בידוד ותרבית של תאי אפיתל ראשוניים של חלב אנושי

Summary

המחקר הנוכחי מדווח על פרוטוקול קל יותר, חוסך זמן וחסכוני לבידוד וגידול יעיל של תאי אפיתל חלב אנושיים ראשוניים (HMECs) מכמויות קטנות של רקמת חלב. פרוטוקול זה מתאים לייצור מהיר של HMECs ראשוניים הן ליישומים מעבדתיים והן ליישומים קליניים.

Abstract

בלוטת החלב היא מבנה בסיסי של השד וממלאת תפקיד חיוני ברבייה. תאי אפיתל חלב אנושיים (HMECs), שהם תאי המקור של סרטן השד ומחלות דלקתיות אחרות הקשורות לשד, זכו לתשומת לב רבה. עם זאת, בידוד וטיפוח של HMECs ראשוניים במבחנה למטרות מחקר היה מאתגר בשל אופיים המובחן והקרטיני ותוחלת החיים הקצרה שלהם. לכן, פיתוח שיטה פשוטה ויעילה לבידוד ותרבית של קופות חולים הוא בעל ערך מדעי רב לחקר ביולוגיה של השד ומחלות הקשורות לשד. במחקר זה, בודדנו בהצלחה HMECs ראשוניים מכמויות קטנות של רקמת חלב על ידי עיכול עם תערובת של אנזימים בשילוב עם תרבית ראשונית בסרום בקר עוברי 5% DMEM המכיל מעכב קינאז הקשור לרו (ROCK) Y-27632, ולאחר מכן הרחבת תרבית בתווך קרטינוציטים ללא סרום. גישה זו מקדמת באופן סלקטיבי את הצמיחה של תאי אפיתל, וכתוצאה מכך תפוקת תאים אופטימלית. הפשטות והנוחות של שיטה זו הופכות אותה למתאימה הן למחקר מעבדה והן למחקר קליני, אשר אמור לספק תובנות חשובות בתחומי מחקר חשובים אלה.

Introduction

סרטן השד הוא סוג הסרטן העיקרי המאובחן אצל נשים ברחבי העולם והוא הגורם העיקרי למוות מסרטן¹. הפתוגנזה של סרטן השד היא מורכבת, וכוללת גורמים רבים כגון גנטיקה, סביבה ואורח חיים. HMECs, תאים פעילים מייצרי חלב, הם אחד המרכיבים החשובים ביותר של רקמת החלב וככל הנראה הם התאים המקוריים המעורבים בקרצינוגנזה של סרטן השד. לכן, HMECs קיבלו את מירב תשומת הלב מהחוקרים לחקר סרטן השד². יתר על כן, לתאים ראשוניים יש את היכולת לספק אפיון רלוונטי ביולוגית של תהליכים תאיים מורכבים בשל אגירתם של יציבות גנטית, מורפולוגיה נורמלית, ומערך שלם יותר של תפקודים תאיים בסיסיים שלא ניתן להשיג עם קווי תאים אימורטליים³. לפיכך, הבידוד והתרבות של קופות חולים ראשוניות הוא צעד חיוני לחקר רוב המחלות הקשורות לשד כגון סרטן השד ומחלות דלקתיות בשד.

כיום, מערכת יציבה וניתנת לשחזור לבידוד, תרבית וזיהוי של תאי אפיתל חלב מחולדות, פרות, חזירים ועזים הוקמה 4,5,6,7. עם זאת, הבידוד והתרבית של HMECs ראשוניים הם מאתגרים בשל המיקרו-סביבה המורכבת והתנובה הנמוכה של תאים. במשך עשרות שנים, מדענים חיפשו את השיטה היעילה ביותר לבודד ולטפח HMECs למרות מערכת תרבות עבור HMECs הוקמה לפני כמעט 20 שנה. לדוגמה, האמונד ועמיתיו פיתחו מדיום תרבית ללא סרום שבו HMECs גדלו ביעילות⁸. לאחרונה, Zubeldia-Plazaola et al. בדקו ארבע שיטות בידוד שונות באמצעות הליכי עיכול אנזימים מהירים/איטיים בשילוב עם סינון רציף או שלבי צנטריפוגה דיפרנציאליים כדי להשיג HMECs⁹. הם מצאו כי שיטת העיכול האיטי יחד עם צנטריפוגה דיפרנציאלית היא השיטה היעילה ביותר לבודד HMECs מרקמת שד טרייה. עם זאת, שיטת בידוד זו דורשת חתיכות גדולות של רקמה (40-75 גרם) ומשתמשת בכמויות גדולות יותר של אנזימי עיכול. ההליך שלהם מסובך (לפחות שלוש צנטריפוגות שונות כדי להשיג שברי תאים שונים), כמו גם זמן רב. לכן, עדיין נדרשת שיטה פשוטה ומהירה כדי להשיג ביעילות אוכלוסיות של HMECs מכמויות קטנות של רקמת חלב למחקר וליישומים קליניים⁹.

