初代ヒト乳腺上皮細胞の単離と培養

要約

本研究は、少量の乳腺組織から初代ヒト乳腺上皮細胞(HMEC)を効率的に分離し、増殖するための、より簡単で時間を節約し、経済的なプロトコルを報告しています。このプロトコールは、実験室および臨床アプリケーションの両方で一次HMECを迅速に製造するのに適しています。

要約

乳腺は乳房の基本的な構造であり、生殖に不可欠な役割を果たしています。乳がんをはじめとする乳房関連炎症性疾患の起源細胞であるヒト乳腺上皮細胞(HMEC)が大きな注目を集めています。しかし、研究目的での初代HMECのin vitro での単離と培養は、その高度に分化し、角質化した性質と短い寿命のために困難でした。したがって、HMECを分離して培養するためのシンプルで効率的な方法を開発することは、乳房生物学および乳房関連疾患の研究にとって大きな科学的価値があります。本研究では、Rho関連キナーゼ(ROCK)阻害剤Y-27632を含む5%ウシ胎児血清DMEMで初期培養を行い、酵素混合物と組み合わせた酵素混合物による消化により、少量の乳腺組織から初代HMECを単離し、続いて無血清ケラチノサイト培地で培養増殖することに成功しました。このアプローチは、上皮細胞の増殖を選択的に促進し、細胞収量を最適化します。この方法のシンプルさと利便性は、実験室研究と臨床研究の両方に適しており、これらの重要な研究分野について貴重な洞察を提供するはずです。

概要

乳がんは、世界中の女性に診断される主要ながんの種類であり、がんによる主な死因です¹。乳がんの病因は複雑で、遺伝学、環境、生活習慣など複数の要因が関与しています。HMECs(活性乳産生細胞)は、乳腺組織の最も重要な構成要素の1つであり、乳がんの発がんに関与する元の細胞である可能性が高いです。したがって、HMECは乳がんの研究で研究者から最も注目を集めています²。さらに、初代細胞は、遺伝的安定性、正常な形態、および不死化細胞株³では達成できない基本的な細胞機能のより完全なセットの保持により、複雑な細胞プロセスの生物学的に関連性のある特性評価を提供する能力を有する。したがって、初代HMECの単離と培養は、乳がんや乳房炎症性疾患などのほとんどの乳房関連疾患の研究に不可欠なステップです。

現在、ラット、ウシ、ブタ、およびヤギからの乳腺上皮細胞の単離、培養、および同定のための安定で再現性のある^{システムが確立されている}4,5,6,7。しかし、初代HMECの単離と培養は、複雑な微小環境と細胞の低収率のために困難です。何十年もの間、科学者たちはHMECを分離して培養するための最も効果的な方法を探してきましたが、HMECの培養システムは20年近く前に確立されました。例えば、Hammondらは、HMEC^{が効率的に増殖}する無血清培地を開発した8。最近、Zubeldia-Plazaolaらは、高速/低速酵素消化手順と逐次ろ過または示差遠心分離ステップを組み合わせて4つの異なる分離法を試験し、^HMEC9を取得しました。その結果、ゆっくりとした消化法と示差遠心分離が、新鮮な乳房組織からHMECを分離する最も効率的な方法であることを発見しました。ただし、この分離法では、大きな組織片(40〜75 g)が必要であり、大量の消化酵素を使用します。その手順は複雑で(異なる細胞画分を得るために少なくとも3つの異なる遠心分離を行う)、時間がかかる。したがって、研究および臨床応用のために少量の乳腺組織からHMECの集団を効率的に取得するには、簡単で迅速な方法が依然として必要です⁹。

我々の先行研究は、初期培地にRho関連キナーゼ(ROCK)阻害剤Y−27632を添加すると、ヒト皮膚表皮細胞¹⁰の単離プロセスを簡素化できることを示しており、これは歯肉上皮細胞¹¹の単離にも成功裏に使用されている。さらに、Zubeldia-PlazaolaのグループとJinのグループが実施した以前の研究では、Y-27632が乳腺組織に由来する初代上皮細胞の迅速かつ無制限のin vitro増殖を刺激する能力を有することが示されています^9,12。本研究は、Y-27632を用いることでHMECの単離と培養が容易になるかどうかを検討することを目的としており、乳組織の小片(1g)からHMECを簡便に分離する方法を確立することに成功しました。

プロトコル

このプロトコルで使用される新鮮な正常な乳腺組織は、浙江中医科大学の最初の付属病院の医療倫理委員会のガイドラインに従って、浙江中医科大学の最初の付属病院の難治性肉芽腫性小葉性乳房炎の病変の周りの手術から収集されます(プロトコル番号。ChiMCTR2100005281、日付:2017-07-17)。

1. ティッシュの採取

1. 成人女性から採取した手術標本から新鮮な乳腺組織を、10 mL のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) と 3% ペニシリン/ストレプトマイシン (P/S) を含む 滅菌チューブに採取します。
   注:乳腺組織は、手術からの収集後24時間以内に、次の詳細に従って取り扱う必要があります。

2.組織の前処理

1. 2対の鉗子で乳腺組織から脂肪組織を取り出し、残りの乳腺組織の重量が~1gであることを確認します。
2. 乳房組織を75%エタノール溶液(5 mL)で5秒間すすぎ、次に20 mLの洗浄液(表1)で2 x 5分間洗浄します。.

