Développement d’une sonde de microscopie à force atomique basée sur un dard bio-hybride Mosquito Stinger

Résumé

Des études quantitatives et contrôlées sur les comportements des insectes piqueurs sont cruciales pour concevoir des stratégies efficaces de lutte contre les maladies à transmission vectorielle. Dans ce contexte, une méthode de fabrication d’une sonde de microscopie à force atomique (AFM) bio-hybride est introduite.

Résumé

Les moustiques, connus pour être les animaux les plus meurtriers pour l’homme en raison de leur capacité à transmettre des maladies, posent un défi persistant à la santé publique. La stratégie de prévention primaire actuellement utilisée implique des répulsifs chimiques, qui s’avèrent souvent inefficaces car les moustiques développent rapidement une résistance. Par conséquent, l’invention de nouvelles méthodes préventives est cruciale. Un tel développement repose sur une compréhension approfondie des comportements de piqûre de moustique, ce qui nécessite une configuration expérimentale qui reproduit avec précision des scénarios de piqûre réels avec des paramètres de test contrôlables et des mesures quantitatives. Pour combler cette lacune, une sonde de microscopie à force atomique (AFM) bio-hybride a été conçue, avec un dard biologique - plus précisément, un labrum de moustique - comme pointe. Cette sonde bio-hybride, compatible avec les systèmes AFM standard, permet une simulation quasi authentique des comportements de pénétration des moustiques. Cette méthode marque une avancée dans l’étude quantitative des mécanismes de piqûre, conduisant potentiellement à la création de barrières efficaces contre les maladies à transmission vectorielle (MTV) et ouvrant de nouvelles voies dans la lutte contre les maladies transmises par les moustiques.

Introduction

L’Organisation mondiale de la santé (OMS) a indiqué que les maladies à transmission vectorielle (MTV) représentent plus de 17 % de toutes les maladies infectieuses, qui causent plus de 7 000 000 décès par an dans le monde. Par exemple, en tant qu’animal le plus mortel au monde, les moustiques propagent de nombreux agents pathogènes, tels que la dengue, le paludisme et le Zika, par l’intermédiaire d’arthropodes hématophages, entraînant 700 millions d’infections chaque année¹. Les explorations vers le développement de mesures efficaces pour prévenir les VBD sont d’une importance cruciale, y compris l’imitation des comportements de pénétration des moustiques pour étudier leurs mécanismes de piqûre et l’étude des barrières potentielles pour prouver leur efficacité dans la prévention de la pénétration. L’un des principaux défis consiste à élaborer des approches appropriées pour mener de telles enquêtes. Des efforts ont été faits dans la littérature, notamment la mise au point d’aiguilles à micro-échelle qui ressemblent à la géométrie d’un dard de moustique ; Cependant, de nombreux matériaux utilisés pour fabriquer ces micro-aiguilles (c’est-à-dire les matériaux viscoélastiques², le silicium (Si), le verre, la céramique³, etc.) ont des propriétés mécaniques différentes de la matière biologique de la trompe du moustique. Les matériaux d’ingénierie peuvent être cassants et sujets à la fracture et au flambage ^3,4, tandis que la trompe du moustique peut mieux résister à la fracture ou au flambage⁴. L’avantage d’avoir une sonde bio-hybride utilisant le labrum d’un moustique au lieu de matériaux d’ingénierie est qu’elle peut être une représentation plus précise du mécanisme de perçage des moustiques. De plus, des outils spécialisés doivent être intégrés avec des micro-aiguilles pour effectuer des études quantitatives, telles que la mesure précise de la force⁵, ce qui n’est pas facilement réalisable avec des configurations personnalisées utilisant des micro-aiguilles modifiées.