המחקרים הקודמים שלנו הראו כי הוספת מעכב קינאז הקשור ל-Rho (ROCK) Y-27632 למדיום התרבית הראשוני יכולה לפשט את תהליך בידוד תאי האפידרמיס של העור האנושי¹⁰, אשר שימש בהצלחה גם לבידוד תאי אפיתל חניכיים¹¹. בנוסף, מחקר קודם שנערך על ידי הקבוצה של Zubeldia-Plazaola והקבוצה של ג'ין הצביע על כך של- Y-27632 יש את היכולת לעורר צמיחה מהירה ובלתי מוגבלת במבחנה של תאי אפיתל ראשוניים שמקורם ברקמת החלב ^9,12. המחקר הנוכחי נועד לבדוק אם שימוש ב-Y-27632 יפשט את הבידוד והתרבות של HMECs והצלחנו לבסס שיטה פשוטה וקלה לביצוע לבידוד HMECs מחתיכות קטנות (1 גרם) של רקמת החלב.

Protocol

רקמות חלב נורמליות טריות המשמשות בפרוטוקול זה נאספות מניתוח סביב הנגע של דלקת שד לובולרית גרנולומטית עקשנית בבית החולים המסונף הראשון של האוניברסיטה הרפואית הסינית ג'ג'יאנג על פי הנחיות ועדת האתיקה הרפואית של בית החולים המסונף הראשון של האוניברסיטה הרפואית הסינית ג'ג'יאנג (פרוטוקול מס '. ChiMCTR2100005281, תאריך: 2017-07-17).

1. רכישת רקמות

1. איסוף רקמות חלב טריות מדגימות כירורגיות שנלקחו מנשים בוגרות לתוך צינורות סטריליים המכילים 10 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) עם 3% פניצילין/סטרפטומיצין (P/S).
   הערה: יש לטפל ברקמות החלב על פי הפרטים הבאים תוך 24 שעות לאחר האיסוף מהניתוח.

2. טיפול מקדים ברקמה

1. הסר את רקמת השומן מרקמת החלב עם שני זוגות של מלקחיים, להבטיח כי רקמת החלב הנותרת היא ~ 1 גרם במשקל.
2. שטפו את רקמת החלב בתמיסת אתנול 75% (5 מ"ל) במשך 5 שניות ולאחר מכן שטפו עם 20 מ"ל של תמיסת כביסה (טבלה 1) במשך 2 x 5 דקות.

3. עיכול של רקמות

1. פורסים את רקמת החלב לשברים קטנים יותר, גורסים את הרקמה באמצעות שני להבים כירורגיים למשך 15 דקות כדי לקבל את הרקמה הומוגנית. מעבירים את חתיכות הרקמה לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל.
2. הוסף 10 מ"ל של 5.0 מ"ג / מ"ל dispase + 5.0 מ"ג / מ"ל תמיסת collagenase, 3 מ"ל של 0.25% טריפסין, ו 7 מ"ל של PBS לסך של 20 מ"ל של תמיסת עיכול בצינור צנטריפוגה 50 מ"ל המכיל את שברי רקמת החלב. מניחים את הצינור באמבט מים ב 37 °C (77 °F) ולדגור במשך 1.5 שעות; נערו את הצינור כל 20 דקות.
3. עצור את תהליך העיכול על ידי הזרקת 20 מ"ל של תמיסה מנטרלת. מערבבים את התוכן על ידי pipetting ~ 15x.
4. סננו את התערובת דרך מסנן רשת שינוי בגודל 100 מיקרומטר. צנטריפוגה ב 156 × גרם במשך 5 דקות.
5. מוציאים את הסופרנאטנט וחוזרים על הדגירה של הגלולה עם 20 מ"ל של תמיסה מנטרלת. מערבבים את התכולה על ידי פיפטינג 15x וצנטריפוגה ב 156 × גרם במשך 5 דקות.
6. הסר את supernatant בזהירות להשעות מחדש את גלולת התא עם 10 מ"ל של מדיום תרבית ראשונית. לוחים את תרחיף התא בצלחת תרבית תאים בקוטר 100 מ"מ.
7. לטפח את התאים באינקובטור 5% CO₂ ב 37 ° C. החליפו את מדיום התרבית המקורי בתווך תאי אפיתל טריים כל שלושה ימים. בדוק את התאים ורענן את המדיום כל יומיים.