3.組織の消化

1. 乳腺組織を小さな断片にスライスし、2つの外科用ブレードを使用して組織を15分間細断して、組織ホモジネートを取得します。組織片を50 mLの遠心分離チューブに移します。
2. 10 mLの5.0 mg/mLディスパーゼ+5.0 mg/mLコラゲナーゼ溶液、3 mLの0.25%トリプシン、および7 mLのPBSを、乳腺組織断片を含む50 mLの遠心チューブに合計20 mLの消化溶液に加えます。チューブを37°Cのウォーターバスに入れ、1.5時間インキュベートします。チューブを20分ごとに振ってください。
3. 20mLの中和液を注入して消化プロセスを停止します。~15回ピペッティングして内容物を混合します。
4. 混合物を100μmメッシュフィルターでろ過します。156 × g で5分間遠心分離します。
5. 上清を取り除き、20 mLの中和溶液でペレットのインキュベーションを繰り返します。内容物を15倍ピペッティングして混合し、156 × g で5分間遠心分離します。
6. 上清を慎重に取り除き、細胞ペレットを10 mLの初期培養培地で再懸濁します。細胞懸濁液を100 mmの細胞培養皿に播種します。
7. 5% CO₂ インキュベーターで細胞を37°Cで培養します。 元の培地を3日ごとに新鮮な上皮細胞培地と交換します。細胞を確認し、2日ごとに培地を更新してください。

4. 細胞継代

1. 細胞が80%〜90%のコンフルエントに達したら、インキュベーターから100 mmディッシュを取り出し、使用済みの培地を廃棄し、2 mLのPBSでディッシュを2回すすいでください。PBSを取り出し、100 mmの各皿に2 mLの0.05%トリプシンを加えます。.
   注意: トリプシン溶液が皿の底に十分に接触していることを確認するために、皿を回転させます。
2. 100 mmディッシュを37°Cのインキュベーターに~7分間入れて、消化プロセスを行います。
3. 40倍対物レンズを使用して顕微鏡で細胞を検査し、ほとんどの細胞が皿の底から解離していることを確認します。
4. 8 mLの中和溶液を加えて消化プロセスを停止し、細胞を15 mLチューブに移します。ピペッティングで10〜15倍に動かして細胞を混合します。細胞を156 × g で5分間遠心分離します。
5. 上清を慎重に取り除き、10mLの上皮細胞培地で細胞を再懸濁し、細胞数を数えます。
6. 100 mmディッシュ中の10 mLの上皮細胞培地に1 × 10^{6細胞を加え} ます。
7. 上皮細胞培地をリフレッシュし、2日ごとに細胞を観察します。

5. 細胞凍結保存

1. 手順4.1〜4.4を繰り返します。
2. 上清を慎重に取り除き、細胞を2 mLの細胞凍結保存溶液に再懸濁します。
3. 細胞を含む凍結保存溶液1 mLを各極低温バイアルに移します。
4. 凍結保存された細胞の名前、継代番号、および日付を記録します。
5. バイアルを制御速度の凍結容器に-80°Cで一晩置きます。
6. -80°Cの冷凍庫から極低温バイアルを取り出し、液体窒素にすばやく移して長期保存します。

結果

図 1 に、この手順の概略を示します。このプロトコルには、酵素の組み合わせ、すなわち、ディスパーゼ、コラゲナーゼ、およびトリプシンの使用が含まれます。この組み合わせは、上皮シートをその下の線維芽細胞層から剥離し、続いてトリプシンを利用して乳腺上皮細胞を懸濁液に解離させる目的で利用されます。また、初期培地にY-27632を添加することにより、上...

ディスカッション

HMECは、乳腺組織の解剖学的および機能的完全性を維持するのに不可欠であり、科学的調査、臨床実施、および関連ドメイン¹⁵に有用です。初代上皮細胞は、継代が限られ、寿命が短い特殊な細胞の一種です。しかし、HMECの成長は技術的な制約によって妨げられており、その結果、乳がんや乳房に関連する他の炎症性疾患の研究の進歩が妨げられてきました¹⁶

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin	Basalmedia	K431010	For HMECs  dissociation
1.5 mL microcentrifuge Tubes	NEST	081722CK01	For cell digestion
100 µm mesh filter	Solarbio	431752	For HMECs filtration
100 mm Cell Culture Dish	Corning	430167	For cell culture
4% paraformaldehyde	solarbio	P1110-100ml	For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs
50 mL Centrifuge Tube	Corning	430829	For cell centrifugation
Cell Strainer	Solarbio	431752	Cell filtration
Centrifuge	Eppendorf	5404HN133048	Cell centrifuge
CO2 Incubator	Thermo Scientific	42820906	For cell incubation
Collagenase Type I	Merck	SKU:SCR103	For HMECs isolation
Dispase	Solarbio	CAS:42613-33-2	For HMECs isolation
DMEM	Gibco	8122622	Component of neutralization medium
Fetal Bovine Serum	Gibco	2556132P	Component of neutralization medium
Penicillin/Streptomycin	Thermo Scientific	15140-122	Antibiotics
Phosphate buffered solution	Tecono	20201033	Washing solution
rabbit anti CK7	abcam	ab68459	For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs
rabbit anti GATA3	abcam	ab199428	For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs
Y-27632	Solarbio	IY0040	ROCK inhibitor