L’approche basée sur la microscopie à force atomique (AFM) est prometteuse en ce sens qu’elle fonctionne en utilisant un porte-à-faux avec une pointe ultra-fine qui est soigneusement positionnée près de la surface d’un échantillon. La pointe peut soit balayer ou être pressée vers/vers une surface, subissant des forces d’attraction ou de répulsion variables en raison de ses interactions avec un échantillon⁶. Ces interactions conduisent à la déviation du porte-à-faux, qui est suivie par la réflexion d’un faisceau laser du haut du porte-à-faux sur un photodétecteur⁶. La sensibilité exceptionnelle au mouvement du système permet à AFM d’effectuer une gamme variée de mesures, y compris, mais sans s’y limiter, la cartographie morphologique avec une précision du picomètre, les mesures de force allant du piconewton au micronewton, et des études multiphysiques complètes⁷. Par exemple, des indentations AFM peuvent être effectuées pour évaluer avec précision la réponse à la force appliquée d’un échantillon et également pour mesurer la dureté, l’élasticité et d’autres propriétés mécaniques d’un échantillon en les couplant à des modèles analytiques appropriés⁸. La sonde de l’AFM est le plus souvent en silicium (Si) ou en nitrure de silicium (Si₃, N_{, 4})⁸ , d’une longueur de 20 à 300 μm⁹ et d’un rayon de pointe de l’ordre de plusieurs à quelques dizaines de nanomètres¹⁰. Le rayon de pointe à l’échelle nanométrique peut être idéal pour des applications telles que l’imagerie haute résolution ; Cependant, il ne possède pas les caractéristiques des dards biologiques pour les études qui tentent d’imiter les comportements de pénétration en termes de rigidité, de rayon, de forme et de rapport d’aspect. Par exemple, la structure de la micro-aiguille d’un moustique est le fascicule, qui a un rapport d’aspect de ~60¹¹ (longueur ~1,5 mm à 2 mm ; diamètre ~30 μm)¹². Bien que l’on puisse supposer qu’une sonde AFM conventionnelle ressemble à un dard biologique comme un labrum, ses propriétés et ses dimensions distinctes ne reflètent pas la situation réelle lors d’une morsure.

Pour permettre des études quantitatives des comportements de pénétration imitant les morsures biologiques d’insectes ou d’autres animaux avec des dards, ici, un processus de fabrication de cantilevers AFM bio-hybrides avec un dard biologique comme pointe est développé. À titre d’étude de cas, un cantilever AFM avec l’extrémité d’un labrum de moustique attaché a été démontré avec succès. En exploitant les informations existantes de la littérature sur les forces d’insertion typiques qu’un moustique utilise pour percer la peau d’une victime^12,13, ce cantilever bio-hybride de la MFA peut potentiellement permettre un mimétisme presque réel des piqûres de moustiques dans le cadre d’une MFA régulière. Le protocole d’exploitation des dards microbiologiques pour fabriquer des cantilevers AFM bio-hybrides peut également être appliqué au développement d’autres cantilevers AFM biohybrides à base de dards tranchants pour des études quantitatives d’une variété de mécanismes de morsure.

Terminologies
Un schéma d’une trompe et de ses composants d’intérêt est présenté à la figure 1, et leurs définitions sont les suivantes : (1) Trompe : une partie du corps de la bouche d’un moustique qui permet au moustique de se nourrir, avec une structure noyau-coquille composée du fascicule (noyau) et du labium (coquille), (2) Labium : la couverture externe sombre et émoussée d’un proboscis², (3) Fascicule : un groupe d’aiguilles minces contenues à l’intérieur du labium, y compris deux maxillaires, deux mandibules, un hypopharynx et un labrum², (4) Hypopharynx : responsable de la sécrétion de salive dans la circulation sanguine de l’hôte², (5) Maxillaire : membre dentelé aidant au mécanisme d’alimentation², (5) Mandibules : semblables au maxillaire, ils aident le moustique dans le mécanisme d’alimentation et ont une pointe pointue², (6) Labrum : le principal membre pour pénétrer la peau d’une victime, qui est beaucoup plus grand que les maxillaires, les mandibules et l’hypopharynx. Il possède également des structures sensorielles qui lui permettent de trouver des vaisseaux sanguins et des canaux internes sous la peau², (7) Manipulateur : un ensemble avec trois degrés de liberté et une précision à l’échelle du micron pour le positionnement, permettant un mouvement dans les directions XYZ, (8) Ensemble de pince : une pince en 2 parties sur mesure montée sur le manipulateur utilisé pour serrer le porte-à-faux AFM sans pointe pendant l’expérience.

Protocole

L’espèce de moustique utilisée pour ce protocole est une femelle adulte non infectée Aedes aegypti (A. aegypti), congelée et conservée dans un congélateur à -20 °C. L’espèce a été fournie par le NIH/NIAID Filariasis Research Reagent Resource Center pour distribution par BEI Resources, NIAID, NIH : Uninfected Aedes aegypti, Strain Black Eye Liverpool (Frozen), NR-48920. Les réactifs et l’équipement utilisés pour l’étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Dissection du labium du proboscis