4. מעבר תאים

1. הסר את צלחת 100 מ"מ מן האינקובטור כאשר התאים מגיעים 80%-90% מפגש, להשליך את המדיום משומש, ולשטוף את צלחת 2x עם 2 מ"ל של PBS. הסר PBS ולאחר מכן הוסף 2 מ"ל של 0.05% טריפסין לכל צלחת 100 מ"מ.
   הערה: מערבלים את התבשיל כדי לוודא שתמיסת הטריפסין באה במגע מספיק עם תחתית המנה.
2. מניחים את צלחת 100 מ"מ באינקובטור 37 מעלות צלזיוס למשך ~7 דקות לתהליך העיכול.
3. בחנו את התאים במיקרוסקופ באמצעות מטרה של פי 40 כדי לוודא שרוב התאים נותקו מתחתית הצלחת.
4. עצור את תהליך העיכול על ידי הוספת 8 מ"ל של תמיסה מנטרלת ולהעביר את התאים לצינור 15 מ"ל. מערבבים את התאים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 10-15x. צנטריפוגה את התאים ב 156 × גרם במשך 5 דקות.
5. הסר את supernatant בזהירות, resuspend את התאים עם 10 מ"ל של תווך תא אפיתל, ולספור את מספר התאים.
6. הוסף 1 × 10⁶ תאים ב 10 מ"ל של תא אפיתל בינוני בצלחת 100 מ"מ.
7. רענן את תווך תא האפיתל והתבונן בתאים כל יומיים.

5. שימור תאים בהקפאה

1. חזור על שלבים 4.1-4.4.
2. הסר את supernatant בזהירות להשעות מחדש את התאים ב 2 מ"ל של תמיסת שימור הקפאה התא.
3. העבירו 1 מ"ל של תמיסת ההקפאה המכילה את התאים לכל בקבוקון קריוגני.
4. רשום את שמות התאים השמורים, את מספרי המעבר ואת התאריכים.
5. הניחו את הבקבוקונים במיכל הקפאה בקצב מבוקר בטמפרטורה של -80°C למשך הלילה.
6. הוציאו את הבקבוקונים הקריוגניים מהמקפיא בטמפרטורה של -80°C והעבירו אותם במהירות לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.

תוצאות

איור 1 מציג סכמה של ההליך. הפרוטוקול כולל שימוש בשילוב של אנזימים, כלומר דיספאז, קולגנאז וטריפסין. שילוב זה מנוצל לצורך ניתוק יריעת האפיתל משכבת הפיברובלסטים שמתחתיה ולאחר מכן שימוש בטריפסין לניתוק תאי אפיתל החלב לתרחיף. בנוסף, הצמיחה של תאי אפיתל קודמה ביעילות על ידי הוספ?...

Discussion

HMECs חיוניים לשמירה על השלמות האנטומית והתפקודית של רקמת החלב והם שימושיים בחקירות מדעיות, יישומים קליניים ותחומים קשורים¹⁵. תאי אפיתל ראשוניים הם סוג של תאים מיוחדים בעלי מעברים מוגבלים ותוחלת חיים קצרה יותר. עם זאת, הצמיחה של HMECs עוכבה על ידי אילוצים טכניים, אשר כתוצאה מכך עיכ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin	Basalmedia	K431010	For HMECs  dissociation
1.5 mL microcentrifuge Tubes	NEST	081722CK01	For cell digestion
100 µm mesh filter	Solarbio	431752	For HMECs filtration
100 mm Cell Culture Dish	Corning	430167	For cell culture
4% paraformaldehyde	solarbio	P1110-100ml	For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs
50 mL Centrifuge Tube	Corning	430829	For cell centrifugation
Cell Strainer	Solarbio	431752	Cell filtration
Centrifuge	Eppendorf	5404HN133048	Cell centrifuge
CO2 Incubator	Thermo Scientific	42820906	For cell incubation
Collagenase Type I	Merck	SKU:SCR103	For HMECs isolation
Dispase	Solarbio	CAS:42613-33-2	For HMECs isolation
DMEM	Gibco	8122622	Component of neutralization medium
Fetal Bovine Serum	Gibco	2556132P	Component of neutralization medium
Penicillin/Streptomycin	Thermo Scientific	15140-122	Antibiotics
Phosphate buffered solution	Tecono	20201033	Washing solution
rabbit anti CK7	abcam	ab68459	For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs
rabbit anti GATA3	abcam	ab199428	For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs
Y-27632	Solarbio	IY0040	ROCK inhibitor