEC 的最有效方法，尽管 HMEC 培养系统是在近 20 年前建立的。例如，Hammond 等人开发了一种无血清培养基，其中 HMEC 可有效生长⁸。最近，Zubeldia-Plazaola 等人使用快/慢酶消化程序结合顺序过滤或差速离心步骤测试了四种不同的分离方法，以获得 HMEC⁹。他们发现，慢速消化法与差速离心法是从新鲜乳腺组织中分离 HMEC 的最有效方法。然而，这种分离方法需要大块组织 （40-75 g） 并使用大量的消化酶。他们的程序很复杂（至少需要 3 次不同的离心以获得不同的细胞组分），并且很耗时。因此，仍然需要一种简单快速的方法，从少量乳腺组织中有效地获得 HMEC 群体，用于研究和临床应用⁹。

我们之前的研究表明，在初始培养基中加入 Rho 相关激酶 （ROCK） 抑制剂 Y-27632 可以简化分离人皮肤表皮细胞的过程¹⁰，这也已成功用于分离牙龈上皮细胞¹¹。此外，Zubeldia-Plazaola 小组和 Jin 小组进行的早期研究表明，Y-27632 具有刺激来源于乳腺组织的原代上皮细胞快速和无限体外生长的能力 ^9,12。本研究旨在测试使用 Y-27632 是否会简化 HMEC 的分离和培养，我们成功建立了一种简单易行的方法，从小块 （1 g） 乳腺组织中分离 HMEC。

研究方案

根据浙江中医大学第一附属医院医学伦理委员会的指导方针（方案编号）。ChiMCTR2100005281，日期：2017-07-17）。

1. 组织采集

1. 从成年女性的手术标本中收集新鲜的乳腺组织，将其收集到含有 10 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 和 3% 青霉素/链霉素 （P/S） 的无菌管中。
   注意：从手术中收集后 24 小时内，应根据以下详细信息处理乳腺组织。

2. 组织预处理

1. 用两对镊子从乳腺组织中取出脂肪组织，确保剩余的乳腺组织的重量为 ~1 克。
2. 用 75% 乙醇溶液 （5 mL） 冲洗乳腺组织 5 秒，然后用 20 mL 洗涤液（表 1）洗涤 2 x 5 分钟。

3. 组织消化

1. 将乳腺组织切成更小的碎片，用两个手术刀片将组织切碎 15 分钟以获得组织匀浆。将组织块转移到 50 mL 离心管中。
2. 在含有乳腺组织碎片的 50 mL 离心管中，将 10 mL 5.0 mg/mL 分散酶 + 5.0 mg/mL 胶原酶溶液、3 mL 0.25% 胰蛋白酶和 7 mL PBS 添加到总共 20 mL 消化液中。将试管置于 37 °C 的水浴中并孵育 1.5 小时;每 20 分钟摇动一次试管。
3. 通过注入 20 mL 中和溶液来终止消化过程。通过移液 ~15 次混合内容物。
4. 通过 100 μm 网状过滤器过滤混合物。以 156 × g 离心 5 分钟。
5. 去除上清液，重复沉淀与 20 mL 中和溶液的孵育。通过移液 15 次混合内容物，并以 156 × g 离心 5 分钟。
6. 小心去除上清液，并用 10 mL 初始培养基重悬细胞沉淀。将细胞悬液接种在 100 mm 细胞培养皿中。
7. 在 37 °C 的 5% CO₂ 培养箱中培养细胞。 每三天用新鲜的上皮细胞培养基替换原始培养基。检查细胞并每 2 天刷新一次培养基。

4. 细胞传代

1. 当细胞达到 80%-90% 汇合时，从培养箱中取出 100 mm 培养皿，丢弃用过的培养基，并用 2 mL PBS 冲洗培养皿 2 次。去除 PBS，然后将 2 mL 0.05% 胰蛋白酶添加到每个 100 mm 培养皿中。
   注意：旋转培养皿以确保胰蛋白酶溶液与培养皿底部充分接触。
2. 将 100 mm 培养皿置于 37 °C 培养箱中 ~7 分钟以进行消化过程。
3. 使用 40 倍物镜用显微镜检查细胞，以确保大多数细胞已从培养皿底部解离。
4. 加入 8 mL 中和溶液终止消化过程，并将细胞转移到 15 mL 试管中。通过上下吹打 10-15 次来混合细胞。将细胞以 156 × g 离心 5 分钟。
5. 小心去除上清液，用 10 mL 上皮细胞培养基重悬细胞，并计数细胞数。
6. 在 100 mm 培养皿的 10 mL 上皮细胞培养基中加入 1 ×^{10 6} 个细胞。
7. 刷新上皮细胞培养基并每 2 天观察一次细胞。

5. 细胞冻存

1. 重复步骤 4.1-4.4。
2. 小心去除上清液，并将细胞重悬于 2 mL 细胞冻存液中。
3. 将 1 mL 含有细胞的冻存溶液转移到每个冻存管中。
4. 记录冻存细胞的名称、传代编号和日期。
5. 将样品瓶置于 -80 °C 的受控速率冷冻容器中过夜。
6. 从 -80 °C 冰箱中取出冻存管，并迅速将其转移到液氮中进行长期储存。

结果

图 1 显示了该过程的示意图。该方案涉及使用酶的组合，即分散酶、胶原酶和胰蛋白酶。这种组合用于从其下方的成纤维细胞层分离上皮片，然后利用胰蛋白酶将乳腺上皮细胞解离成悬浮液。此外，在初始培养基中加入 Y-27632 可有效促进上皮细胞的生长。因此，该方法可产生大量 HMEC，平均只需 10 天即可满足传代要求。

为了测试 Y-27632 在分离后细胞生?...

讨论

HMEC 对于保持乳腺组织的解剖和功能完整性至关重要，它们在科学调查、临床实施和相关领域中非常有用¹⁵。原代上皮细胞是一种传代受限且寿命较短的特殊细胞。然而，HMEC 的增长受到技术限制的阻碍，从而阻碍了乳腺癌和其他与乳腺相关的炎症性疾病的研究进展¹⁶。

因此，迫切需要开发一种稳定、可行且高效的方法来从新鲜乳腺组织中获...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin	Basalmedia	K431010	For HMECs  dissociation
1.5 mL microcentrifuge Tubes	NEST	081722CK01	For cell digestion
100 µm mesh filter	Solarbio	431752	For HMECs filtration
100 mm Cell Culture Dish	Corning	430167	For cell culture
4% paraformaldehyde	solarbio	P1110-100ml	For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs
50 mL Centrifuge Tube	Corning	430829	For cell centrifugation
Cell Strainer	Solarbio	431752	Cell filtration
Centrifuge	Eppendorf	5404HN133048	Cell centrifuge
CO2 Incubator	Thermo Scientific	42820906	For cell incubation
Collagenase Type I	Merck	SKU:SCR103	For HMECs isolation
Dispase	Solarbio	CAS:42613-33-2	For HMECs isolation
DMEM	Gibco	8122622	Component of neutralization medium
Fetal Bovine Serum	Gibco	2556132P	Component of neutralization medium
Penicillin/Streptomycin	Thermo Scientific	15140-122	Antibiotics
Phosphate buffered solution	Tecono	20201033	Washing solution
rabbit anti CK7	abcam	ab68459	For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs
rabbit anti GATA3	abcam	ab199428	For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs
Y-27632	Solarbio	IY0040	ROCK inhibitor