1. À l’aide d’une pince à épiler, placez un moustique mort sur une lame de verre sous le microscope et assurez-vous qu’il y a une pointe effilée à l’extrémité de la trompe (figure 2A).
2. Tout en maintenant le moustique sur la lame de verre, placez doucement une lame de scalpel sur le labium près de la tête du moustique (Figure 2B).
3. Procéder à une incision sur toute la moitié supérieure du labium (une coupe d’environ 80 μm) avec une faible profondeur de pénétration à travers l’épaisseur du labium. Assurez-vous d’appliquer une légère pression sur la lame afin de ne couper que le labium mais pas le fascicule qui se trouve en dessous.
4. À l’aide d’une pince à épiler, tenez fermement la tête du moustique et, à l’aide d’une autre pince à épiler de précision, pincez légèrement le labium à n’importe quelle position entre la pointe effilée et l’emplacement de l’incision (figure 2B).
   1. Tirez sur la pince à épiler qui maintient le labium dans la direction de la pointe effilée (Figure 2C). Continuez à tirer sur la pince à épiler jusqu’à ce que le labium se soit déchiré et ait été entièrement retiré du fascicule.
5. Placez le moustique sous le microscope et vérifiez si l’extrémité du labrum est présente. Cela peut être identifié par la présence d’une pointe effilée sur le faisceau (Figure 2D).

2. Séparer l’extrémité du labrum des autres membres du fascicule

1. Serrez et fermez les pointes d’une pince à épiler de précision et placez la pointe de la pince à épiler juste à côté du labrum près de sa pointe.
2. À l’aide de la pointe de la pince à épiler, appliquez une légère force sur le labrum dans la direction perpendiculaire à la longueur du faisceau (Figure 3A).
3. Continuez à pousser le labrum sur la lame de verre jusqu’à ce que la séparation du labrum des autres membres du fascicule soit réalisée.
4. Inspectez l’échantillon au microscope pour vérifier que la séparation entre le labrum et les autres membres du fascicule a été obtenue (Figure 3, à gauche). Si la séparation échoue, reportez-vous à l’étape 2.1.

3. Couper l’extrémité du labrum

1. Pendant que le labrum est encore sur la lame de verre, placez une lame de scalpel sur le labrum à une distance d’environ ~200 μm de l’extrémité du labrum (Figure 4A). Appliquez doucement une pression suffisante et coupez l’extrémité du labrum de part en part. Alors que l’extrémité du labrum doit idéalement être aussi courte que possible, ~200 μm est le meilleur que l’approche actuelle peut gérer.
2. Mesurez la longueur du labrum coupé pour vous assurer qu’il ne dépasse pas 300 μm (Figure 4B) à l’aide d’un logiciel de mesure numérique. Dans ce protocole, ImageJ a été utilisé¹⁴.

4. Saisir l’extrémité du labrum

1. À l’aide d’une pince à épiler de précision, localisez et isolez l’extrémité du labrum sur la lame de verre. Jetez toutes les parties restantes sur la lame de verre, à l’exception de l’extrémité du labrum.
2. Avec la même pince à épiler de précision, pincez lentement et légèrement le labrum afin que l’extrémité coupée soit libre et non obstruée par la pince à épiler. Assurez-vous également que l’orientation du labrum est parallèle à la direction de la longueur de la pince à épiler et que l’extrémité coupée du labrum pointe à l’opposé du corps de la pince à épiler.
3. Une fois l’échantillon fermement pincé, retirez la force de serrage qui maintient les pointes de la pince ensemble. La pointe du labrum collera à l’une des pointes de la pince à épiler.
4. À l’aide d’un microscope, inspectez les pointes de la pince à épiler et assurez-vous que l’extrémité du labrum est présente sur l’une des pointes de la pince à épiler (figure 5). Si l’extrémité du labrum n’est pas sur la pince à épiler, reportez-vous à l’étape 4.2, et si l’extrémité du labrum n’est pas sur la pince à épiler ni sur la lame de verre, reportez-vous à l’étape 1.

