基于生物杂化蚊虫叮咬的原子力显微镜探针的研制

摘要

对昆虫叮咬行为进行定量和受控调查对于制定有效的策略来对抗病媒传播疾病至关重要。在此背景下，介绍了一种制备生物杂化原子力显微镜（AFM）探针的方法。

摘要

蚊子因其传播疾病的能力而臭名昭著，是对人类最致命的动物，对公共卫生构成持续挑战。目前使用的一级预防策略涉及化学驱虫剂，由于蚊子迅速产生抗药性，化学驱虫剂往往被证明是无效的。因此，发明新的预防方法至关重要。这种发展取决于对蚊子叮咬行为的透彻理解，因此需要一种实验装置，该实验装置能够通过可控的测试参数和定量测量准确复制实际叮咬场景。为了弥合这一差距，设计了一种生物混合原子力显微镜（AFM）探针，其尖端是生物毒刺 - 特别是蚊子盂唇。这种生物混合探针与标准AFM系统兼容，可以对蚊子的渗透行为进行近乎真实的模拟。这种方法标志着在叮咬机制的定量研究方面向前迈出了一步，有可能为对抗病媒传播疾病（VBDs）建立有效的屏障，并为对抗蚊媒传播疾病开辟新的途径。

引言

世界卫生组织 （WHO） 报告说，病媒传播疾病 （VBD） 占所有传染病的 17% 以上，每年导致全球超过 7,00,000 人死亡。例如，作为世界上最致命的动物，蚊子通过吸血节肢动物传播登革热、疟疾和寨卡病毒等多种病原体，每年导致 7 亿例感染¹。探索制定有效措施预防VBDs至关重要，包括模仿蚊子的侵入行为以研究其叮咬机制，以及研究潜在障碍以证明其预防侵入的有效性。一个关键的挑战是制定适当的方法来进行这种调查。在文献中已经做出了努力，包括开发类似于蚊子毒刺几何形状的微尺度针头;然而，许多用于制造这些微针的材料（即粘弹性材料²、硅 （Si）、玻璃、陶瓷³ 等）与蚊子长鼻的生物材料具有不同的机械性能。工程材料可能很脆，容易断裂和屈曲 ^3,4，^而蚊子的长鼻可以更好地承受断裂或屈曲⁴.使用蚊子的盂唇而不是工程材料的生物混合探针的好处是，它可以更准确地表示蚊子的穿刺机制。此外，必须将专用工具与微针集成以执行定量研究，例如力⁵ 的准确测量，这对于使用工程微针的定制设置来说不容易实现。

基于原子力显微镜 （AFM） 的方法很有前途的，因....

研究方案

用于该方案的蚊子种类是未感染的成年雌性 埃及伊蚊 （A. aegypti），冷冻接收并储存在-20°C度的冰箱中。该物种由NIH/NIAID丝虫病研究试剂资源中心提供，通过BEI Resources，NIAID，NIH分发：未感染的 埃及伊蚊，菌株黑眼利物浦（冷冻），NR-48920。用于研究的试剂和设备列在 材料表中。

1. 从长鼻中解剖唇

1. 使用镊子，将死蚊子放在显微镜下的载玻片上，并确保在长鼻的末端有一个锥形的尖端（图2A）。
2. 在将蚊子保持在载玻片上的同时，将手术刀刀片轻轻地放在蚊子头部附近的阴唇上（图2B）。
3. 继续在阴唇的整个上半部分（约 80 μm 的切口）做一个切口，在阴唇厚度上有一个较浅的穿透深度。确保对刀片施加轻微的压力，以便只切开阴唇，而不切开位于下方的束。
4. 用一把镊子牢牢握住蚊子的头部，然后用另一把精密镊子轻轻捏住锥形尖端和切口位置之间的任何位置的阴唇（图2B）。
   1. 将夹住唇的镊子拉向锥形尖端的方向（图2C）。继....

讨论

该协议的第 1 步旨在清洁不需要的阴唇的生物样本。为了实现这一点，在阴唇上做一个切口，但不在位于阴唇正下方的束上做一个切口（图1）。由于束和唇在其界面处没有连接在一起（即，唇可以沿着束自由滑动，并且仅通过其附着在蚊子头上保持到位），因此进行的切口旨在将唇的一部分与蚊子的头部分开，从而促进外罩的移除。当唇形物从样品中拉出时，技术人员应该.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-SA-SE Straight Tapered Ultra Fine-Pointed Tweezers	Excelta	N/A	For manipulating/dissecting the proboscis.
C-4D Probe station	Everbeing Int’l Corp	N/A	Used for AFM assembly.
Tipless Tapping Mode Cantilever	NanoAndMore USA	TL-NCH	AFM cantilever used for mounting the labrum. Specs are shown here: Shape: Beam Force Constant: 42 N/m (10 - 130 N/m) Resonance Frequency: 330 kHz (204 - 497 kHz) Length: 125 µm (115 - 135 µm) Width: 30 µm (22.5 - 37.5 µm) Thickness: 4 µm ( 3 - 5 µm)
UV Expoxy	Let's resin	ALR00146	For stinger attachment.