5. Application d’époxy sur la poutre en porte-à-faux sans pointe

1. Placez une goutte (~0,05 ml) d’époxy sur le bord d’une nouvelle lame de verre en coulant directement l’adhésif à partir de sa bouteille ou de son contenant d’origine. Placez la lame en verre contenant de l’époxy sous la station de sonde et concentrez-vous dessus.
2. Montez le porte-à-faux AFM sans pointe sur l’ensemble de serrage en fixant la base (c’est-à-dire l’extrémité la plus grande), en laissant l’extrémité du porte-à-faux libre et suspendue dans l’espace. Assurez-vous que le bas du porte-à-faux AFM est orienté vers le bas.
3. Montez le manipulateur sur la station de palpage.
4. Soulevez l’axe Z du manipulateur jusqu’à ce que le porte-à-faux sans pointe se trouve à quelques millimètres au-dessus de la lame de verre contenant de l’époxy.
5. Déplacez manuellement le manipulateur de manière à ce que le porte-à-faux sans pointe soit visible dans la vue de terrain de la caméra sur la station de sonde.
6. À l’aide du manipulateur, déplacez le cantilever AFM dans les directions X et Y jusqu’à ce que la pointe du cantilever repose directement au-dessus de l’époxy sur le bord de la lame de verre.
7. À l’aide du manipulateur, abaissez lentement le porte-à-faux sans pointe dans la direction Z sur le bord de la glissière en verre.
8. Lorsque le cantilever est abaissé et s’approche de la glissière en verre, continuez à abaisser le cantilever très lentement jusqu’à ce qu’il touche pour la première fois l’époxy. N’abaissez pas davantage le porte-à-faux.
9. Avec précaution, engagez le manipulateur pour déplacer lentement le porte-à-faux dans la direction X ou Y et retirez le porte-à-faux de la flaque d’époxy en déplaçant continuellement le porte-à-faux dans la direction sélectionnée jusqu’à ce que le porte-à-faux soit entièrement séparé de l’époxy sur la glissière de verre. Le porte-à-faux sans pointe doit avoir une bulle miniature d’époxy à son extrémité, visible sous la station de sonde.
10. Soulevez le porte-à-faux dans la direction Z à l’aide du manipulateur.

6. Collage de l’extrémité du labrum à la poutre en porte-à-faux sans pointe

1. Faites pivoter le manipulateur autour de l’axe long du porte-à-faux de 90 degrés et posez le manipulateur sur la station de sonde sur son côté. Dans cette configuration, les épaisseurs sur toute la longueur du porte-à-faux AFM sont dans le sens vertical.
2. Placez la pince à épiler de précision qui contient l’extrémité du labrum sous la caméra de la station de sonde de sorte que toute la longueur de l’extrémité du labrum soit visible sur l’écran de l’ordinateur.
3. Positionnez l’ensemble manipulateur qui maintient la pince et le porte-à-faux sans pointe sous la caméra de la station de sonde de sorte que toute la longueur du porte-à-faux sans pointe soit visible sur l’écran de l’ordinateur.
4. Focalisez le microscope de la station de sonde sur l’extrémité du labrum et le cantilever sans pointe.
5. Orientez le porte-à-faux perpendiculairement à l’extrémité du labrum en tournant soigneusement et manuellement le manipulateur (Figure 6A).
6. En utilisant les degrés de liberté du manipulateur, déplacez lentement le porte-à-faux sans pointe dans les directions XY de sorte que la colle sur le porte-à-faux entre en contact avec l’extrémité coupée de l’extrémité du labrum (Figure 6B).
7. Durcissez l’époxy, en solidifiant l’intersection entre le cantilever et le labrum des moustiques.
8. Une fois que l’époxy a durci, engagez doucement le manipulateur dans les directions XY et éloignez le cantilever de la pince à épiler, en vérifiant que la pointe du labrum repose maintenant sur la poutre en porte-à-faux sans pointe (Figure 6C).

Résultats

Des images de microscopie électronique à balayage (MEB) de la sonde AFM bio-hybride fabriquée se trouvent à la figure 7. L’extrémité du labrum a été collée avec succès à la poutre en porte-à-faux sans pointe. En raison de la courbure naturelle des dards de moustiques et du fonctionnement manuel du protocole présenté, il est extrêmement difficile d’obtenir un cantilever avec une pointe de dard parfaitement perpendiculaire au cantilever. L’angle décentré entre le dard et...

Discussion

L’étape 1 du protocole vise à nettoyer l’échantillon biologique du labium indésirable. Pour ce faire, une incision est pratiquée sur le labium, mais pas sur le fascicule, qui repose directement sous le labium (Figure 1). Parce que le faisceau et le labium ne sont pas joints à leur interface (c’est-à-dire que le labium est libre de glisser le long du fascicule et n’est maintenu en place que par sa fixation à la tête du moustique), l’incision réalisée est destinée à sép...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-SA-SE Straight Tapered Ultra Fine-Pointed Tweezers	Excelta	N/A	For manipulating/dissecting the proboscis.
C-4D Probe station	Everbeing Int’l Corp	N/A	Used for AFM assembly.
Tipless Tapping Mode Cantilever	NanoAndMore USA	TL-NCH	AFM cantilever used for mounting the labrum. Specs are shown here: Shape: Beam Force Constant: 42 N/m (10 - 130 N/m) Resonance Frequency: 330 kHz (204 - 497 kHz) Length: 125 µm (115 - 135 µm) Width: 30 µm (22.5 - 37.5 µm) Thickness: 4 µm ( 3 - 5 µm)
UV Expoxy	Let's resin	ALR00146	For stinger attachment.